袁琛凱，楊 俊，石 敏，周 楠，楊 昱，蔣林惠,*

1.南通市食品藥品監(jiān)督檢驗(yàn)中心 (南通 226000) 2.南通市中醫(yī)院 (南通 226000)

蜂蜜是蜜蜂采集植物花蜜、分泌物或蜜露，與自身分泌物結(jié)合后，經(jīng)巢脾轉(zhuǎn)化、脫水、儲存釀造形成的天然甜味劑[1]。蜂蜜中含有機(jī)酸、酶、黃酮等活性物質(zhì)，使得蜂蜜具有抗菌消炎、調(diào)節(jié)內(nèi)分泌紊亂等功效，是一種營養(yǎng)價值較高的保健食品和傳統(tǒng)中藥[2]。酚酸、黃酮是一種多酚類化合物，其中黃酮是一種常見的抗氧化成分，蜂蜜中的黃酮主要來源于植物花粉、花蜜和蜂膠[3]，有研究表明蜂蜜的抗氧化活性與其黃酮含量高低有關(guān)，因此黃酮含量逐漸成為評價蜂蜜質(zhì)量和區(qū)分蜜源的一項(xiàng)重要因素，隨著檢測技術(shù)的提高，將黃酮類化合物做為蜂蜜指標(biāo)成分進(jìn)行分析已成為鑒別蜂蜜真?zhèn)蔚闹匾侄蝃4]。

蜂蜜產(chǎn)量低、需求量大、價格較高，因此成為一些不法商販摻假制假的目標(biāo)，目前摻假蜂蜜占蜂蜜市場的20%～30%，有些地區(qū)高達(dá)50%左右[5]。而蜂蜜成分復(fù)雜、各組分含量差異大使得摻假相對容易，目前摻假蜂蜜的檢測主要針對外源性摻假物質(zhì)單一特征成分的分析[6]，鑒于蜂蜜的活性成分復(fù)雜，且現(xiàn)階段的活性成分并不全部明確，單一組分的質(zhì)量分析具有一定的局限性，而指紋圖譜的整體性和模糊性在蜂蜜質(zhì)量的判斷上更具科學(xué)性和全面性。

本研究通過對蜂蜜指標(biāo)成分的分析，結(jié)合色譜指紋圖譜及質(zhì)譜，建立一種高效準(zhǔn)確的蜂蜜質(zhì)量分析方法，實(shí)驗(yàn)收集若干批蜂蜜，經(jīng)過HLB固相萃取柱凈化，經(jīng)HPLC建立黃酮類成分指紋圖譜，并采用LC-MS對指紋圖譜色譜峰定性，為蜂蜜質(zhì)量評價提供數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

蜂蜜樣品：麥盧卡蜜(澳洲)、黑蜂蜜(吉林)、百花蜜1(湖南)、洋槐蜜(蘇州)、野山蜜(湖南)、百花蜜2(云南)；標(biāo)準(zhǔn)品：蘆丁Rutin(1ST1522-250 mg 阿爾塔)、槲皮素Quercetin(RMT12165-100 mg 曼哈格)、楊梅酮Myricetin(CDAA-28248-20 mg 安譜)、山奈酚Kaempferol(CDAA-280530-20 mg安譜)；試劑：甲醇/乙腈(MERCK LiChrosolv,色譜級),甲酸(阿拉丁,色譜級),乙酸銨(羅恩試劑,GR>99%)。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀/DAD-WR(安捷倫)；Vanquish F-TSQ ALTIS液質(zhì)聯(lián)用儀(賽默飛)；Milli Q超純水機(jī)(默克密理博)；poly-sery HLB固相萃取柱-200 mg/6mL(安譜)。

1.3 方法

1.3.1對照品溶液制備

稱取槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品，甲醇溶解，配置成濃度為1 000 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。

1.3.2樣品處理

稱取蜂蜜5 g(精確至0.01 g)至50 mL離心管，加入15 mL 0.01mol/L 鹽酸，渦旋振蕩1 min，超聲提取30 min，7 000 r/min離心5 min，取全部上清液到預(yù)處理好的HLB固相萃取柱(5 mL甲醇、10 mL 0.01 mol/L HCL活化)，10 mL水淋洗，真空泵抽干小柱，10 mL甲醇洗脫，洗脫液40 ℃氮吹近干，1 mL初始流動性復(fù)溶，過0.22 μm有機(jī)濾膜。

1.3.3指紋圖譜色譜條件

Thermo Acclaim 120 C18色譜柱(4.6mm×250mm,5μm)；洗脫條件為等度洗脫，A為0.3%甲酸水62%，B為乙腈38%；流速0.7 mL/min；柱溫35 ℃；進(jìn)樣體積20 μL；檢測波長350 nm。

1.3.4LC-MS質(zhì)譜條件

電離模式：電噴霧離子源ESI-Negative，多反應(yīng)監(jiān)測模式(MSM)；毛細(xì)管電壓為4.3 kV；離子傳輸管溫度為300 ℃；霧化溫度400 ℃；鞘氣1.67 L/min，輔助氣10.08 L/min；吹掃氣為0.8 L/min；碰撞氣壓力1.5 mTorr；柱溫35 ℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 蜂蜜HPLC指紋圖譜測定

2.1.1樣品提取方法的選擇

2.1.1.1 溶劑的選擇

0.01 mol/L鹽酸。黃酮類提取方法主要有水提法、堿提法、有機(jī)溶劑提取、超聲提取、酶解提取、超臨界流體萃取法等[7]，根據(jù)文獻(xiàn)可知采用水提法的性價比較高[8]，由于黃酮類化合物大部分含有酚羥基，顯弱酸性，為避免其在中性水溶液中發(fā)生解離，本實(shí)驗(yàn)采用0.01 mol/L的鹽酸溶液作為樣品提取劑[9]，其pH≈3。

