陳燕偉，王 利，王 凱，李 俠，林 偉，蔣曉帆，張 磊

中國人民解放軍空軍軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科(西安 710032)

人叁皂甙Rd(ginsenoside Rd,GSRd)是從中藥人參中提取的三萜類皂甙單體物質(zhì)，由于其親脂的特性，即便在能量缺乏情況下，也能輕易穿過血腦屏障和細(xì)胞膜，從抗氧化、抗炎和減輕線粒體損傷等方面影響多種神經(jīng)細(xì)胞的活性和代謝，對缺血性腦卒中、阿爾茨海默病和腦創(chuàng)傷等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)揮廣泛而獨(dú)特的作用[1-2]。近年有研究[3]表明，除谷氨酸具有興奮毒性作用，鈣離子具有超載和氧化應(yīng)激損傷外，炎癥在創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用。在前期腦缺血性疾病的分子病理機(jī)制研究[4-5]中發(fā)現(xiàn)，以先天免疫通過模式識別Nod樣受體蛋白3(nod-like receptor protein 3,NLRP3)等受體，激活Caspase-1，形成炎性小體，可進(jìn)一步促進(jìn)大量白細(xì)胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)和白細(xì)胞介素-18(interleukin-18,IL-18)等炎性因子分泌和釋放，加重神經(jīng)細(xì)胞死亡——焦亡。但GSRd能否通過拮抗焦亡影響TBI的研究少見報道。本研究旨在觀察GSRd對神經(jīng)細(xì)胞劃傷后焦亡的影響，探討其可能存在的分子機(jī)制，為GSRd臨床治療TBI提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 細(xì)胞 HT22細(xì)胞系購自上海吉凱基因有限公司并由實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 GSRd購自美國Sigma公司； 兔抗大鼠NLRP3單克隆抗體購自美國AdipoGen公司；兔抗大鼠β-Actin單克隆抗體購自美國Cell Signaling公司；山羊抗兔IgG/辣根酶標(biāo)記購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；IL-1β和 IL-18 ELISA試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶免疫組化試劑盒購自北京中山生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) HT22細(xì)胞經(jīng)復(fù)蘇、培養(yǎng)和擴(kuò)增后，誘導(dǎo)其向交感神經(jīng)元樣細(xì)胞分化：取傳5代以上HT22細(xì)胞，經(jīng)消化分散后，制成5×105個/mL細(xì)胞懸液，接種于塑料培養(yǎng)皿中，置于培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。每周換液2次，每次更換1/2新鮮培養(yǎng)液。

1.2.2 神經(jīng)細(xì)胞劃傷損傷模型制作、GSRd治療及分組準(zhǔn)備6孔板，將HT22細(xì)胞懸液均勻鋪種于孔板中，將孔板放置于37 ℃，5% CO2孵箱中培養(yǎng)6 d，隨機(jī)分為空白組(Sham組)、生理鹽水組(Con組)和GSRd治療組(GSRd組)，GSRd組又分為10 μmol/L和50 μmol/L兩個亞組。在HT22細(xì)胞培養(yǎng)皿中用10 μL滅菌槍頭劃傷各孔均勻橫豎6道(共12道)，GSRd培養(yǎng)48 h后提取細(xì)胞。GSRd組維持培養(yǎng)基GSRd 10 μmol/L和50 μmol/L，Con組同時給予等劑量生理鹽水，Sham組細(xì)胞不做任何處理。

1.2.3 細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞接種到96孔板中(5 000個/孔)，每組設(shè)置5個復(fù)孔，培養(yǎng)24 h。再按細(xì)胞分組，采用細(xì)胞增殖-毒性檢測試劑盒(cell counting kit-8,CCK8)檢測各組細(xì)胞活力，根據(jù)450 nm下的吸光度(D)值對結(jié)果進(jìn)行計(jì)算。

