唐亮 陰敏 張海 肖燕 馬瑩瑩

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)發(fā)病率較高的惡性腫瘤，嚴(yán)重威脅女性生命健康，盡管隨著手術(shù)、放化療及靶向治療等綜合治療的進(jìn)步，宮頸癌診療有所改善，但對(duì)于晚期宮頸癌預(yù)后仍然很差[1]。宮頸癌發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及抑癌基因失活、癌基因激活等，因此，尋找影響宮頸癌發(fā)生發(fā)展機(jī)制有重要意義。越來(lái)越多研究表明，微小RNA(microRNA，miRNA)與宮頸癌發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2]。miRNA是一類內(nèi)源基因編碼的非編碼RNA，長(zhǎng)度約18-25nt，不翻譯蛋白，可通過(guò)與靶基因mRNA的3’UTR結(jié)合，抑制靶基因翻譯，從而在轉(zhuǎn)錄及轉(zhuǎn)錄后水平影響多種細(xì)胞功能[3]。在腫瘤中，miRNA可發(fā)揮癌基因或抑癌基因樣作用，與腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移等密切相關(guān)[4]。miR-411定位于染色體14q32，目前在肺癌、腎癌等腫瘤中有研究[5,6]，miR-411在宮頸癌中研究較少。有研究顯示，miR-411可通過(guò)靶向STAT3抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力[7]，但miR-411對(duì)宮頸癌細(xì)胞凋亡及機(jī)制研究尚未明確。因此，本研究旨在miR-411對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響，并進(jìn)一步研究其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 DMEM培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清、Opti-MEM培養(yǎng)基均購(gòu)自美國(guó)Gibco；Trizol、LipofectamineTM2000試劑盒購(gòu)自美國(guó)Invitrogen；miR-411 mimics及miR-NC、miR-411 inhibitor及anti-miR-NC、PIK3R3 siRNA及陰性對(duì)照siRNA、PIK3R3過(guò)表達(dá)載體及空載體均購(gòu)自蘇州吉瑪生物制劑有限公司；MTT及DMSO均購(gòu)自美國(guó)Sigma；Transwell小室、Matrigel膠、流式細(xì)胞儀均購(gòu)自美國(guó)BD；Annexin V-FITC/PI雙染法細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自南京凱基生物；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、ECL化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒均購(gòu)自中國(guó)碧云天；PIK3R3、PI3K、p-AKT、PCNA、 E-cadherin和cleaved caspase3均購(gòu)自美國(guó)Abcam；酶標(biāo)儀、RT-PCR儀均購(gòu)自美國(guó)Thermo公司。

