余敏 崔躍 黎鵬飛 謝丹 陳芬

心肌組織在短時間內(nèi)供血或供養(yǎng)不足容易引起心血管疾病的發(fā)生，如中風(fēng)、急性心肌梗死和缺血性心臟病等[1,2]。心肌缺血再灌注損傷可以促進心肌細胞凋亡、炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激損傷[3,4]，這也是急性心肌梗死患者病死率較高的原因[5]。miRNA在心血管疾病中異常表達，可以參與細胞的增殖、凋亡、氧化應(yīng)激等生物學(xué)過程，進而參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展[6,7]。研究發(fā)現(xiàn)，抑制NPHP3-AS1通過調(diào)控下調(diào)miR305p減緩缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞細胞凋亡，促進心肌細胞的增殖[8]。組蛋白去乙?；?(HDAC9)在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的神經(jīng)細胞中表達水平升高，抑制HDAC9表達可以減緩缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)引起的神經(jīng)細胞凋亡和炎性損傷[9]。通過生物信息學(xué)網(wǎng)預(yù)測miR-30a-5p和HDAC9可能存在結(jié)合互補位點，但筆者發(fā)現(xiàn)miR-30a-5p是否調(diào)控HDAC9對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞氧化應(yīng)激損傷尚不明確，本研究通過建立缺氧復(fù)氧心肌細胞H9c2模型，探討miR-30a-5p通過調(diào)控HDAC9對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡和氧化應(yīng)激的影響。報告如下。

1 材料與方法

1.1 細胞與試劑 大鼠心肌細胞H9c2購自中國科學(xué)院上海細胞庫；10%胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒、Trizol試劑盒購自美國Invitrogen公司；miR-NC、miR-30a-5p、si-NC、si-HDAC9、pcDNA和HDAC9序列和引物均購自上海吉瑪制藥公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自日本TaKaRa公司；凋亡試劑盒、BCA試劑盒、ECL試劑盒、雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自北京索萊寶公司；HDAC9抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體和GAPDH抗體購自美國Abcam公司；超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)和乳酸脫氫酶(LDH)檢測試劑盒購自南京建成生物研究所。

1.2 細胞培養(yǎng)與分組 心肌細胞H9c2復(fù)蘇后，在含有10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基內(nèi)，置于培養(yǎng)箱內(nèi)溫度為37℃、飽和濕度為5% CO2條件下常規(guī)培養(yǎng)細胞傳代。取對數(shù)生長期的心肌細胞H9c2，將細胞分組：對照組(Control組)：正常條件培養(yǎng)心肌細胞H9c2；缺氧復(fù)氧組(H/R組)：在培養(yǎng)箱內(nèi)設(shè)置95% N2、5% CO2進行缺氧條件培養(yǎng)12 h，倒掉培養(yǎng)液，然后在培養(yǎng)箱為37℃、20% O2、5% CO2繼續(xù)培養(yǎng)4 h，建立心肌細胞H9c2的缺氧復(fù)氧模型。按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書的操作步驟將miR-NC、miR-30a-5p、si-NC、si-HDAC9、miR-30a-5p+pcDNA、miR-30a-5p+HDAC9轉(zhuǎn)染至心肌細胞H9c2內(nèi)，6 h后進行缺氧復(fù)氧處理，分別記為H/R+miR-NC組、H/R+miR-30a-5p組、H/R+si-NC組、H/R+si-HDAC9組、H/R+miR-30a-5p+pcDNA組、H/R+miR-30a-5p+HDAC9組，繼續(xù)培養(yǎng)48 h進行后續(xù)實驗。

1.3 qRT-PCR檢測miR-30a-5p和HDAC9 mRNA表達 收集各組生長對數(shù)期的心肌細胞H9c2，加入Trizol試劑提取各組細胞的總RNA，在分光光度計先檢測細胞濃度和純度，然后按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書步驟嚴格進行逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板按照熒光定量試劑盒說明書操作步驟，miR-30a-5p、HDAC9 mRNA分別以U6、GAPDH作為內(nèi)參進行PCR擴增，通過2-△△Ct法檢測miR-30a-5p和HDAC9 mRNA表達。

1.4 Western blot檢測HDAC9、Bax和Bcl-2蛋白表達 收集各組心肌細胞H9c2，加入蛋白裂解液用于提取細胞的總蛋白，采用BCA試劑盒檢測蛋白的濃度，沸水變性處理細胞。取35 μg蛋白樣品上樣凝膠電泳處理，結(jié)束后轉(zhuǎn)膜，用脫脂奶粉封閉處理，將膜轉(zhuǎn)移至一抗溶液內(nèi)，4℃過夜孵育，加入相應(yīng)二抗溶液，室溫孵育，按照ECL試劑盒說明書，顯影曝光，通過Quantity One軟件分析蛋白條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，計算目的蛋白的表達。

