陳華 林晨韜 陳曦 葛均青

摘要：【目的】實(shí)現(xiàn)斑馬魚g型溶菌酶在大腸桿菌中表達(dá)，以獲得高純度且具溶菌活性的融合蛋白，為探究g型溶菌酶在斑馬魚抗菌過程中的作用機(jī)制及其開發(fā)利用打下基礎(chǔ)?！痉椒ā客ㄟ^ClustalW、ExPASy、SignalP-5.0 Server及PSIPRED等在線軟件對(duì)斑馬魚g型溶菌酶進(jìn)行生物信息分析，經(jīng)密碼子優(yōu)化后合成斑馬魚g型溶菌酶基因，亞克隆至pET-28a（+）表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，以IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，并通過非干擾型蛋白濃度測定試劑盒和溶菌酶測定試劑盒（比濁法）測定其濃度及溶菌活性。【結(jié)果】從GenBank檢索獲得的斑馬魚溶菌酶基因g1（NM_001002706.1）和g2（XM_002664371.5）分別命名為Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2。Zeb-Lys-g1基因開放閱讀框（ORF）長591 bp，共編碼196個(gè)氨基酸殘基，其編碼蛋白分子量約21.6 kD;Zeb-Lys-g2的ORF長576 bp，共編碼191個(gè)氨基酸殘基，其編碼蛋白分子量約21.1 kD;2種斑馬魚g型溶菌酶序列中均含有2個(gè)半胱氨酸殘基及3個(gè)保守的催化殘基位點(diǎn)（Glu、Asp和Asp）。Zeb-Lys-g1的N端含有17個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，而Zeb-Lys-g2不存在典型的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)，但其三級(jí)結(jié)構(gòu)均具有多個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)。在基于溶菌酶序列相似性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹中，Zeb-Lys-g1序列與金魚g型溶菌酶序列的親緣關(guān)系最近，而Zeb-Lys-g2序列與鱸形目和鰈形目魚類的g型溶菌酶序列親緣關(guān)系較近。將合成的斑馬魚 g型溶菌酶基因（Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2）亞克隆至pET-28a（+）表達(dá)載體并轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，20 ℃下經(jīng)IPTG（終濃度0.5 mmol/L）誘導(dǎo)16 h，可獲得融合蛋白Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2，純化后的濃度分別為1.01和1.66 mg/mL，對(duì)應(yīng)的溶菌活性分別為689.68和44.39 U/mg?！窘Y(jié)論】魚類g型溶菌酶的基因變異較保守，經(jīng)密碼子優(yōu)化及全基因合成方式合成的斑馬魚g型溶菌酶基因Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2可通過原核表達(dá)獲得高純度、高溶菌活性的融合蛋白，為探究斑馬魚溶菌酶的抗菌機(jī)制提供了技術(shù)支持。

關(guān)鍵詞： 斑馬魚;g型溶菌酶;序列特征;原核表達(dá);溶菌活性

中圖分類號(hào)： S965.819? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2022）01-0229-09

Sequence analysis and prokaryotic expression of zebrafish

g-type lysozyme gene

CHEN Hua1， LIN Chen-tao2， CHEN Xi1， GE Jun-qing1*

（1Institute of Biotechnology，F(xiàn)ujian Academy of Agricultural Sciences，F(xiàn)uzhou? 350003， China; 2College of Life Sciences， Fujian Normal University/Center of Engineering Technology Research for Microalgae Germplasm Improvement of Fujian， Southern Institute of Oceanography/Fujian Key Laboratory of Special