1.2 細(xì)胞及培養(yǎng) 宮頸癌Caski、SiHa和C-33A細(xì)胞及正常宮頸上皮永生化細(xì)胞End1/E6E7均購(gòu)自美國(guó)ATCC。所有細(xì)胞使用含10% FBS的DMEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5%體積分?jǐn)?shù)CO2、37℃培養(yǎng)箱。觀察到細(xì)胞覆蓋瓶底80%～90%面積時(shí)，胰酶消化、傳代。傳代后每2天換液1次。選擇對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 收集、計(jì)數(shù)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa細(xì)胞，以2×105個(gè)/孔接種于6孔板，放置于5%體積分?jǐn)?shù)CO2、37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞達(dá)70%～80%融合度時(shí)可進(jìn)行轉(zhuǎn)染。參照LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染說(shuō)明，使用Opti-MEM培養(yǎng)基分別稀釋Lipo 2000、miR-411 mimics及miR-NC、miR-411 inhibitor及anti-miR-NC、PIK3R3 siRNA(si-PIK3R3)及陰性對(duì)照siRNA(si-NC)、PIK3R3過(guò)表達(dá)載體(pcDNA-PIK3R3)及空載體(pcDNA)請(qǐng)?zhí)峁┫嚓P(guān)圖片與數(shù)據(jù)。將稀釋后的各組細(xì)胞與Lipo 2000充分混勻，室溫條件下放置5 min，加入至6孔板相應(yīng)孔內(nèi)，放置于培養(yǎng)箱進(jìn)行轉(zhuǎn)染反應(yīng)，6 h 后，更換為完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 qRT-PCR檢測(cè)miR-411和PIK3R3表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染miR-411 mimics及PIK3R3 siRNA 48 h的SiHa細(xì)胞。Trizol法提取細(xì)胞總RNA，NanoDrop檢測(cè)RNA樣品濃度，選擇符合要求的RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，加入SYBR green染色，設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，按照熒光定量試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物由上海生工合成，miR-411基因上下游引物分別為：5’-GGGGTAGTAGACCGTATAG-3’，5’-TGCGTGTCGTGGAGTC-3’；U6基因上下游引物分別為：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’，5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’ ；PIK3R3基因上下游引物分別為：5’-CTTGCTCTGTGGTGGCCGAT-3’，5’-GACGTTGAGGGA GTCGTTGT-3’；GAPDH基因上下游引物分別為：5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。通過(guò)2-△△Ct法計(jì)算miR-411和PIK3R3 mRNA表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖 以5 000個(gè)/孔接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的SiHa細(xì)胞于96孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁，按照1.3方法進(jìn)行轉(zhuǎn)染，每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞，每孔加20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄掉上清，以150 μl/孔加DMSO溶液，混勻。酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)各孔的光密度值(OD值)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力 Transwell小室濾膜(8 μm孔徑)中添加50 μl的Matrigel混合液(Matrigel膠∶培養(yǎng)基=1∶6)，使混合液完全覆蓋濾膜，放置在37℃培養(yǎng)箱孵育2 h使Matrigel凝固。待Matrigel凝固后，在Transwell小室上室加100 μl無(wú)血清培養(yǎng)基，下室加600 μl無(wú)血清培養(yǎng)基，37℃平衡過(guò)夜。胰酶消化轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，PBS漂洗2次，計(jì)數(shù)。取1×105個(gè)細(xì)胞，100 μl無(wú)血清培養(yǎng)基重懸，后將細(xì)胞懸液添加至小室上室，下室加500 μl完全培養(yǎng)基。小室放置于培養(yǎng)箱常規(guī)孵育48 h，拭掉上室細(xì)胞，4%多聚甲醛固定20 min，0.1%結(jié)晶紫染色10 min，PBS洗滌2次。顯微鏡下隨機(jī)選擇5個(gè)視野，觀察穿過(guò)膜的細(xì)胞數(shù)，拍照，統(tǒng)計(jì)數(shù)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Annexin V-FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 依據(jù)細(xì)胞凋亡試劑盒說(shuō)明，胰酶消化轉(zhuǎn)染48 h的各組細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105個(gè)/ml，預(yù)冷PBS洗滌細(xì)胞，結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞。取100 μl細(xì)胞懸液，加入5 μl Annexin V-FITC和5 μl PI，避光室溫孵育15～20 min，加400 μl結(jié)合緩沖液，1 h內(nèi)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 構(gòu)建含miR-411和PIK3R3結(jié)合位點(diǎn)的PIK3R3野生型及突變型3’UTR 報(bào)告質(zhì)粒，命名為WT和MUT。接種SiHa細(xì)胞于24孔板，密度為5×104個(gè)/孔，放置于培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞達(dá)80%融合時(shí)，將WT/MUT的PIK3R3 3’UTR質(zhì)粒分別與miR-411 mimics和miR-NC共轉(zhuǎn)染至SiHa細(xì)胞，轉(zhuǎn)染參照Lipofectamine 2000說(shuō)明，每組設(shè)置3個(gè)重復(fù)孔。轉(zhuǎn)染48 h，檢測(cè)各組細(xì)胞熒光素酶活性。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 Western blotting檢測(cè)PIK3R3、PI3K、p-AKT、PCNA、 E-cadherin和cleaved caspase3表達(dá) 收集轉(zhuǎn)染miR-411 mimics/inhibitor 48 h的SiHa細(xì)胞，離心，在細(xì)胞沉淀中加適量RIPA裂解液，混勻，室溫在冰上放置30 min，4℃離心，收集上清，總蛋白在上清液中。BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。在蛋白中添加5×上樣緩沖液，100℃水浴10 min，離心，收集上清。凝膠上樣孔加40 μg蛋白，每孔等量蛋白，電泳后轉(zhuǎn)PVDF膜，轉(zhuǎn)好的膜放置在TBST液中清洗5 min，室溫條件將膜放置在5%脫脂奶粉中封閉1 h，TBST洗膜。膜放到經(jīng)封閉液稀釋的一抗中，4℃孵育過(guò)夜。TBST洗膜。膜放到經(jīng)封閉液稀釋的HRP標(biāo)記的二抗中，室溫孵育2 h。TBST洗膜，吸干膜上水分，在膜含蛋白面滴加ECL反應(yīng)液，暗室內(nèi)2 min，膜用保鮮膜覆蓋，暗室內(nèi)顯影。Quantity One軟件分析各抗體條帶灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 miR-411在宮頸癌細(xì)胞表達(dá) qRT-PCR檢測(cè)miR-411在不同宮頸癌細(xì)胞表達(dá)，結(jié)果顯示，miR-411在Caski、SiHa和C-33A細(xì)胞表達(dá)均明顯低于在End1/E6E7細(xì)胞表達(dá)(P<0.05)。選擇表達(dá)最低的SiHa細(xì)胞作為研究對(duì)象。見(jiàn)表1。