1.2.4 熒光免疫組化法檢測NLRP3蛋白表達(dá) HT22細(xì)胞經(jīng)4%多聚甲醛固定后，驢血清封閉30 min，加入一抗抗體(NLRP31∶100)4 ℃過夜，PBS洗滌3遍，加入驢抗兔熒光二抗抗體(1∶1 000)室溫孵育3 h，PBS洗滌5遍，Hoechst 染料染核5 min,PBS洗滌5遍，鏡檢。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測NLRP3表達(dá)變化 收集各組處理過的HT22細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度，聚丙烯酰胺凝膠電泳，分離蛋白后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上，與NLRP3(1∶500)，β-actin(1∶2 000)抗體結(jié)合，然后與辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗結(jié)合，電化發(fā)光法顯色后照相。最后用凝膠成像系統(tǒng)(Image master VDS)攝影，圖像分析軟件 (Image J) 行灰度掃描分析。以目的蛋白與β-actin 的蛋白產(chǎn)物條帶灰度值比值作為其蛋白水平的相對量,并用掃描圖像分析儀計(jì)算蛋白條帶的表達(dá)。

1.2.6 酶聯(lián)免疫吸附測定檢測IL-1β和 IL-18表達(dá)變化 將HT22細(xì)胞接種于96孔板中，同體外培養(yǎng)HT22細(xì)胞劃傷的制作、Res預(yù)處理及分組，按照ELISA試劑盒流程進(jìn)行IL-1β和 IL-18表達(dá)變化的檢測。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 CCK8檢測各組HT22細(xì)胞活力

Con組的細(xì)胞活力明顯低于Sham組，不同劑量GSRd組的細(xì)胞活力高于Con組(P<0.05)(圖1)。

圖1 CCK8檢測各組HT22細(xì)胞活力

2.2 熒光免疫組化檢測各組HT22細(xì)胞NLRP3表達(dá)水平

NLRP3蛋白主要分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)上。與Sham組比較，Con組HT22細(xì)胞死亡較多，但存活細(xì)胞中NLRP3的染色陽性率較高；與Con組比較，GSRd 10 μmol/L和50 μmol/L組HT22細(xì)胞存活較多，且NLRP3表達(dá)降低(圖2)。

圖2 3組HT22細(xì)胞中NLRP3蛋白表達(dá)情況(×400)

2.3 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測各組HT22細(xì)胞NLRP3的表達(dá)變化

與Sham組比較，Con組中NLRP3表達(dá)水平增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);GSRd 10 μmol/L和50 μmol/L組中NLRP3表達(dá)水平也增高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；GSRd 10 μmol/L和50 μmol/L組與Con組比較，均可明顯降低NLRP3表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；GSRd 10 μmol/L和50 μmol/L組比較， NLRP3表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3)。

圖3 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測NLRP3蛋白在各組中的表達(dá)變化

2.4 酶聯(lián)免疫吸附測定檢測各組HT22細(xì)胞IL-1β和 IL-18表達(dá)

與Con組比較，GSRd 10 μmol/L和50 μmol/L組的IL-1β和 IL-18表達(dá)水平較低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；而GSRd 10 μmol/L和50 μmol/L組IL-1β和 IL-18表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(表1)。