Marine Bio-resources Sustainable Utilization， Fuzhou? 350117， China）

Abstract：【Objective】Zebrafish g-type lysozyme was expressed in Escherichia coli to obtain a fusion protein with high purity and bacteriolytic activity， which laid a foundation for the further study of? antibacterial function and application of zebrafish g-type lysozyme. 【Method】 The biological information of g-type lysozyme gene of zebrafish was analyzed by online softwares such as ClustalW， ExPASy， SignalP-5.0 Server and PSIPRED. After coding codon optimization， g-type lysozyme gene of zebrafish was synthesized， respectively， and cloned into expression vector pET-28a（+）. The constructed plasmids were transformed into competent cells of E. coli BL21（DE3）. Then induced with IPTG to express the g-type lysozyme， whichwas used to determine its concentration and bacteriolytic activity by non-interference protein concentration determination kit and lysozyme determination kit（turbidimetry）. 【Result】Zebrafish lysozyme genes g1 （NM_001002706.1） and g2 （XM_002664371.5） retrieved from GenBank were named Zeb-lys-g1 and Zeb-lys-g2， respectively. The open reading frame （ORF） of Zeb-lys-g1 gene was 591 bp in length and encoded 196 amino acid residues， with predicted molecular weight of 21.6 kD. The ORF of Zeb-lys-g2 was 576 bp in length and encoded 191 amino acid residues， with predicted molecular weight of 21.1 kD. The two zebrafish g-type lysozyme genes both had two cysteine residues and three conserved catalytic residues （Glu， Asp and Asp）. Zeb-lys-g1 contained 17 amino acid signal peptide at N-terminal， while Zeb-lys-g2 had no signal peptide， but its tertiary structure had multiple α-Spiral structure. In the phylogenetic tree constructed based on the similarity of lysozyme sequence， Zeb-lys-g1 sequence was the closest to the g-type lysozyme sequence of goldfish， while Zeb-lys-g2 sequence was closer to the g-type lysozyme sequence of perch and flounder. Zebrafish g-type lysozyme genes（Zeb-lys-g1 and Zeb-lys-g2） were subcloned intoexpression vector pET-28a（+） and transferred into competent cells of BL21（DE3）. The fusion proteins Zeb-lys-g1 and Zeb-lys-g2 were obtained after induction by IPTG （final concentration 0.5 mmol/L） at 20 ℃ for 16 h. The purified concentrations were 1.01 and 1.66 mg/mL respectively， and the corresponding lysozyme activities were 689.68 and 44.39 U/mg， respectively. 【Conclusion】The gene variation of fish g-lysozyme is relatively conservative. Zebrafish g-lysozyme genes zeb-lys-g1 and zeb-lys-g2 are synthesized by codon optimization and whole gene synthesis ，which cab obtain fusion proteins with high purity and high bacteriolytic activity through prokaryotic expression， which provides technical support for exploring the antibacterial mechanism of zebrafish lysozyme.

Key words： zebrafish; g-type lysozyme; sequence characters; prokaryotic expression; bacteriolytic activity

Foundation items：Basal Research Projects for Public-interest Scientific Institutions of Fujian（2020R1027005）; Free Exploration of Scientific and Technological Innovation Project of Fujian Academy of Agricultural Science（ZYTS2019013）;“5511”Collaborative Innovation Project of Fujian Academy of Agricultural Sciences（XTCXGC2021013）;Foreign Coo-peration Project of Fujian Academy of Agricultural Sciences（DEC201918）

