吳曉博,趙 哲,王瑾瑜,公利鑫,李靜怡△,潘克儉

1.成都醫(yī)學(xué)院 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院(成都 610500); 2.成都醫(yī)學(xué)院 檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院(成都 610500)；3.成都醫(yī)學(xué)院第二附屬醫(yī)院·核工業(yè)四一六醫(yī)院(成都 610051)；4.成都醫(yī)學(xué)院 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院(成都 610500)

肺癌是我國(guó)腫瘤中發(fā)病率和病死率較高的惡性腫瘤，每年約160萬(wàn)人死于肺癌,已成為影響居民健康的主要疾病[1]。肺癌與生活方式、環(huán)境因素及基因組成等密切相關(guān)。根據(jù)組織學(xué)特征,肺癌可分為小細(xì)胞肺癌和非小細(xì)胞肺癌，后者占所有肺癌的85%，其中非小細(xì)胞肺癌中最為常見的亞型為腺癌[2]。目前，肺癌的治療手段主要為手術(shù)切除和放、化療[3]。放療對(duì)于殺滅局部腫瘤的效果較好，但易產(chǎn)生并發(fā)癥，如放射性肺炎、放射性肺纖維化及放射性食管炎[4]。

線粒體是電離輻射攻擊的主要目標(biāo)[5-6]。線粒體轉(zhuǎn)錄因子A(mitochondrial transcription factor A，mtFAM)是由核基因編碼的一種多功能線粒體DNA(mitochondrial DNA,mtDNA)蛋白，具有維持線粒體穩(wěn)定的功能[7]。目前mtFAM蛋白在輻射損傷細(xì)胞中的功能研究較少，本研究將探討mtFAM蛋白在X射線誘導(dǎo)的細(xì)胞輻射損傷中的作用，并進(jìn)一步討論mtFAM蛋白與肺癌放療之間的聯(lián)系。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞

本實(shí)驗(yàn)采用人非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞，購(gòu)自美國(guó)ATCC公司并保存于成都醫(yī)學(xué)院科研實(shí)驗(yàn)中心。

1.2 主要設(shè)備及試劑

本研究細(xì)胞實(shí)驗(yàn)采用X-RAD225生物輻照儀，購(gòu)自美國(guó)Precision X-ray公司。1640培養(yǎng)基、胎牛血清、胰酶、青霉素-鏈霉素雙抗、磷酸鹽緩沖液均購(gòu)自以色列BI公司；四氫生物喋呤購(gòu)于美國(guó)Cayman Chemical公司；結(jié)晶紫、二辛可寧酸(bicinchcnininc acid,BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒購(gòu)于美國(guó)Thermo公司；蛋白酶抑制劑、活性氧(reactive oxygen species，ROS)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；二甲基亞砜、膜聯(lián)蛋白V(annexin V)-FITC/碘化丙啶(propidium iodide，PI)凋亡檢測(cè)盒、線粒體膜電位JC-10檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京索萊寶公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)蛋白上樣緩沖液、15%SDS-PAGE凝膠超快速配制試劑盒、聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PDFV)膜和辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG、電化學(xué)發(fā)光(electrochemiluminescence,ECL)試劑盒購(gòu)自上海碧云天生物科技公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)、mtFMA購(gòu)自美國(guó)Novus公司。

1.3 細(xì)胞預(yù)處理與分組

1.3.1 平板克隆存活實(shí)驗(yàn) 經(jīng)輻射處理的3組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，每隔3 d更換1次培養(yǎng)基，12 d后終止培養(yǎng)。使用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，結(jié)晶紫染色，拍照并統(tǒng)計(jì)細(xì)胞克隆數(shù)目，計(jì)算克隆形成率?？寺⌒纬陕?克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù)。每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。

1.3.2 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 采用Annexin V-FITC/PI熒光探針，24 ℃避光孵育30 min，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)3組細(xì)胞凋亡情況。