表1 4組細(xì)胞IL-1β和 IL-18表達(dá)對比

3 討論

TBI具有高發(fā)生率、高致殘率和高致死率，已成為威脅人類健康和生命的一類疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，每年全世界超過5 000萬人經(jīng)歷TBI，給家庭及社會帶來了沉重的負(fù)擔(dān)。TBI 致傷機(jī)制復(fù)雜，創(chuàng)傷后神經(jīng)遞質(zhì)釋放、自由基產(chǎn)生、鈣介導(dǎo)損傷、線粒體功能障礙和凝血功能異常等病理生理過程可造成機(jī)體二次損傷，導(dǎo)致患者預(yù)后不佳[6-7]。近年來，關(guān)于機(jī)體固有免疫系統(tǒng)在疾病誘發(fā)炎性反應(yīng)中發(fā)揮作用成為研究熱點(diǎn)。有研究[8]表明，溶酶體損傷可釋放大量組織蛋白酶，激活NLRP3 因子，通過細(xì)胞凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣含有胱天蛋白酶募集結(jié)構(gòu)域蛋白與Caspase-1結(jié)合，形成NLRP3炎性小體，促進(jìn)IL-1β和IL-18等炎性因子大量釋放，加重疾病的發(fā)生發(fā)展，影響患者預(yù)后。Irrera等[9]在最新一篇綜述中說明TBI發(fā)生后NLRP3、Caspase-1、IL-1β和IL-18明顯上調(diào);同時，利用特異性NLRP3抑制劑可減輕TBI發(fā)生后以神經(jīng)炎癥為特征的損傷。此外，NLRP3和與其激活相關(guān)的分子可被認(rèn)為是TBI導(dǎo)致的其他神經(jīng)退行性疾病的生物標(biāo)志物和預(yù)測因子，提示NLRP3炎性小體在TBI的發(fā)生發(fā)展，特別是炎性損傷中發(fā)揮核心作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)細(xì)胞劃傷模擬TBI的模型中，神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)NLRP3染色陽性率較高，IL-1β和IL-18也大量釋放，加重神經(jīng)細(xì)胞死亡，提示尋找有效拮抗神經(jīng)炎癥的藥物或方法可改善TBI的預(yù)后。

GSRd是一種古老的傳統(tǒng)中草藥——人參的提取物，在許多疾病的預(yù)防治療中發(fā)揮療效。研究[10-12]證實(shí)，GSRd主要作用機(jī)制包括：1)抑制氧自由基作用，抑制活性氧的過量積聚和脂質(zhì)過氧化反應(yīng)；2)抑制炎性反應(yīng)作用，包括自由基的清除與小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎性因子(IL-1β、IL-18和TNFα)的抑制；3) 抑制興奮性氨基酸毒性和鈣超載作用；4)減輕線粒體損傷作用，改善線粒體功能失調(diào)，重建能量代謝系統(tǒng)以及抑制繼發(fā)的神經(jīng)細(xì)胞凋亡等。Li等[13]發(fā)現(xiàn)，人參皂苷 Rg1 具有抗炎作用，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的炎癥反應(yīng)中，可抑制下游炎癥因子產(chǎn)生，保護(hù)受損神經(jīng)細(xì)胞。還有研究[14]表明，Aβ 1-42誘導(dǎo)的BV-2細(xì)胞模擬阿爾海默茨病時，不同濃度的人參皂苷Rg1可不同程度抑制IL-1β、IL-18分泌，促進(jìn)抗氧化酶活力，具有明顯的抗炎活性，其分子機(jī)制是通過抑制NLRP3炎性小體激活來實(shí)現(xiàn)的。本研究則發(fā)現(xiàn)，低劑量(10 μmol/L)和大劑量(50 μmol/L)GSRd對神經(jīng)細(xì)胞損傷均有治療作用，這種保護(hù)作用是通過降低NLRP3表達(dá)，抑制IL-1β和 IL-18的大量釋放，減輕炎性反應(yīng)，從而降低神經(jīng)細(xì)胞死亡實(shí)現(xiàn)的。上述結(jié)果表明，神經(jīng)細(xì)胞受損后，氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎性反應(yīng)同時加劇其損傷程度，而不同濃度的GSRd均可有效抑制氧化應(yīng)激毒性作用，減輕白介素等炎性因子的釋放，阻斷神經(jīng)細(xì)胞死亡通路，發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用。

綜上所述，GSRd可通過抑制NLRP3信號通路，減少IL-1β和 IL-18的釋放，進(jìn)而抑制神經(jīng)細(xì)胞死亡。但GSRd作用后拮抗的炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激之間信號通路，以及在體內(nèi)治療的作用有待進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。