劉 冰，付 云，蘇瑩珍，賀啟蓮，帥紅艷，Xin Yu △

1.大理大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(大理671000)；2.大理大學(xué) 代謝性疾病轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究院(大理671000)；3.昆明學(xué)院 醫(yī)學(xué)院(昆明 650214)；4.大理大學(xué) 護(hù)理學(xué)院(大理671000)

脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)7型(spinocerebellar ataxia type 7,SCA7)是常染色體顯性遺傳的神經(jīng)退行性疾病，臨床表現(xiàn)為視網(wǎng)膜、小腦和腦干中的神經(jīng)元退行性死亡[1]。該疾病表現(xiàn)為編碼的失調(diào)共濟(jì)蛋白-7(ataxin-7,ATXN7)蛋白中多聚谷氨酰胺(polyglutamine,PolyQ)結(jié)構(gòu)域的擴(kuò)增[2]，這種擴(kuò)增是由ATXN7基因中不穩(wěn)定的CAG重復(fù)序列發(fā)生擴(kuò)增突變導(dǎo)致。除SCA7外，另外8種神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制與SCA7相似，包括亨廷頓病、齒狀核蒼白球萎縮、脊髓延髓肌萎縮以及脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)1～3型、6型和17型，統(tǒng)稱為PolyQ疾病[3]。PolyQ蛋白形成的單體、寡聚體和內(nèi)含體(聚合體)等在細(xì)胞中以動(dòng)態(tài)平衡形式存在[4]，但各個(gè)突變蛋白結(jié)構(gòu)引起細(xì)胞毒性的分子機(jī)制尚存爭(zhēng)議。因此,研究錯(cuò)誤折疊蛋白的有效清除方法對(duì)開(kāi)發(fā)治療PolyQ疾病的潛在方案具有重要意義。

泛素-蛋白酶體系(ubiquitin-proteosome system,UPS)是哺乳動(dòng)物體內(nèi)調(diào)控蛋白質(zhì)降解的重要途徑[5]。如何特異性激活UPS一直是本領(lǐng)域研究的技術(shù)瓶頸，目前已知UPS功能的激活機(jī)制包括：1)增強(qiáng)蛋白水解能力；2)刺激泛素化過(guò)程；3)抑制泛素分解酶。研究[5]發(fā)現(xiàn)，剛果紅衍生物WSP774和WSP677能增強(qiáng)蛋白酶體對(duì)受感染細(xì)胞中朊病毒蛋白PrPSc的降解，減輕PrPSc對(duì)蛋白酶體的抑制作用。蘿卜硫素能明顯增強(qiáng)小鼠大腦、外周組織中UPS和自噬的活性，并促進(jìn)泛素化蛋白在體內(nèi)轉(zhuǎn)化，減少PolyQ蛋白的聚集[6]。而1-[1-(4-氟苯基)-2,5-二甲基-1H-吡咯-3-基]-2-(1-吡咯烷基)乙酮{1-[1-(4-fluorophenyl)-2,5-dimethylpyrrol-3-yl]-2-pyrrolidin-1-yle-thanone,IU-1}是目前唯一通過(guò)抑制泛素特異性蛋白酶(ubiquitin specific protease 14,USP14)對(duì)多泛素化底物進(jìn)行去泛素化，來(lái)增強(qiáng)蛋白酶體活性的小分子[7]。IU-1是泛素分解酶USP14的可逆性抑制劑[8]，但目前IU-1對(duì)于UPS的激活作用是否能夠影響PolyQ疾病尚無(wú)確切研究。

以往在UPS參與PolyQ突變蛋白降解作用的研究中，往往缺少激活UPS對(duì)促進(jìn)PolyQ蛋白聚合體的影響[9]。本研究通過(guò)激活和抑制UPS活性，觀察其對(duì)ATXN7累積與聚合體水平的變化及對(duì)細(xì)胞毒性的影響，探索UPS對(duì)PolyQ突變蛋白的清除機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和質(zhì)粒