1.3.3 細(xì)胞內(nèi)ROS檢測(cè) 采用DCFH-DA探針，37 ℃避光孵育30 min，使用ACEA NovoCyte流式細(xì)胞儀檢測(cè)3組細(xì)胞ROS的平均熒光強(qiáng)度。

1.3.4 細(xì)胞超氧陰離子檢測(cè) 使用MitoTracker?Red CM-H2X ros探針， 37 ℃避光孵育30 min，使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)3組細(xì)胞超氧陰離子變化情況。

1.3.5 細(xì)胞線粒體膜電位檢測(cè) 使用JC-10探針，37 ℃孵育避光30 min，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)3組細(xì)胞線粒體膜電位變化情況。

1.3.6 蛋白質(zhì)印跡技術(shù) 提取3組細(xì)胞總蛋白，使用BCA試劑盒測(cè)定蛋白濃度，于15%的SDS-PAGE凝膠中進(jìn)行電泳，將蛋白轉(zhuǎn)移至PDFV膜上，用5%的牛血清白蛋白封閉，孵育mtFMA抗體，使用ECL試劑激發(fā)熒光，曝光。以β微管蛋白(β-Tubulin)為參照，采用凝膠成像系統(tǒng)分析目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 X射線對(duì)A549細(xì)胞存活的影響

克隆形成實(shí)驗(yàn)顯示，與0 Gy組比較，10 Gy組和20 Gy組A549細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制，且20 Gy組細(xì)胞存活數(shù)量明顯低于10 Gy組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。細(xì)胞凋亡檢測(cè)顯示，與0 Gy組比較，10 Gy組和20 Gy組A549細(xì)胞凋亡比例增加，且20 Gy組總凋亡率高于10 Gy組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖1、表1)。

圖1 X射線輻射對(duì)A549細(xì)胞存活的影響

表1 3組A549細(xì)胞克隆形成率及總凋亡率比較

2.2 X射線對(duì)A549細(xì)胞內(nèi)ROS及超氧陰離子水平的影響

ROS檢測(cè)結(jié)果顯示，與0 Gy組比較，10 Gy組和20 Gy組A549細(xì)胞ROS水平明顯上升，且20 Gy組ROS水平高于10 Gy組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。超氧陰離子檢測(cè)結(jié)果顯示，與0 Gy組比較，10 Gy組和20 Gy組超氧陰離子水平明顯增加，且20 Gy組超氧陰離子水平高于10 Gy組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖2、表2)。

第二，手工書籍制作追求物化之美。書籍作為一種具有記錄和查看功能的信息閱讀載體，需要滿足不同消費(fèi)者在閱讀時(shí)的觸覺(jué)和視覺(jué)等感官方面的需求。因此，書籍設(shè)計(jì)者應(yīng)重視書籍本身作為“物”的身份，在手工書的設(shè)計(jì)和制作過(guò)程中，更多的從消費(fèi)者的角度出發(fā)，融入更多樣化的元素，以滿足其在審美和閱讀上的需要。

圖2 X射線輻射對(duì)A549細(xì)胞ROS及超氧陰離子的影響

表2 X射線輻射A549細(xì)胞后ROS及超氧陰離子變化

2.3 X射線對(duì)A549細(xì)胞線粒體膜電位的影響

線粒體膜電位檢測(cè)結(jié)果顯示，與0 Gy組比較，10 Gy組和 20 Gy組A549細(xì)胞線粒體膜電位水平下降，且20 Gy組線粒體膜電位水平低于10 Gy組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)(圖3、表3)。

圖3 X射線輻射對(duì)A549細(xì)胞線粒體膜電位變化的影響

表3 X射線輻射對(duì)細(xì)胞線粒體膜電位變化情況

2.4 X射線對(duì)A549細(xì)胞mtFAM蛋白表達(dá)的影響

蛋白質(zhì)印跡技術(shù)結(jié)果顯示，與0 Gy組比較，10 Gy組和20 Gy組mtFAM蛋白的表達(dá)水平下降，且20 Gy組mtFAM蛋白的表達(dá)水平高于10 Gy組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05)(圖4、表4)。