表1 miR-411在宮頸癌Caski、Sika和C-33A細(xì)胞表達(dá)

2.2 miR-411可靶向調(diào)節(jié)PIK3R3表達(dá) miR-411的5’UTR與PIK3R3的3’UTR存在7個(gè)連續(xù)的結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-411 mimics與PIK3R3野生型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，熒光素酶活性明顯降低(P<0.05)，而與PIK3R3突變型質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染，熒光素酶活性無(wú)明顯變化(P>0.05)。miR-411 mimics可明顯抑制PIK3R3表達(dá)，而miR-411 inhibitor可明顯促進(jìn)PIK3R3表達(dá)(P<0.05)。提示miR-411和PIK3R3存在靶向關(guān)系，miR-411可負(fù)調(diào)控PIK3R3表達(dá)。見(jiàn)表2，圖1。

表2 2組細(xì)胞熒光素酶活性

2.3 過(guò)表達(dá)miR-411對(duì)SiHa細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響 miR-411 mimics轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞48 h，miR-411表達(dá)明顯升高(P<0.05)。說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-411的SiHa細(xì)胞建立成功。細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-411 mimics組細(xì)胞OD值明顯降低，細(xì)胞侵襲數(shù)明顯降低，凋亡率明顯升高(P<0.05)。見(jiàn)圖2，表3。

圖2 過(guò)表達(dá)miR-411對(duì)SiHa細(xì)胞增殖、侵襲(A，×200)和凋亡(B)的影響

表3 過(guò)表達(dá)miR-411對(duì)SiHa細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡影響

2.4 抑制PIK3R3表達(dá)對(duì)SiHa細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響 與si-NC組比較，si-PIK3R3組PIK3R3表達(dá)明顯降低，細(xì)胞增殖及侵襲能力明顯降低，凋亡率升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)圖3，表4。

圖3 抑制PIK3R3表達(dá)對(duì)SiHa細(xì)胞增殖、侵襲(A,×200)和凋亡(B)影響

表4 抑制PIK3R3表達(dá)對(duì)SiHa細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡影響

2.5 過(guò)表達(dá)PIK3R3可逆轉(zhuǎn)miR-411對(duì)SiHa細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡影響 各組細(xì)胞增殖、細(xì)胞侵襲數(shù)及細(xì)胞凋亡率檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-411 mimics組和miR-411 mimics+pcDNA組細(xì)胞增殖和細(xì)胞侵襲數(shù)明顯降低，細(xì)胞凋亡率明顯升高(P<0.05)，與miR-411 mimics+pcDNA組比較，miR-411 mimics+pcDNA-PIK3R3組細(xì)胞增殖和細(xì)胞侵襲數(shù)明顯升高，細(xì)胞凋亡率明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)圖4，表5。

圖4 過(guò)表達(dá)PIK3R3可逆轉(zhuǎn)miR-411對(duì)SiHa細(xì)胞增殖、侵襲(A,×200)和凋亡(B)影響

表5 5轉(zhuǎn)染細(xì)胞OD值、細(xì)胞侵襲數(shù)及細(xì)胞凋亡率

2.6 過(guò)表達(dá)miR-411對(duì)PI3K、p-AKT、PCNA、 E-cadherin和cleaved caspase3表達(dá)的影響 Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，與miR-NC組比較，miR-411 mimics組PI3K、p-AKT和PCNA表達(dá)均明顯降低(P<0.05)， E-cadherin和cleaved caspase3表達(dá)均明顯升高(P<0.05)；與miR-411 mimics+pcDNA組比較，miR-411 mimics+pcDNA-PIK3R3組PI3K、p-AKT和PCNA表達(dá)均明顯升高(P<0.05)， E-cadherin和cleaved caspase3表達(dá)均明顯降低(P<0.05)。見(jiàn)表6，圖5。