1.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡 收集各組心肌細胞H9c2，3 000 r/min離心5 min，離心后在培養(yǎng)內(nèi)調(diào)整細胞濃度為1×106/ml。在各組細胞內(nèi)加入500 μl結(jié)合緩沖液重懸細胞，然后繼續(xù)加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，嚴格按照凋亡試劑盒說明書，避光反應(yīng)10 min后，在流式細胞儀上檢測細胞凋亡率。

1.6 ELISA檢測SOD活性、MDA含量和LDH含量 取各組心肌細胞H9c2，離心后上清液，用于檢測SOD活性、MDA含量和LDH含量。具體操作步驟嚴格按照SOD、MDA和LDH檢測試劑盒進行。

1.7 雙熒光素酶報告基因檢測miR-30a-5p和HDAC9靶向關(guān)系 通過Star Base預(yù)測顯示miR-30a-5p和HDAC9存在結(jié)合位點，然后構(gòu)建HDAC9 3’UTR的野生型載體(HDAC9 3’UTR-wt)和突變型載體(HDAC9 3’UTR-mut)。取對數(shù)生長期的心肌細胞H9c2，按照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書將HDAC9 3’UTR-wt和HDAC9 3’UTR-mut分別于miR-NC或miR-30a-5p轉(zhuǎn)染至心肌細胞H9c2。最后按照雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒的說明書檢測熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 miR-30a-5p和HDAC9在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細胞H9c2中的表達 與Control組比較，H/R組的心肌細胞中miR-30a-5p表達顯著降低(P<0.05)，HDAC9 mRNA和蛋白表達水平顯著增加(P<0.05)。見表1，圖1。

表1 miR-30a-5p和HDAC9在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細胞H9c2中的表達

圖1 HDAC9在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細胞H9c2中的表達

2.2 過表達miR-30a-5p對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細胞H9c2凋亡和氧化應(yīng)激的影響 與Control組比較，H/R組的心肌細胞中miR-30a-5p表達、Bcl-2蛋白表達和SOD活性均顯著降低(P<0.05)，而細胞凋亡率、Bax蛋白表達、MDA含量和LDH含量均顯著增加(P<0.05)；與H/R+miR-NC組比較，H/R+miR-30a-5p組的心肌細胞中miR-30a-5p表達、Bcl-2蛋白表達和SOD活性均顯著增加(P<0.05)，而細胞凋亡率、Bax蛋白表達、MDA含量和LDH含量均顯著降低(P<0.05)。見圖2，表2。

圖2 過表達miR-30a-5p對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細胞H9c2凋亡的影響；A 細胞凋亡率；B Bax和Bcl-2蛋白表達

表2 過表達miR-30a-5p對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細胞H9c2凋亡和氧化應(yīng)激的影響

2.3 miR-30a-5p調(diào)控HDAC9的表達 與miR-NC組比較，miR-30a-5p組中HDAC9 3’UTR-wt熒光素酶活性顯著降低(P<0.05)，而HDAC9 3’UTR-mut熒光素酶活性沒有任何變化(P>0.05)。與anti-miR-N組比較，anti-miR-30a-5p組中miR-30a-5p表達顯著降低(P<0.05)。與miR-NC組比較，miR-30a-5p組中HDAC9蛋白表達顯著降低(P<0.05)；與anti-miR-N組比較，anti-miR-30a-5p組中HDAC9蛋白表達顯著增加(P<0.05)。見圖3，表3、4。

圖3 miR-30a-5p調(diào)控HDAC9的表達;A miR-30a-5p和HDAC9存在結(jié)合位點；B miR-30a-5p調(diào)控HDAC9的表達

表3 雙熒光素酶報告實驗和anti-miR-30a-5p的轉(zhuǎn)染效率

2.4 干擾HDAC9對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細胞H9c2凋亡、氧化應(yīng)激的影響 與Control組比較，H/R組的心肌細胞中HDAC9蛋白表達、細胞凋亡率、Bax蛋白表達、MDA含量和LDH含量均顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而Bcl-2蛋白表達和SOD活性均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；與H/R+si-NC組比較，H/R+si-HDAC9組的心肌細胞中HDAC9蛋白表達、細胞凋亡率、Bax蛋白表達、MDA含量和LDH含量均顯著降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)；而Bcl-2蛋白表達和SOD活性均顯著增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。見圖4，表5。

表5 干擾HDAC9對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細胞H9c2凋亡、氧化應(yīng)激的影響

圖4 干擾HDAC9對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細胞H9c2凋亡的影響;A 細胞凋亡率；B HDAC9、Bax和Bcl-2蛋白表達