大鼠腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞系PC12和質(zhì)粒pTRE-tight基因調(diào)控系統(tǒng)(tetracycline tet-off system,Tet-off)均購(gòu)自美國(guó)Clontech公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)材料

鹽酸多西霉素(doxycline, Dox)、伯克改良伊格爾培養(yǎng)基(Dulbecco modified Eagle medium, DMEM)、IU-1、環(huán)氧甲酮四肽(epoxomycin，Epox)、十二烷基硫酸鈉(sodium dodecyl sulfate,SDS)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol,DTT)、蛋白酶抑制劑混合物、4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′, 6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；RIPA裂解液購(gòu)自美國(guó)Millipore公司；脫氧核糖核酸酶(deoxyribonudease Ⅰ，DNaseI)(EN0521)購(gòu)自美國(guó)Fermentas公司；Bradford蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；2-(4-碘苯)-3-(4-硝基苯)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四氮唑鈉鹽[2-(4-iodophenyl)-3-(4-nitrophenyl)-5-(2,4-disulfophenyl)-2H-tetrazolium sodium salt,WST-1]細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Clontech公司；ATXN7抗體、肌動(dòng)蛋白(Actin)抗體(SC-1616)均購(gòu)自美國(guó)SantaCruz公司；聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜購(gòu)自英國(guó)Whatman公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 穩(wěn)定表達(dá)ATXN7突變蛋白細(xì)胞系的培養(yǎng)穩(wěn)定表達(dá)ATXN7蛋白的PC12細(xì)胞系及質(zhì)粒構(gòu)建方法參照本課題組前期方法[10]:分別將編碼Q10和Q65的DNA片段插入到pTRE-tight off質(zhì)粒的多克隆位點(diǎn)中，再將構(gòu)建成功的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染到PC12細(xì)胞中，經(jīng)篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)ATXN7蛋白的兩種不同類型細(xì)胞，分別命名為ATXN7-Q10和ATXN7-Q65細(xì)胞，其中ATXN7-Q10細(xì)胞表達(dá)非突變蛋白ATXN7，ATXN7-Q65細(xì)胞表達(dá)突變蛋白ATXN7。PC12細(xì)胞系在含10%馬血清、5%胎牛血清、100 mg/L G418、100 U/mL氨芐青霉素、100 mg/L鏈霉素、100 mg/L潮霉素、1 mg/L Dox的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 °C，5% CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(圖1)。

圖1 穩(wěn)定表達(dá)ATXN7-Q10和ATXN7-Q65的PC12細(xì)胞系構(gòu)建

1.3.2 ATXN7蛋白的誘導(dǎo)表達(dá) 不添加Dox的Tet-off專用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)PC12細(xì)胞，并在后續(xù)不同誘導(dǎo)時(shí)間(0、1、3、6、9、12 d)收集細(xì)胞并裂解，分別檢測(cè)ATXN7-Q10和ATXN7-Q65細(xì)胞中的可溶性蛋白及其聚合體水平。在ATXN7蛋白降解的研究中，首先在已誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白12 d的PC12細(xì)胞培養(yǎng)基中添加Dox以抑制目的蛋白表達(dá)，繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞并檢測(cè)24 h內(nèi)不同時(shí)間點(diǎn)ATXN7可溶性蛋白及其聚合體表達(dá)水平的變化。