表6 4組細(xì)胞PI3K、p-AKT、PCNA、 E-cadherin和cleaved caspase3蛋白相對(duì)表達(dá)量

3 討論

作為一類非編碼RNA，miRNA可通過(guò)調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)，從而參與細(xì)胞死亡、細(xì)胞分化、細(xì)胞代謝等多個(gè)生理過(guò)程。已有研究表明，miRNA與心血管疾病、癌癥、糖尿病等多種人類疾病密切相關(guān)[8-10]。有研究顯示，宮頸癌可引起miRNA表達(dá)失調(diào)，如Pereira等[11]通過(guò)對(duì)miRNA表達(dá)譜分析，發(fā)現(xiàn)在宮頸鱗癌組織中有31個(gè)異常表達(dá)的miRNA，這些miRNA可作為宮頸鱗癌診療標(biāo)志物。已有多項(xiàng)研究表明，miR-411與腫瘤生長(zhǎng)有關(guān)，如Zhang等[12]研究顯示，過(guò)表達(dá)miR-411可抑制腎癌細(xì)胞增殖和侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。Chen等[13]研究顯示，miR-411可通過(guò)調(diào)節(jié)DSLC27A2影響卵巢癌化療敏感性。Zhang等[14]研究顯示，miR-411-5p可通過(guò)靶向GRB2抑制乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移。本研究檢測(cè)結(jié)果顯示，miR-411在乳腺癌細(xì)胞表達(dá)明顯降低，過(guò)表達(dá)miR-411可明顯抑制SiHa細(xì)胞增殖和侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，其中的細(xì)胞增殖和侵襲結(jié)果與既往研究結(jié)果[7]一致。

磷脂酰肌醇-3激酶調(diào)節(jié)亞基3(PIK3R3)是PI3K重要的調(diào)節(jié)亞基，已有研究報(bào)道其在包括宮頸癌在內(nèi)的多種腫瘤中高表達(dá)，其表達(dá)有促進(jìn)腫瘤增殖、轉(zhuǎn)移及化療抵抗等功效[15,16]。有研究顯示，miR-212可靶向PIK3R3抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的活力和侵襲能力[17]；miR-511可靶向PIK3R3抑制肝癌細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移[18]。也有研究表明，miR-411可靶向PIK3R3抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡[19]。本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)及miR-411mimics/inhibitor對(duì)PIK3R3表達(dá)影響，證明miR-411可靶向負(fù)調(diào)控PIK3R3表達(dá)。抑制PIK3R3表達(dá)可明顯降低SiHa細(xì)胞增殖和侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而過(guò)表達(dá)PIK3R3可減弱miR-411對(duì)細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡的影響。提示miR-411可靶向抑制PIK3R3抑制宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

PI3K/AKT信號(hào)通路是一條與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號(hào)途徑，在包括宮頸癌在內(nèi)的多種腫瘤中被激活[20,21]，研究表明，抑制該信號(hào)通路是有效的抗腫瘤手段[22]。AKT是PI3K的下游分子，其活化后可通過(guò)調(diào)節(jié)PCNA、E-cadherin、caspase3等基因表達(dá)，從而影響細(xì)胞的生長(zhǎng)、增殖等過(guò)程[23]。PCNA與DNA合成密切相關(guān)，其表達(dá)高低可反映細(xì)胞增殖狀態(tài)，有研究顯示，PIK3R3可通過(guò)其NH2末端與RBI和PCNA互作，從而發(fā)揮癌基因功能。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是引起惡性腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵步驟，E-cadherin是EMT的標(biāo)志蛋白，有研究顯示，PIK3R3可通過(guò)ZEB1介導(dǎo)的EMT促進(jìn)胰腺癌轉(zhuǎn)移[24]。caspase3是凋亡相關(guān)的caspase家族關(guān)鍵酶，其活化可促進(jìn)細(xì)胞凋亡[25]。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-411可抑制PI3K、p-AKT和PCNA表達(dá)，促進(jìn) E-cadherin和cleaved caspase3表達(dá)；而過(guò)表達(dá)PIK3R3可逆轉(zhuǎn)miR-411對(duì)PI3K、p-AKT、PCNA、 E-cadherin和cleaved caspase3表達(dá)的影響。有研究顯示，miR-365可靶向PIK3R3抑制AKT/mTOR信號(hào)通路，從而降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和遷移能力[26]。提示miR-411可靶向PIK3R3抑制PI3K/AKT信號(hào)通路，從而抑制宮頸癌細(xì)胞生長(zhǎng)。

綜上所述，miR-411在宮頸癌細(xì)胞低表達(dá)，過(guò)表達(dá)miR-411可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，提示miR-411/PIK3R3在宮頸癌發(fā)病中有一定作用，有望成為宮頸癌治療的潛在靶點(diǎn)。