0 引言

【研究意義】溶菌酶（Lysozyme）又稱N-乙酰胞壁酸水解酶，可通過破壞細(xì)胞壁中肽聚糖的1，4-糖苷鍵，導(dǎo)致細(xì)菌細(xì)胞壁破裂而使細(xì)菌溶解。根據(jù)來源、結(jié)構(gòu)及理化性質(zhì)的不同，可將溶菌酶分為雞蛋清溶菌酶（Chicken-type lysozyme，c型）、鵝溶菌酶（Goose-type lysozyme，g型）、無脊椎動(dòng)物溶菌酶（Invertebrate-type lysozyme，i型）、細(xì)菌溶菌酶、植物溶菌酶和噬菌體溶菌酶（P型）6種類型，其中，c型、g 型及i 型溶菌酶屬于動(dòng)物性溶菌酶，廣泛存在于動(dòng)物的免疫器官和免疫細(xì)胞中（張士璀和許娜，2014;邱本丹，2016）。溶菌酶作為魚類重要的非特異性免疫因子，與魚類抵御細(xì)菌感染的免疫力密切相關(guān)（Ponce et al.，2011;Zhang et al.，2018;何樂等，2019）。研究表明，多數(shù)魚類體內(nèi)同時(shí)存在c型和g型2種溶菌酶，而不同類型的溶菌酶其結(jié)構(gòu)特征和理化性質(zhì)不同，在組織內(nèi)的分布也存在差異（邱本丹，2016）。因此，探析斑馬魚g型溶菌酶基因序列特征并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，可為揭示g型溶菌酶在斑馬魚抗菌過程中的作用機(jī)制及其開發(fā)利用打下基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】溶菌酶可誘導(dǎo)硬骨魚類的特異性和非特異性免疫應(yīng)答，提高機(jī)體免疫力，具有抗菌、抗病毒和抗炎癥等特性，是一種天然的內(nèi)源性抗生素（Shakoori et al.，2019）。魚類溶菌酶主要有c型和g型，且在多數(shù)魚類體內(nèi)同時(shí)存在，包括草魚（Ctenopharyngodon idella）（Wang et al.，2016）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）（姚佳俊，2017）、長豐鯽（Carassius auratus gibelio）（姚佳俊，2017）和牙鲆（Paralichthys olivaceus）（劉然然，2018）等。目前，針對(duì)魚類溶菌酶的研究主要集中在c型，僅有幾種重要經(jīng)濟(jì)魚類g型溶菌酶的相關(guān)報(bào)道，如團(tuán)頭魴（Megahbrama amblycephala）（章瓊等，2015）、大黃魚（Larimichthys crocea）（邱本丹，2016）、淇河鯽（C. auratus）（Wang et al.，2016）及達(dá)氏鱘（Acipenser dabryanus）（Zhang et al.，2018）等。此外，部分經(jīng)濟(jì)魚類的g型溶菌酶已被成功表達(dá)。Ye等（2010）采用原核表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)出草魚g型溶菌酶，并證實(shí)其具有溶菌活性，但與草魚c型溶菌酶在免疫防御功能上存在明顯差異;徐瑋（2015）從七鰓鰻（Lampetra japonica）中克隆獲得g型溶菌酶基因cDNA序列，經(jīng)脂多糖（LPS）體內(nèi)刺激后g型溶菌酶在生殖腺中的表達(dá)量顯著升高，且通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)重組酶能使溶壁微球菌破裂;楊勇等（2017）通過構(gòu)建真核表達(dá)載體，在內(nèi)皮祖細(xì)胞（EPCs）中成功表達(dá)出日本鰻鱺（Anguilla japonica） c型溶菌酶，并證實(shí)其對(duì)溶壁微球菌有明顯的生長抑制作用。斑馬魚（Danio rerio）是脊椎動(dòng)物研究中應(yīng)用最廣泛的模式動(dòng)物之一，由于不同種類的病原菌均能感染斑馬魚及其胚胎（單穎，2016;馮鵬霏等，2021），因此成為研究魚類病原菌感染免疫應(yīng)答的理想模型（Rakus et al.，2019），目前已建立多種斑馬魚—細(xì)菌感染模型，包括遲鈍愛德華氏菌（Edwardsiella tarda）、鏈球菌（Streptococcus）、殺鮭氣單胞菌（Aeromonas salmonicida）、柱狀黃桿菌（Flavobacterium cloumnare）及海分枝桿菌（Mycobacterium ma-rinum）等（單穎，2016）。本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)，創(chuàng)傷弧菌（Vibrio vulnificus）感染斑馬魚后其腎臟中的溶菌酶表達(dá)量極顯著升高，故推測溶菌酶在斑馬魚抵御創(chuàng)傷弧菌過程中發(fā)揮了重要作用（陳華等，2018;Chen et al.，2020）?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】斑馬魚體內(nèi)同時(shí)存在c型和g型溶菌酶（Jiménez-Cantizano et al.，2008），且母源性溶菌酶在斑馬魚胚胎抗菌過程中扮演著重要角色。雖然Liu和Wen（2015）從斑馬魚頭腎中成功克隆出c型溶菌酶，并證實(shí)其在斑馬魚巨噬細(xì)胞系中特異表達(dá)，但至今鮮見針對(duì)斑馬魚g型溶菌酶的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】對(duì)斑馬魚g型溶菌酶氨基酸序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過優(yōu)化密碼子篩選蛋白誘導(dǎo)表達(dá)條件，實(shí)現(xiàn)斑馬魚g型溶菌酶在大腸桿菌中表達(dá)，以獲得高純度且具溶菌活性的融合蛋白，為探究g型溶菌酶在斑馬魚抗菌過程中的作用機(jī)制及其開發(fā)利用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

pET-28a表達(dá)載體和大腸桿菌（Escherichia coli）BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞由福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所保存提供。pMD18-T載體、Premix Taq DNA聚合酶及QuickCutTM BamH I/Xho I購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，非干擾型蛋白質(zhì)濃度測定試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司，溶菌酶測定試劑盒購自南京建成科技有限公司。