2.1.1.2 固相萃取柱的選擇

poly-sery HLB,采用親水-親脂平衡的HLB吸附劑，適用于含水樣品中極性與非極性化合物的提取，pH耐受范圍1～14，適合酸性提取液的凈化，對黃酮等極性化合物的吸附比傳統(tǒng)的C18或硅膠基質(zhì)更高。槲皮素加標(biāo)回收考察不同比例甲醇對HLB柱的洗脫效果，結(jié)果使用純甲醇的洗脫效率最高，40 ℃氮?dú)獯蹈?，得到凈化富集的分析物?/p>

2.1.2色譜條件的優(yōu)化

2.1.2.1 流動相的選擇

實(shí)驗(yàn)比較了0.3%甲酸-甲醇、0.3%磷酸-乙腈、0.3%甲酸-乙腈、10 mmol/L乙酸銨-乙腈作為流動相的色譜分離效果。結(jié)果顯示：使用0.3%甲酸-乙腈作為液相色譜流動相，以62∶38的體積比在0.7 mL/min的流速時分離效果最佳，色譜峰型更好、響應(yīng)度更高。

2.1.2.2 檢測波長的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)[10]，指紋圖譜色譜峰主要為黃酮類物質(zhì)，該類物質(zhì)基本在254 nm、360 nm處有最大吸收，配置100 mg/L的槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液，DAD檢測器在260～370 nm范圍內(nèi)每隔10 nm測定1次，最終測得350 nm為最佳吸收波長。

2.1.3指紋圖譜的測定

2.1.3.1 精密度試驗(yàn)

取任一樣品溶液，按2.1.2項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄共有峰相對保留時間和峰面積，考察精密度和重復(fù)性，以槲皮素為對照峰，選取峰面積百分含量>1%的12個共有峰計(jì)算保留時間和峰面積RSD，并計(jì)算相似度。結(jié)果顯示各共有峰的峰面積和相對保留時間的RSD<3%，相對保留時間RSD<3%，儀器精密度良好，方法穩(wěn)定可靠，符合指紋圖譜要求。

2.1.3.2 指紋圖譜采集

對6批次蜂蜜進(jìn)行分析，對照品與樣品溶液各進(jìn)樣20 μL采集指紋圖譜，將結(jié)果導(dǎo)入色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004版，以槲皮素作為參照峰S，標(biāo)記了12個共有峰，并生成對照指紋圖譜，結(jié)果見圖1。

圖1 蜂蜜對照指紋圖譜

2.1.3.3 相似度計(jì)算

使用色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)2004版，以生成的對照譜圖為參照，對6種蜂蜜的12個共有峰進(jìn)行指紋圖譜相似度分析，結(jié)果如表1。

表1 6種蜂蜜指紋圖譜與參照圖譜相似度

2.2 黃酮類成分分析

選取響應(yīng)最高的4個色譜峰1、2、4、7號峰作為分析對象，轉(zhuǎn)移至LC-MS進(jìn)行定性分析，依據(jù)液相DAD光譜及文獻(xiàn)檢索結(jié)果[11-13]，初步判定4種黃酮類化合物分別為蘆丁、楊梅酮、槲皮素、山奈酚，制備4種黃酮化合物混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(1 000 mg/L)，采用單點(diǎn)校正，按1.3.4項(xiàng)MS條件，標(biāo)準(zhǔn)品和樣品溶液各進(jìn)樣5 μL，0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水，流速0.3 mL/min，梯度洗脫。

根據(jù)對照品的質(zhì)譜信息，鑒定出1號峰(Rt 4.00，[M-H]-m/z 609)為蘆丁，2號峰(Rt 4.00，[M-H]-m/z 317)為楊梅酮，4號峰(Rt 4.00，[M-H]-m/z 301)為槲皮素，7號峰(Rt 4.00，[M-H]-m/z 285)為山奈酚。4種黃酮組分SRM二級掃描譜圖見圖2，各化合物優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)見表2，最終得到的各蜂蜜的黃酮組分含量見表3。

圖2 4種黃酮類化合物SRM 二級掃描譜圖

表2 4種目標(biāo)物質(zhì)譜參數(shù)

表3 各蜂蜜的黃酮組分含量 mg/kg

3 結(jié)論

(1)本文建立了蜂蜜指標(biāo)成分HPLC指紋圖譜分析方法，采用HLB凈化，HPLC對6批次蜂蜜進(jìn)行檢測，以槲皮素作為參照峰，所測6種蜂蜜含有12個共同峰，通過中藥色譜指紋圖譜軟件比對，其相似度均大于0.90，選取最大的4個共有峰LC-MS定性。結(jié)果表明：6種蜂蜜中蘆丁、楊梅酮、槲皮素、山奈酚含量差異較大，這主要與蜜源植物以及加工工藝不同有關(guān)，所測4種黃酮物質(zhì)在百花蜜1(湖南)中含量最高，百花蜜2(云南)其次，麥盧卡(澳洲)最低。

(2)本方法前處理操作簡單，色譜分離度好，穩(wěn)定性高，以指紋圖譜找出不同產(chǎn)地不同品種蜂蜜的共有峰并結(jié)合LC-MS為質(zhì)量控制手段，既具有指紋圖譜分析的全面性又避免了液相色譜響應(yīng)低，不能準(zhǔn)確鑒別復(fù)雜黃酮化合物的問題，在對蜂蜜及蜂產(chǎn)品有效及全面分析上具有較大優(yōu)勢。