圖4 蛋白質(zhì)印跡技術(shù)檢測(cè)X射線對(duì)A549細(xì)胞mtFAM蛋白表達(dá)的影響

表4 X射線輻射A549細(xì)胞后mtFAM蛋白表達(dá)情況

3 討論

肺癌是影響人類健康常見的惡性腫瘤之一[1]。局部腫瘤病灶采用放療殺傷較為徹底，但同時(shí)可引起放射性肺炎、放射性肺纖維等不良并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨著A549細(xì)胞經(jīng)X射線(10、20 Gy劑量)輻射后，細(xì)胞生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞凋亡增加，細(xì)胞內(nèi)ROS及超氧陰離子水平上升，并呈現(xiàn)劑量依賴。該結(jié)果提示，隨著X射線劑量增加，引發(fā)mtDNA的氧化損傷越明顯。ROS的過(guò)度升高是氧化應(yīng)激的主要特征，可導(dǎo)致mtDNA不穩(wěn)定、影響呼吸鏈反應(yīng)、改變線粒體膜的通透性及損傷線粒體膜,最終觸發(fā)細(xì)胞凋亡。研究[8-9]表明，電離輻射損傷主要是由于輻射導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)水分子電離激發(fā)，產(chǎn)生大量自由基和ROS,與本研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果顯示，X射線輻射抑制A549細(xì)胞mtFAM蛋白的表達(dá)，且抑制效果呈劑量依賴，表明X射線輻射對(duì)A549細(xì)胞線粒體膜相關(guān)蛋白mtFAM具有抑制作用。電離輻射會(huì)對(duì)線粒體形態(tài)及功能造成影響，同時(shí)也會(huì)使mtDNA發(fā)生斷裂。研究[10-11]表明，mtDNA與核DNA(nuclear DNA,nDNA)斷裂程度相同的情況下，nDNA的修復(fù)能力是mtDNA的4倍。有研究[12]表明，在低劑量輻射下，與nDNA比較，mtDNA對(duì)細(xì)胞氧化應(yīng)激更敏感。mtFAM是一種核基因編碼的多功能mtDNA蛋白，參與mtDNA的轉(zhuǎn)錄、翻譯及修復(fù)功能，以此來(lái)維持線粒體穩(wěn)定[13]。然而，另有研究[14]發(fā)現(xiàn)，A549細(xì)胞經(jīng)低劑量α粒子輻射后，mtFAM蛋白表達(dá)上調(diào)，這與本研究結(jié)果不一致，可能是劑量不同造成的差異。由此推斷，A549細(xì)胞經(jīng)低劑量X射線輻射后，mtFAM蛋白表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)損傷修復(fù)；而在高劑量X射線輻射后，mtFAM蛋白表達(dá)下調(diào)，是由于損傷程度超過(guò)A549細(xì)胞自身調(diào)節(jié)能力范圍，從而損傷修復(fù)能力減弱。此外，研究[15]表明，mtFAM蛋白下調(diào)，A549細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力減弱，增殖能力下降以及對(duì)阿霉素敏感性增強(qiáng)。mtFAM缺失會(huì)導(dǎo)致線粒體功能紊亂[16]。

綜上所述，本研究表明X射線輻射導(dǎo)致A549細(xì)胞線粒體受損，且通過(guò)抑制mtFAM蛋白表達(dá)，使線粒體的修復(fù)能力下降，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示mtFAM蛋白可能是調(diào)控線粒體的重要蛋白。本研究不足之處在于未進(jìn)行干預(yù)mtFAM蛋白及其相關(guān)信號(hào)通路的機(jī)制研究,未來(lái)實(shí)驗(yàn)中還有待進(jìn)一步深入研究。