表4 miR-30a-5p調(diào)控HDAC9的表達

2.5 過表達HDAC9逆轉(zhuǎn)了miR-30a-5p對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細胞H9c2凋亡和氧化應(yīng)激的影響 與H/R+miR-NC組比較，H/R+miR-30a-5p組的心肌細胞中HDAC9蛋白表達、細胞凋亡率、Bax蛋白表達、MDA含量和LDH含量均顯著降低(P<0.05)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義；而Bcl-2蛋白表達和SOD活性均顯著增加(P<0.05)；與H/R+miR-30a-5p+pcDNA組比較，H/R+miR-30a-5p+HDAC9組的心肌細胞中HDAC9蛋白表達、細胞凋亡率、Bax蛋白表達、MDA含量和LDH含量均顯著增加(P<0.05)；而Bcl-2蛋白表達和SOD活性均顯著降低(P<0.05)。見圖5，表6。

圖5 過表達HDAC9逆轉(zhuǎn)了miR-30a-5p對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細胞H9c2凋亡的影響;A 細胞凋亡率；B HDAC9、Bax和Bcl-2蛋白表達

表6 過表達HDAC9逆轉(zhuǎn)了miR-30a-5p對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細胞H9c2凋亡和氧化應(yīng)激的影響

3 討論

微小RNA(miRNA)在心血管疾病中研究作用已經(jīng)獲得大量研究的認可，而且miRNA在心肌細胞凋亡和氧化應(yīng)激等研究過程中也備受關(guān)注[10]，其中miR-143、miR-519d-3p和miR-27a-3p等已被證明[11-13]。Liu等[14]研究結(jié)果顯示，缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細胞后，miRNA-15b表達顯著增加，過表達miRNA-15b明顯促進缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞的凋亡，這與本研究結(jié)果相反。Yang等[15]研究結(jié)果顯示，miR-22在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞中低表達，miR-22通過調(diào)控CBP/AP-1途徑減緩缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡和炎性損傷，進而起到保護心臟的作用。在急性心肌梗死構(gòu)建的缺氧模型中發(fā)現(xiàn)，miR-483-5p在缺氧誘導(dǎo)人心肌細胞中表達上調(diào)，過表達miR-483-5p明顯促進了缺氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡和氧化應(yīng)激，這與本研究結(jié)果相反[16]。miR-499-5p在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞中表達下調(diào)，過表達miR-499-5p明顯抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞凋亡和氧化應(yīng)激[17]，這與本研究結(jié)果相似。miR-30a-5p報道參與可腎臟損傷、心肌缺血和再灌注損傷模型[18,19]。本研究結(jié)果顯示，通過建立缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細胞H9c2模型，缺氧處理后明顯降低心肌細胞明顯促進心肌細胞的凋亡和氧化應(yīng)激水平，以及上調(diào)Bax蛋白表達，下調(diào)Bcl-2的表達；進一步研究結(jié)果顯示，miR-30a-5p在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞H9c2中低表達，過表達miR-30a-5p明顯抑制心肌細胞H9c2的凋亡和氧化應(yīng)激水平，以及下調(diào)Bax蛋白表達，上調(diào)Bcl-2的表達，這說miR-30a-5p參與了缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細胞H9c的氧化應(yīng)激損傷的作用。

HDAC9是HDACs家族成員的轉(zhuǎn)錄因子之一，位于7號染色體q21.1位置上，與酵母HAD-I樣酶具有高度的同源性，主要存在細胞核和細胞質(zhì)中[20,21]。HDAC9在多種癌癥中發(fā)揮著重要作用，且在動脈粥樣硬化和冠狀動脈中高表達[22,23]。研究結(jié)果顯示，HDAC9在缺血再灌注損傷模型中高表達，與缺血性腦卒中密切相關(guān)[24]。Shi等[25]研究發(fā)現(xiàn)，HDAC9在大鼠腦缺血/再灌注表達上調(diào)，轉(zhuǎn)染慢病毒HDAC9降低了腦部中風(fēng)的風(fēng)險；沉默HDAC9明顯抑制了OGD誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)和凋亡。本研究結(jié)果顯示，HDAC9 mRNA和蛋白表達在缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞H9c2中高表達，干擾HDAC9明顯抑制心肌細胞H9c2的凋亡和氧化應(yīng)激水平，以及下調(diào)Bax蛋白表達，上調(diào)Bcl-2的表達；通過生物信息學(xué)網(wǎng)站和雙熒光素酶實驗結(jié)果證實，miR-30a-5p可以靶向調(diào)控HDAC9表達，過表達HDAC9逆轉(zhuǎn)了miR-30a-5p對缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)心肌細胞H9c2凋亡和氧化應(yīng)激的作用，這說明miR-30a-5p通過靶向調(diào)控HDAC9抑制缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞H9c2凋亡和氧化應(yīng)激水平，對心肌細胞發(fā)揮保護作用。

綜上所述，過表達miR-30a-5p可以減緩缺氧復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細胞的凋亡和氧化應(yīng)激水平，其作用機制可能與HDAC9有關(guān)，起到保護心肌細胞的作用。