1.3.3 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)及斑點(diǎn)過(guò)濾雜交法檢測(cè)可溶性ATXN7及其聚合體水平 ATXN7-Q10和ATXN7-Q65細(xì)胞經(jīng)RIPA裂解后，使用含有蛋白酶抑制劑混合物和苯甲基磺酰氟的細(xì)胞裂解緩沖液裂解細(xì)胞并收集上清液，考馬斯亮藍(lán)法測(cè)蛋白濃度，樣品經(jīng)丙烯酰胺凝膠電泳后，分別與一抗ATXN7抗體(1∶700)、Actin(1∶500)、二抗辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的抗體(1∶2 000)進(jìn)行特異性抗體標(biāo)記，做蛋白質(zhì)印跡技術(shù)分析。用斑點(diǎn)過(guò)濾雜交法法分析斑點(diǎn)印記強(qiáng)度，具體操作為將細(xì)胞裂解液沉淀部分經(jīng)磷酸鹽緩沖鹽溶液洗滌2次，重懸于50 μL DNaseI反應(yīng)緩沖液中，并加入4 U的DNaseI反應(yīng)緩沖液，37 °C消化1 h，獲得不溶性沉淀(內(nèi)含體或多聚體)。向沉淀中加入2%的SDS和1×105μmol/L的DTT，95 °C變性處理5 min后，用0.22 μm孔徑PVDF膜(Bio-Rad 微量過(guò)濾器)經(jīng)真空過(guò)濾后進(jìn)行特異性抗體標(biāo)記。采用Super Signal West Pico試劑盒進(jìn)行目的蛋白的顯影，并用ChemiDoc XRS+ 成像系統(tǒng)(Bio-Rad)分析蛋白信號(hào)強(qiáng)度，最后用凝膠式成像系統(tǒng)軟件(Bio-Rad,美國(guó))進(jìn)行定量分析。

1.3.4 WST-1細(xì)胞活性試驗(yàn)和DAPI染色法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 分別將ATXN7-Q10和ATXN7-Q65細(xì)胞以5×104個(gè)/孔濃度接種到96孔板中，并分別在0、1、3、6、9、12 d時(shí)，利用WST-1細(xì)胞活性檢測(cè)試劑盒測(cè)定細(xì)胞存活率。同時(shí)重復(fù)上述方法，細(xì)胞接種于內(nèi)置明膠包被蓋玻片的6孔板內(nèi)，分別誘導(dǎo)ATXN7-Q10和ATXN7-Q65細(xì)胞表達(dá)ATXN7蛋白0、6、12 d后，經(jīng)4%多聚甲醛固定并進(jìn)行DAPI染色(具體步驟按照產(chǎn)品說(shuō)明操作)。在熒光顯微鏡(激發(fā)波長(zhǎng)340～380 nm，發(fā)射波長(zhǎng)435～485 nm)下隨機(jī)選取10個(gè)視野觀測(cè)細(xì)胞凋亡小體，計(jì)數(shù)凋亡細(xì)胞并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。在UPS活性對(duì)ATXN7-Q65細(xì)胞表達(dá)ATXN7突變蛋白影響的研究中，向ATXN7-Q65細(xì)胞培養(yǎng)基中分別添加IU-1(5×104μmol/L)或Epox(0.2 μmol/L)，以未添加試劑的ATXN7-Q65細(xì)胞為對(duì)照組，持續(xù)培養(yǎng)并在各時(shí)間點(diǎn)(0、1、3、6、9、12 d)用WST-1試劑盒檢測(cè)細(xì)胞存活率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 突變蛋白ATXN7的聚合性及細(xì)胞毒性

蛋白質(zhì)印跡技術(shù)結(jié)果顯示，在構(gòu)建的兩組神經(jīng)細(xì)胞模型中，隨著誘導(dǎo)表達(dá)時(shí)間的延長(zhǎng)，在ATXN7-Q10細(xì)胞中，可溶性ATXN7蛋白的表達(dá)明顯升高;在ATXN7-Q65細(xì)胞中，可溶性ATXN7蛋白的表達(dá)明顯升高，并伴有ATXN7聚合體的增加(圖2、表1)。