1. 2 溶菌酶序列生物信息學(xué)分析

利用ClustalW（https：//www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalw2/）對(duì)從NCBI檢索斑馬魚g型溶菌酶氨基酸序列Zeb-Lys-g1（NM_001002706.1）和Zeb-Lys-g2（XM_002664371.5）進(jìn)行比對(duì);采用ExPASy（https：//web.expasy.org/protparam/）預(yù)測蛋白理化性質(zhì);運(yùn)用CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）分析目的蛋白保守功能域;利用SignalP-5.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/）預(yù)測蛋白信號(hào)肽;采用PSIPRED（http：//bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/）預(yù)測蛋白親/疏水性;利用SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）預(yù)測蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)，以PredictProtein（https：//predictprotein.org/）分析其二硫鍵;運(yùn)用DNAMAN進(jìn)行氨基酸序列比對(duì)分析，并通過MEGA 4.0的鄰接法（Neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，設(shè)Bootstrap為1000次。

1. 3 斑馬魚g型溶菌酶基因密碼子優(yōu)化

按照大腸桿菌密碼子偏好性和避免重復(fù)序列的原則，在不改變氨基酸序列的前提下，去除信號(hào)肽序列后利用密碼子優(yōu)化軟件對(duì)其基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化。同時(shí)，根據(jù)密碼子優(yōu)化后的斑馬魚g型溶菌酶基因（Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2）設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物（表1），并在5'端引入BamH I酶切位點(diǎn)、3'端引入Xho I酶切位點(diǎn)（下劃線部分）。密碼子優(yōu)化后的斑馬魚 g型溶菌酶基因擴(kuò)增引物委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1. 4 溶菌酶基因表達(dá)載體構(gòu)建

以合成的斑馬魚g型溶菌酶基因序列Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2為模板，采用上述引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，純化回收擴(kuò)增產(chǎn)物，利用BamH I/Xho I對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物和pET-28a（+）表達(dá)載體進(jìn)行雙酶切，酶切后的片段經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳分離，分別割膠回收目的條帶，并進(jìn)行雙酶切鑒定。用T4連接酶連接后，轉(zhuǎn)化TOP10感受態(tài)細(xì)胞，挑選陽性克隆提取質(zhì)粒，將酶切驗(yàn)證呈陽性的重組質(zhì)粒送至生工生物工程（上海）股份有限公司測序，構(gòu)建成功的重組質(zhì)粒分別命名為pET-Zeb-Lys-g1和pET-Zeb-Lys-g2。

1. 5 溶菌酶誘導(dǎo)表達(dá)與純化

通過熱激法將重組質(zhì)粒pET-Zeb-Lys-g1和pET-Zeb-Lys-g2分別轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，挑取單菌落接種至含50 μg/mL卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，當(dāng)OD達(dá)0.6時(shí)，添加IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，在不同溫度下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。離心收集菌體，加入咪唑緩沖液進(jìn)行重懸，超聲波破碎后收集上清液（粗蛋白）。取5 mL Ni-NTA，以5倍柱床體積的Binding Buffer清洗平衡柱，流速5 mL/min。上清液與平衡的柱填料孵育1 h后上柱，以尿素緩沖液清洗平衡柱，再以含尿素的咪唑緩沖液洗柱子并進(jìn)行洗脫，收集流出液。對(duì)純化的蛋白進(jìn)行透析和濃縮，采用SDS-PAGE電泳進(jìn)行驗(yàn)證，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1. 6 純化斑馬魚g型溶菌酶蛋白濃度測定及活性分析

根據(jù)非干擾型蛋白濃度測定試劑盒說明測定純化后的斑馬魚g型溶菌酶融合蛋白（Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2）濃度;同時(shí)采用溶菌酶測定試劑盒（比濁法）測定復(fù)性溶菌酶的溶菌活性，具體操作步驟如下：取4個(gè)離心管分別加入30.0 μL雙蒸水、溶菌酶標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液、純化融合蛋白Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g1，各管中加入300.0 μL應(yīng)用菌液，混勻后置于37 ℃水浴中孵育15 min，取出置于冰水浴中3 min，然后轉(zhuǎn)移至96孔細(xì)胞板中，采用酶標(biāo)儀測定530 nm處的透光度T15，計(jì)算溶菌酶活性。

