蘇靜華，焦 婷，韓 寧，蘇靜克，黨瑞杰，李 琳，張海松

糖尿病腎病(diabetic nephropathy, DN)是糖尿病常見(jiàn)的微血管并發(fā)癥之一，30%～40%的糖尿病患者可出現(xiàn)腎臟損害。蛋白尿是DN主要的臨床表現(xiàn)，是由腎小球?yàn)V過(guò)屏障損害造成的。腎小球?yàn)V過(guò)屏障包括內(nèi)皮細(xì)胞、基底膜和足細(xì)胞，而足細(xì)胞對(duì)于維持腎小球?yàn)V過(guò)屏障的完整性至關(guān)重要。足細(xì)胞相關(guān)蛋白，如Nephrin、podocin等，構(gòu)成了腎小球?yàn)V過(guò)屏障的分子篩，是保障濾過(guò)功能的重要分子屏障。這些足細(xì)胞相關(guān)蛋白的異常會(huì)損害過(guò)濾屏障結(jié)構(gòu)的完整性和穩(wěn)定性，從而引起蛋白尿。細(xì)胞凋亡是足細(xì)胞數(shù)量減少的主要原因，而且足細(xì)胞是終末分化細(xì)胞，不能再生。因此，抑制高糖環(huán)境誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡是防治DN的重要手段。

大麻二酚(cannabidiol, CBD)是無(wú)精神活性的天然大麻素類提取物，具有抗炎、鎮(zhèn)痛、改善睡眠和抗腫瘤等多種生物學(xué)效應(yīng)。最近，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，CBD能抑制誘導(dǎo)糖尿病心肌病變的細(xì)胞死亡信號(hào)，CBD干預(yù)有助于降低1型糖尿病小鼠胰腺早期炎性反應(yīng)，CBD能緩解高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷。但是，CBD能否抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡尚不清楚。本研究以小鼠腎臟足細(xì)胞系MPC5為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，探討CBD對(duì)高糖環(huán)境中MPC5細(xì)胞凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑與儀器 小鼠腎臟足細(xì)胞系MPC5，購(gòu)自北京北納創(chuàng)聯(lián)生物；1640培養(yǎng)液、胎牛血清(美國(guó)Gibco)；CBD(云南漢木森生物)；CCK-8檢測(cè)試劑盒(上海碧云天生物)；BCA(bicinchoninic acid)測(cè)定試劑盒(中國(guó)博邁德)；FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒(美國(guó)BD)；預(yù)制膠電泳液(中國(guó)索萊寶)；PVDF(polyvinylidene fluoride)膜(美國(guó)Millipore)；脫脂奶粉(美國(guó)BD)；兔抗小鼠Nephrin抗體(稀釋比例1∶1000，武漢博士德)；Bax、Bcl-2抗體(稀釋比例1∶1000，美國(guó)Cell Signaling Technology)；小鼠β-肌動(dòng)蛋白抗體(β-actin；稀釋比例1∶200，武漢博士德)。

Herocell 180型二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱(上海潤(rùn)度生物)；2104 Envision型多功能酶標(biāo)儀(美國(guó)PerkinElmer)；CytoFLEX 型流式細(xì)胞儀(美國(guó) Beckman Coulter)；DYY-8C型電泳儀(北京六一儀器廠)；FlourChem FC12型凝膠成像分析儀(美國(guó)Alpha)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 將MPC5細(xì)胞復(fù)蘇后，加入含10%胎牛血清和50 U/ml的γ-干擾素的1640培養(yǎng)液中培養(yǎng)(葡萄糖含量為5.5 mmol/L)，置于33 ℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中。當(dāng)細(xì)胞鋪滿瓶底面積的70%～80%時(shí)，去除培養(yǎng)液中的γ-干擾素，將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至37 ℃的二氧化碳培養(yǎng)箱中誘導(dǎo)分化1～2周。分化好的MPC5細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞增殖 將MPC5細(xì)胞接種到96孔板，分別加入30 mmol/L葡萄糖(high glucose, HG)和不同濃度的CBD(0.5、2.5、5 μM)。分別于接種后1～7 d，每天按照試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞增殖活性(每組3個(gè)復(fù)孔)：每孔中加入10 μl CCK-8液，避光孵育2 h，于波長(zhǎng)492 nm處檢測(cè)吸光度值(OD值)。因不同濃度的CBD可呈濃度依賴性地提高高糖環(huán)境中MPC5細(xì)胞的增殖活性且有飽和性。所以，后續(xù)實(shí)驗(yàn)采用2.5 μM作為CBD的干預(yù)濃度。

1.4 細(xì)胞凋亡 將MPC5細(xì)胞分為3組：對(duì)照組(Vehicle)、高糖組(30 mmol/L葡萄糖，HG)和CBD組(30 mmol/L葡萄糖+2.5 μM CBD)，各組細(xì)胞干預(yù)48 h后進(jìn)行檢測(cè)。收集各組細(xì)胞的單細(xì)胞懸液，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，分別混勻，于室溫下避光孵育10～15 min上機(jī)檢測(cè)。采用FlowJo 10.3軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析：左上象限(Q1)為細(xì)胞死亡百分比，右上象限(Q2)為晚期凋亡百分比，右下象限(Q3)為早期凋亡百分比，左下象限(Q4)為活細(xì)胞百分比，細(xì)胞凋亡率= Q2+Q3。

1.5 Western blot 細(xì)胞分組及處理時(shí)間同1.4細(xì)胞凋亡。取各組細(xì)胞，PBS緩沖液沖洗后加入細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞并提取總蛋白。取50 μg總蛋白上樣后，進(jìn)行電泳。然后在220 mA的條件下轉(zhuǎn)膜2 h，再室溫封閉2 h，分別滴加特異性一抗封閉過(guò)夜，再以辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗封閉2 h。最后，用化學(xué)發(fā)光劑染色、顯影并采用BandScan 5.0軟件分析膠片灰度。所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。