圖2 誘導(dǎo)表達(dá)ATXN7蛋白對(duì)兩組細(xì)胞可溶性ATXN7

表1 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)兩組細(xì)胞可溶性ATXN7蛋白水平

WST-1細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)和DAPI染色顯示，PC12細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)0～3 d后，細(xì)胞存活率未出現(xiàn)明顯改變，經(jīng)誘導(dǎo)6 d后，ATXN7-Q65細(xì)胞存活率明顯降低，凋亡細(xì)胞的比率增加(P<0.05);經(jīng)誘導(dǎo)12 d后，細(xì)胞存活率進(jìn)一步降低，該比率與細(xì)胞凋亡率基本接近(表2～3)。在ATXN7-Q10細(xì)胞中，隨著誘導(dǎo)時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞存活無(wú)明顯下降，細(xì)胞凋亡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

表2 WST-1細(xì)胞增殖活性檢測(cè)結(jié)果

表3 DAPI染色細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果

2.2 UPS活性變化對(duì)ATXN7蛋白水平的影響

在兩組細(xì)胞加入Dox抑制劑結(jié)果顯示，與ATXN7-Q10細(xì)胞相比，ATXN7-Q65細(xì)胞的可溶性ATXN7蛋白的降解相對(duì)緩慢，并于4、8 h后,ATXN7-Q65細(xì)胞的ATXN7蛋白水平明顯高于ATXN7-Q10細(xì)胞(P<0.05)(圖3、表4)。

圖3 加入Dox抑制劑后對(duì)兩組細(xì)胞可溶性ATXN7

表4 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)兩組細(xì)胞可溶性ATXN7蛋白水平

2.3 UPS活性變化對(duì)ATXN7-Q65細(xì)胞毒性的影響

經(jīng)特異性UPS激活劑IU-1和抑制劑Epox持續(xù)處理ATXN7-Q65細(xì)胞后結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比，IU-1組激活后第12天ATXN7-Q65細(xì)胞存活率升高(P<0.05)；相反，抑制UPS活性12 d后，Epox組ATXN7-Q65細(xì)胞死亡率明顯增高(P<0.001)(表5)。

表5 WST-1檢測(cè)UPS活性變化后ATXN7-Q65細(xì)胞的增殖活性

3 討論

UPS是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)降解的重要途徑之一,主要通過(guò)降解泛素化的靶蛋白參與短半衰期蛋白或多肽的降解，而自噬主要參與蛋白聚合體等相對(duì)體積較大的底物降解[11]。研究[12]表明，突變的PolyQ蛋白對(duì)UPS的清除有抵抗力，甚至由于突變蛋白聚合體的形成會(huì)抑制UPS對(duì)底物的降解，進(jìn)而破壞UPS的活性，因此降低ATXN7突變蛋白的聚合程度以及增加UPS的降解能力，均可改善由PolyQ蛋白異常擴(kuò)增引起的細(xì)胞毒性。但是本研究發(fā)現(xiàn),在PolyQ序列擴(kuò)增形成多聚體后，UPS依然能降低PolyQ突變蛋白聚合體的水平。這可能是由于UPS途徑的增強(qiáng)有效增加突變蛋白單體的降解，引起突變蛋白聚合體與可溶性單體之間的化學(xué)平衡發(fā)生變化，使平衡從聚合體向單體方向轉(zhuǎn)變，最終引起突變蛋白聚合體水平降低[13]；同時(shí)也可能是由于UPS活性的增強(qiáng)，降低突變蛋白對(duì)UPS蛋白降解功能的損傷，進(jìn)而加速突變蛋白單體的清除效率[14]。