2 結(jié)果與分析

2. 1 斑馬魚g型溶菌酶序列特征分析結(jié)果

從GenBank檢索斑馬魚溶菌酶基因g1（NM_001002706.1）和g2（XM_002664371.5）的開放閱讀框（ORF）序列，分別命名為Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2。Zeb-Lys-g1基因ORF長591 bp，共編碼196個(gè)氨基酸殘基（圖1-A）;其編碼蛋白分子量約21.6 kD，包含3個(gè)保守的催化位點(diǎn)，分別為Glu（84E）、Asp（97D）和Asp（108D）;有11個(gè)糖結(jié)合位點(diǎn)，分別為Glu（84E）、Gln（106Q）、Val（107V）、Asp（108D）、Tyr（111Y）、His（112H）、Ile（130I）、Tyr（134Y）、Tyr（158Y）、Asn（159N）和Gly（161G）;有2個(gè)半胱氨酸殘基，分別為Cys（14C）和Cys（150C）。Zeb-lys-g2基因ORF長576 bp，共編碼191個(gè)氨基酸殘基（圖1-B）;其編碼蛋白分子量約21.1 kD，包含3個(gè)保守的催化位點(diǎn)，分別為Glu（75E）、Asp（88D）和Asp（99D）;有11個(gè)糖結(jié)合位點(diǎn)，分別為Glu（75E）、Gln（97Q）、Val（98V）、Asp（99D）、Tyr（102Y）、His（103H）、Ile（121I）、Phe（125F）、Tyr（149Y）、Asn（150N）和Gly（152G）;有2個(gè)半胱氨酸殘基，分別為Cys（52C）和Cys（141C）。蛋白保守功能結(jié)構(gòu)域預(yù)測發(fā)現(xiàn)，Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2均含有g(shù)型溶菌酶的鵝蛋清溶菌酶（GEWL）結(jié)構(gòu)域、可溶性裂解轉(zhuǎn)糖苷酶（SLT）結(jié)構(gòu)域和裂解轉(zhuǎn)糖苷酶（LT）催化結(jié)構(gòu)域。SignalP-5.0信號(hào)肽預(yù)測結(jié)果顯示，Zeb-Lys-g1的N端含有17個(gè)氨基酸的信號(hào)肽，其剪切位點(diǎn)可能位于第 17～18位氨基酸之間（圖2-A）;而Zeb-Lys-g2不存在典型的信號(hào)肽結(jié)構(gòu)（圖2-B）。

2. 2 斑馬魚g型溶菌酶結(jié)構(gòu)特征分析結(jié)果

氨基酸排列方式及其親/疏水性直接影響蛋白的空間結(jié)構(gòu)，進(jìn)而決定蛋白的理化性質(zhì)和功能。Zeb-lys-g1氨基酸酸堿性及親/疏水性預(yù)測結(jié)果（圖3-A）顯示：酸性氨基酸23個(gè)（占12.73%），出現(xiàn)頻率為11.73%;堿性氨基酸28個(gè)（占17.05%），出現(xiàn)頻率為14.29%;極性氨基酸43個(gè)（占23.21%），出現(xiàn)頻率為21.94%;疏水性氨基酸68個(gè)（占33.05%），出現(xiàn)頻率為34.69%。Zeb-lys-g1二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋（Alpha helix）占42.35%、β-折疊（Extended strand）占26.53%、無規(guī)則卷曲（Random coil）占31.12%;其三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，Zeb-lys-g1具有多個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)（圖4-A）。

Zeb-lys-g2氨基酸酸堿性及親/疏水性預(yù)測結(jié)果（圖3-B）顯示：酸性氨基酸27個(gè)（占15.26%），出現(xiàn)頻率為14.14%;堿性氨基酸29個(gè)（占18.17%），出現(xiàn)頻率為15.18%;極性氨基酸39個(gè)（占20.85%），出現(xiàn)頻率為20.42%;疏水性氨基酸67個(gè)（占33.69%），出現(xiàn)頻率為35.08%。Zeb-lys-g2二級(jí)結(jié)構(gòu)中α-螺旋占43.46%、β-折疊占18.85 %、無規(guī)則卷曲占37.70%;其三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，Zeb-Lys-g2也具有多個(gè)α-螺旋結(jié)構(gòu)（圖4-B）。