2 結(jié) 果

2.1 CBD對(duì)高糖環(huán)境中小鼠腎臟足細(xì)胞系MPC5增殖的影響 如表1所示，與Vehicle組相比，HG組MPC5細(xì)胞的增殖活性顯著降低(<0.05)，而不同濃度的CBD干預(yù)呈濃度依賴性地提高高糖環(huán)境中MPC5細(xì)胞的增殖活性。而且，2.5 μM CBD與5 μM CBD提高M(jìn)PC5細(xì)胞增殖活性的作用差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此，本研究采用2.5 μM作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的干預(yù)濃度。

2.2 CBD對(duì)高糖環(huán)境中小鼠腎臟足細(xì)胞系MPC5細(xì)胞凋亡的影響 如圖1所示，與Vehicle組相比，HG組MPC5細(xì)胞的凋亡比例顯著增加[(25.27±2.15)%(8.43±0.70)%;<0.05]，而CBD干預(yù)能明顯降低MPC5細(xì)胞的凋亡比例，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(12.83±1.05)%(25.27±2.15)%;<0.05]。

2.3 CBD對(duì)高糖環(huán)境中小鼠腎臟足細(xì)胞系MPC5細(xì)胞Nephrin及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 如圖2和圖3所示，與Vehicle組相比，HG組MPC5細(xì)胞的裂孔膜蛋白Nephrin蛋白表達(dá)顯著降低，而CBD干預(yù)能明顯升高M(jìn)PC5細(xì)胞Nephrin蛋白的表達(dá)(<0.05)。而且， HG組促凋亡蛋白Bax與抗凋亡蛋白Bcl-2的蛋白表達(dá)比升高，與Vehicle組相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(<0.05)；而CBD干預(yù)能顯著降低高糖環(huán)境中MPC5細(xì)胞促凋亡蛋白Bax與抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表達(dá)比(<0.05)。

3 討 論

本研究以高糖環(huán)境中的小鼠腎臟足細(xì)胞系MPC5為研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)CBD能促進(jìn)高糖環(huán)境中MPC5增殖，降低高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞凋亡率并降低促凋亡蛋白Bax與抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)比，還能促進(jìn)裂孔膜蛋白Nephrin蛋白表達(dá)。

足細(xì)胞凋亡在DN發(fā)病過(guò)程中發(fā)揮重要作用。高糖環(huán)境中，活性氧產(chǎn)量增加，進(jìn)而激活p38 MAPK信號(hào)途徑促進(jìn)足細(xì)胞凋亡。而且，糖基化終末產(chǎn)物也能通過(guò)激活FOXO4的轉(zhuǎn)錄表達(dá)促進(jìn)足細(xì)胞凋亡。本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境可誘導(dǎo)足細(xì)胞系MPC5細(xì)胞凋亡。在生理狀態(tài)下，細(xì)胞同時(shí)接受促凋亡信號(hào)和抗凋亡信號(hào)的刺激，只有這兩種信號(hào)處于動(dòng)態(tài)平衡狀態(tài)，內(nèi)環(huán)境才能保持穩(wěn)定。本研究發(fā)現(xiàn)，高糖環(huán)境中MPC5細(xì)胞促凋亡蛋白Bax的表達(dá)升高，同時(shí)抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)降低。Nephrin是表達(dá)于足細(xì)胞連接處的一種黏蛋白，構(gòu)成足細(xì)胞裂孔膜的關(guān)鍵成分，對(duì)于維持腎小球的濾過(guò)屏障功能具有重要作用。而且，Nephrin表達(dá)下降也是蛋白尿形成的重要原因。本研究發(fā)現(xiàn)，在高糖環(huán)境中，足細(xì)胞功能蛋白Nephrin的表達(dá)也發(fā)生了下調(diào)。

CBD是從植物大麻中提取的純天然成分，CBD主要通過(guò)兩種CBD受體CB1和CB2發(fā)揮胞內(nèi)作用。在生理狀態(tài)下，足細(xì)胞低表達(dá)CB1受體，高表達(dá)CB2受體。無(wú)論是1型糖尿病模型還是2型糖尿病模型中，足細(xì)胞均過(guò)表達(dá)CB1受體。與之相反，在人終末期DN病理標(biāo)本中，足細(xì)胞CB2受體的表達(dá)卻明顯下調(diào)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，CBD對(duì)DN具有潛在的保護(hù)作用。例如：CB1受體抑制藥利莫那班能預(yù)防肥胖ZDF大鼠蛋白尿產(chǎn)生，減少腎小球損傷，改善白蛋白肌酐比等。本研究發(fā)現(xiàn)，CBD對(duì)高糖環(huán)境中的足細(xì)胞具有直接的保護(hù)作用：(1)CBD干預(yù)緩解高糖對(duì)足細(xì)胞增殖的抑制作用；(2)CBD緩解高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡和促凋亡蛋白的表達(dá)并促進(jìn)抗凋亡蛋白的表達(dá)；(3)CBD能促進(jìn)高糖環(huán)境中足細(xì)胞功能蛋白Nephrin的表達(dá)。但是，CBD受體在CBD緩解高糖誘導(dǎo)的MPC5細(xì)胞凋亡中的作用本研究未進(jìn)一步探討，這是本文的一個(gè)局限。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)CBD可在體外抑制高糖誘導(dǎo)的小鼠足細(xì)胞系MPC5細(xì)胞凋亡，CBD有望被開(kāi)發(fā)成抑制高糖環(huán)境中足細(xì)胞凋亡并進(jìn)而緩解DN的一種潛在藥物。