由此可見(jiàn)，如果能有效刺激UPS活性，延緩?fù)蛔兊鞍拙酆系乃俣群统潭龋赡軐?duì)解決由PolyQ蛋白突變及聚合所引起的神經(jīng)退行性疾病具有重要意義。本研究在誘導(dǎo)表達(dá)ATXN7突變蛋白的PC12細(xì)胞模型中，利用IU-1和Epox處理細(xì)胞并檢測(cè)UPS活性變化對(duì)突變蛋白降解和對(duì)細(xì)胞毒性的影響。與誘導(dǎo)表達(dá)ATXN7-Q10的PC12細(xì)胞相比，ATXN7-Q65細(xì)胞可引起蛋白聚合體的形成并產(chǎn)生細(xì)胞毒性。在ATXN7-Q65細(xì)胞降解實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增的PolyQ序列能明顯增加可溶性突變蛋白及其聚合體的穩(wěn)定性，抵抗細(xì)胞的降解作用。既往研究[11]結(jié)果顯示，ATXN7突變蛋白的降解受UPS活性調(diào)控。IU-1激活UPS后，能促進(jìn)可溶性突變蛋白ATXN7及其聚合體的清除，并有效緩解由PolyQ突變蛋白引起的細(xì)胞毒性；相反Epox抑制UPS的活性后，PC12細(xì)胞中PolyQ突變蛋白的水平增加，細(xì)胞存活率降低。

鑒于上述發(fā)現(xiàn)，有效促進(jìn)UPS途徑，可能是緩解PolyQ疾病的新途徑。增強(qiáng)UPS的降解能力既可通過(guò)改變UPS活性，也可通過(guò)改善被降解底物的活性來(lái)提高降解效率。有研究[15]表明，利用人工設(shè)計(jì)的小分子多肽QBP1抑制PolyQ突變蛋白的聚合，能有效降低PolyQ突變蛋白在動(dòng)物體內(nèi)的毒性。目前開(kāi)發(fā)的UPS激活劑其特異性及抑制效果一直存在爭(zhēng)議,因?yàn)檫@類激活劑往往除了有效地激活UPS外，還會(huì)引起自噬功能的激活，進(jìn)而無(wú)論是突變蛋白單體還是聚合體的降解都會(huì)得到增強(qiáng)[16]。然而不論是單獨(dú)激活UPS還是附帶對(duì)自噬功能的激活，其對(duì)于有毒性突變蛋白各種成分的清除作用都對(duì)細(xì)胞的存活表現(xiàn)出保護(hù)作用。但有效激活UPS活性相比對(duì)自噬功能的激活效果更優(yōu)越。有研究[17]發(fā)現(xiàn)，PolyQ蛋白在形成聚合體之前會(huì)形成錯(cuò)誤折疊的單體和寡聚體，其表現(xiàn)出比聚合體更強(qiáng)的細(xì)胞毒性。而UPS的激活能有效清除形成聚合體之前的多種蛋白結(jié)構(gòu)形式，在形成聚合體之前降低突變蛋白水平。IU-1作為UPS的特異性小分子激活劑，能對(duì)蛋白酶體發(fā)揮可逆的選擇性抑制作用，已被開(kāi)始應(yīng)用于細(xì)胞研究，但其不足之處表現(xiàn)為IU-1激活UPS活性的能力相對(duì)較弱[18]，因此進(jìn)一步優(yōu)化其結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)其蛋白降解功能，對(duì)于防治突變蛋白的累積和聚集具有十分重要的意義。

綜上所述，在PC12細(xì)胞系中，UPS途徑在PolyQ突變蛋白的清除機(jī)制中起關(guān)鍵作用，UPS活性的增強(qiáng)對(duì)PolyQ突變蛋白單體及蛋白聚合體的清除具有促進(jìn)作用;同時(shí)IU-1作為UPS的激活劑能促進(jìn)可溶性ATXN7突變蛋白及其聚合體的降解，明顯降低由PolyQ突變蛋白產(chǎn)生的細(xì)胞毒性。本研究為進(jìn)一步探索利用UPS激活劑緩解和治療由PolyQ蛋白突變引起的神經(jīng)退行性疾病提供了新思路和理論依據(jù)。本研究不足之處在于未探討在體內(nèi)環(huán)境下，UPS對(duì)突變蛋白的清除作用，因此尚需進(jìn)一步的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證其作用效果及機(jī)制。