2. 3 斑馬魚g型溶菌酶的系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果

將Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2與其他28種不同物種的g型溶菌酶進(jìn)行多序列比對(duì)，并采用NJ法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，結(jié)果（圖5）顯示，Zeb-Lys-g1序列與鯉科金魚（C. auratus）g型溶菌酶序列的親緣關(guān)系最近，其次是與鮰科藍(lán)色鯰魚（Ictalurus furcatus）和斑點(diǎn)叉尾鮰（I. punctatus）的g型溶菌酶序列;Zeb-Lys-g2序列則與鱸形目和鰈形目魚類的g型溶菌酶序列親緣關(guān)系較近，與鳥類和爬行類動(dòng)物的g型溶菌酶序列親緣關(guān)系也相對(duì)較近;而哺乳動(dòng)物、節(jié)肢動(dòng)物和軟體動(dòng)物的g型溶菌酶聚于另一進(jìn)化分支。

2. 4 斑馬魚g型溶菌酶基因密碼子優(yōu)化結(jié)果

按照大腸桿菌的密碼子偏好性和避免重復(fù)序列的原則，在不改變編碼氨基酸序列的情況下對(duì)斑馬魚g型溶菌酶基因（Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2）序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化，優(yōu)化前后的基因核苷酸序列序列如圖6所示。

2. 5 斑馬魚g型溶菌酶基因表達(dá)載體構(gòu)建

以合成的Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2基因?yàn)槟０暹M(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果（圖7）顯示均擴(kuò)增出大小約500 bp的特異性條帶，與預(yù)期結(jié)果相符。利用BamH I/Xho I對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切，回收溶菌酶基因片段，與pET-28a（+）表達(dá)載體連接，獲得的重組質(zhì)粒以BamH I/Xho I進(jìn)行雙酶切鑒定，結(jié)果均獲得與預(yù)期結(jié)果一致的特異性條帶（圖8）。測序驗(yàn)證結(jié)果表明，已成功構(gòu)建獲得重組質(zhì)粒pET-Zeb-Lys-g1和pET-Zeb-Lys-g2。

2. 6 斑馬魚g型溶菌酶在大腸桿菌中的表達(dá)情況

將重組質(zhì)粒pET-Zeb-Lys-g1和pET-Zeb-Lys-g2分別轉(zhuǎn)化BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，在20 ℃下以IPTG誘導(dǎo)表達(dá)16 h，經(jīng)純化、透析和濃縮后進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。結(jié)果（圖9）顯示，以重組質(zhì)粒pET-Zeb-Lys-g1和pET-Zeb-Lys-g2轉(zhuǎn)化的BL21感受態(tài)細(xì)胞分別在24.2和25.5 kD處出現(xiàn)特異性條帶，表明可通過大腸桿菌體外誘導(dǎo)表達(dá)獲得融合蛋白Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2。

2. 7 純化融合蛋白濃度及落菌活性分析結(jié)果

依據(jù)非干擾型蛋白濃度測定試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到融合蛋白濃度線性方程為：y= -217.91x+193.24（R2=0.9913），測得純化的融合蛋白Zeb-Lys-g1濃度為1.01 mg/mL，Zeb-Lys-g2濃度為1.66 mg/mL。進(jìn)一步利用溶菌酶測定試劑盒測定重組斑馬魚g型溶菌酶的溶菌活性，結(jié)果顯示Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2的溶菌活性分別為689.68和44.39 U/mg，表明已成功原核表達(dá)獲得具較高溶菌活性的斑馬魚g型溶菌酶，但二者的溶菌活性差異明顯，可能與其功能作用相關(guān)。

3 討論

魚類溶菌酶較陸生動(dòng)物溶菌酶具有更廣的抗菌譜，能溶解革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌（朱站英，2012），在水生動(dòng)物病害防治中具有良好的應(yīng)用前景。鵝蛋清溶菌酶是g型溶菌酶的典型代表，具有3個(gè)酶活性位點(diǎn)，分別為73Glu、86Asp和97Asp（楊勇等，2017）。本研究結(jié)果表明，斑馬魚g型溶菌酶結(jié)構(gòu)域中也含有這3個(gè)保守的活性催化位點(diǎn)，即Zeb-Lys-g1的Glu（84E）、Asp（97D）、Asp（108D）和Zeb-Lys-g2的Glu（75E）、Asp（88D）、Asp（99D），與歐洲鰻鱺（A. anguilla）、大黃魚、金魚等魚類的g型溶菌酶（王美娟等，2014;邱本丹，2016）一致，但各自所在的位置不同。也有部分魚類g型溶菌酶僅存在2個(gè)保守的催化位點(diǎn)，如日本鰻鱺缺失Asp（86D）催化位點(diǎn)（楊勇等，2017）。此外，斑馬魚g型溶菌酶（Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2）氨基酸序列與多數(shù)經(jīng)濟(jì)魚類的g型溶菌酶氨基酸序列具有較高的相似性，故推測魚類g型溶菌酶結(jié)構(gòu)域中的第1位Glu和第3位Asp殘基可能是其發(fā)揮抗菌作用的特殊結(jié)構(gòu)。

半胱氨酸（Cys）殘基是形成二硫鍵的必要條件，而二硫鍵的存在有助于維持溶菌酶結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性，從而增強(qiáng)魚類對(duì)環(huán)境改變的適應(yīng)性（劉然然，2018）。已有研究表明，魚類c型溶菌酶中存在8個(gè)Cys殘基，可形成4對(duì)二硫鍵（邱本丹，2016）;但g型溶菌酶中的Cys殘基數(shù)量較少，大西洋鮭魚g型溶菌酶中僅存在3個(gè)Cys殘基（邱本丹，2016），日本鰻鱺和大菱鲆等僅存在2個(gè)Cys殘基（Zhao et al.，2011;楊勇等，2017），大黃魚僅有1個(gè)Cys殘基（邱本丹，2016），鯉和條石鯛中不存在Cys殘基（Savan et al.，2003;Whang et al.，2011）。本研究中，2種斑馬魚g型溶菌酶序列中均含有2個(gè)Cys殘基，但并未形成二硫鍵，可能是由于這2個(gè)Cys殘基沒有在形成二硫鍵的正確位置上，故推測魚類g型溶菌酶還存在其他結(jié)構(gòu)穩(wěn)定機(jī)制。

多數(shù)魚類的c型溶菌酶因存在N端信號(hào)肽，被認(rèn)為是一種分泌型蛋白（Wang et al.，2016）;但魚類 g型溶菌酶無信號(hào)肽，無法通過分泌途徑進(jìn)行分泌，故推測是一種胞內(nèi)蛋白（朱站英，2012;王美娟等，2014）。系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié)果顯示，魚類g型溶菌酶較保守，多數(shù)魚類僅含有1種g型溶菌酶，而斑馬魚存在2種g型溶菌酶，且溶菌酶Zeb-Lys-g1存在N端信號(hào)肽，說明這2種g型溶菌酶可能具有不同的分子功能，但具體的溶菌活性差異及其作用機(jī)制有待進(jìn)一步探究。本研究的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹顯示，Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2均優(yōu)先與經(jīng)濟(jì)魚類的g型溶菌酶聚為一支，且相似性在90.0%以上，說明在生物進(jìn)化過程中魚類g型溶菌酶的基因變異較保守，也進(jìn)一步證實(shí)斑馬魚溶菌酶與大部分經(jīng)濟(jì)魚類溶菌酶的親緣關(guān)系較近。

本研究通過原核表達(dá)載體成功誘導(dǎo)表達(dá)獲得斑馬魚g型溶菌酶的融合蛋白Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2，并對(duì)其溶菌活性進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)獲得的2種融合蛋白均具備溶菌活性，為以溶菌酶作為動(dòng)物養(yǎng)殖替抗物的開發(fā)與應(yīng)用打下了基礎(chǔ)，但今后還需以創(chuàng)傷弧菌、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydro-phila）、鰻弧菌（V. anguillarum）、愛德華氏菌（Edwar-dsiella）及羅非魚無乳鏈球菌（Streptococcus agalactiae）等主要魚源致病菌作為指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)，通過比濁法或掃描電鏡等驗(yàn)證Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2對(duì)不同病原菌的抑菌效果，系統(tǒng)探索魚類g型溶菌酶的抗菌機(jī)制。

4 結(jié)論

魚類g型溶菌酶的基因變異較保守，經(jīng)密碼子優(yōu)化及全基因合成方式合成的斑馬魚g型溶菌酶基因Zeb-Lys-g1和Zeb-Lys-g2可通過原核表達(dá)獲得高純度、高溶菌活性的融合蛋白，為探究斑馬魚溶菌酶的抗菌機(jī)制提供了技術(shù)支持。

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（責(zé)任編輯 蘭宗寶）