鐘曉芃,郭義

(1.天津市人民醫(yī)院,天津 300121;2.天津中醫(yī)藥大學,天津 301617)

隨著診療技術的提高,心臟驟?；颊叩玫搅撕芎玫木戎蝃1]。但是部分患者雖然恢復了心跳、呼吸和血壓,往往遺留神經(jīng)功能障礙,甚至昏迷及腦死亡,被稱為心肺復蘇后腦損傷[2],嚴重影響了患者的生活質量,并造成巨大的社會負擔[3],因此目前更加重視復蘇后神經(jīng)功能的保護[4]。亞低溫作為目前唯一推薦的治療手段[5],技術復雜不便于推廣[6]。

十二井穴刺絡放血用于急救在我國有著悠久的歷史,其簡捷、高效,長于院外急救、自救及他救,彌補了現(xiàn)代醫(yī)學的不足。明代朱權所撰《乾坤生意》:“凡中風跌倒,卒暴昏沉、痰涎壅滯、不省人事、牙關緊閉、藥水不下,急以三棱針,刺手十指十二井穴,當去惡血,治一切暴死惡候,不省人事,及絞腸痧,乃起死回生妙訣”,現(xiàn)代研究中也發(fā)現(xiàn)該療法對于卒中[7-8]、顱腦外傷[9]及一氧化碳中毒[10]造成的神經(jīng)功能障礙有著良好的治療作用。

然而手十二井穴刺絡放血對心肺復蘇后腦損傷是否有治療作用尚未見報道。本研究觀察了手十二井穴刺絡放血對于心臟驟停復蘇后大鼠神經(jīng)功能障礙評分及大腦海馬區(qū)神經(jīng)細胞壞死凋亡的干預作用,及其對血清白細胞介素6(interleukin-6, IL-6)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)水平的調(diào)節(jié),現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF級SD雄性大鼠18只,體質量(340±50)g,購自北京維通利華實驗動物有限公司,許可證號為SCXK(京)2016-0006,飼養(yǎng)于天津易生源生物科技有限公司動物實驗室溫度18～22 ℃,濕度50%～60%。本實驗經(jīng)天津市人民醫(yī)院實驗動物倫理委員會審批同意。18只大鼠隨機分為假手術組、模型組和井穴組3組,每組6只。

1.2 主要試劑與儀器

腎上腺素(天津金耀藥業(yè)有限公司,國藥準字H12020526),大鼠IL-6 ELISA酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(宸功生物, CGE20064),大鼠TNF-α ELISA酶聯(lián)免疫檢測試劑盒(Peprotech, 315-01A),原位細胞凋亡檢測試劑盒(ROCHE, 11684817910),光學顯微鏡(日本奧林巴斯BX51T-PHD-J11)。

1.3 造模方法

大鼠誘導心臟驟停及心肺復蘇(cardiopulmonary resuscitation, CPR)方法依照Utstein動物CPR實驗指南[11]。SD大鼠術前禁食但不禁水,戊巴比妥鈉45 mg/kg腹腔內(nèi)麻醉,備皮,仰臥位固定。經(jīng)口直視插入14號氣管鞘管。左股動脈置入23號PE-50聚乙烯管,并使用SIEMENS Siredoc220多功能生理監(jiān)測儀監(jiān)測動脈血壓,心電圖和直腸溫度。手術完成后,待大鼠生理參數(shù)穩(wěn)定開始夾閉氣管插管,觀察大鼠呼吸、心搏和血壓,心搏停止以動脈收縮壓＜20 mmHg(1 mmHg＝0.133 kPa)作為心臟驟停標準。心搏驟停后開始進行心肺復蘇,頻率為 200次/min的胸外按壓和100次/min的同步機械通氣,按壓深度為胸廓前后徑的1/3,吸入氧濃度100%。按壓2 min后,予腎上腺素0.025 mg/kg靜脈注射,持續(xù)按壓通氣10 min,期間如出現(xiàn)室顫,立即給予 2J的雙向波除顫,如自主循環(huán)恢復(restoration of spontaneous circulation, ROSC)則停止按壓,10 min未恢復自主循環(huán)宣布復蘇失敗。ROSC定義為恢復室上性心律,平均動脈壓(MAP)＞60 mmHg,維持5 min以上。復蘇成功的動物連續(xù)監(jiān)測血流動力學 1 h,術畢拔除所有插管,蘇醒后放回籠中飼養(yǎng),使用自制保溫設備使動物肛溫保持在 36.5 ℃左右。

1.4 干預方法

假手術組只行氣管插管,不誘導心臟驟停和 CPR;模型組采用氣管夾閉窒息法誘導心臟驟停后進行常規(guī)CPR;井穴組采用氣管夾閉窒息法誘導心臟驟停后進行常規(guī)CPR,復蘇后1 h、24 h、48 h進行前肢十二井穴放血。十二井穴放血參考《實驗針灸學》[12]在心肺復蘇后腦損傷模型建立后1 h后,將采血針垂直插入皮膚,兩側取穴的末端深度為 1 mm,以少商、商陽、中沖、關沖、少沖、少澤的順序。參考《實驗針灸學》[12]動物腧穴定位及既往文獻[9],每個穴位分別擠壓3～5次,出血量為 15～20 μL。假手術組和模型組的大鼠以相同的強度抓握,而穴位不刺血。

1.5 樣本采集

復蘇后6 h、24 h、48 h、72 h經(jīng)鼠尾靜脈取血0.5 mL,置4 ℃ 1 500 r/min離心15 min,分離血清,-20 ℃冰箱保存待測。72 h后迅速斷頭取腦,剝離左右大腦半球,常規(guī)脫水石蠟包埋,切片至出現(xiàn)海馬組織,每隔5張留取1張。

1.6 觀測指標

1.6.1 血壓和平均動脈壓檢測

左股動脈置入 23號 PE-50聚乙烯管,并使用SIEMENS Siredoc220多功能生理監(jiān)測儀監(jiān)測動脈血壓和心率。

1.6.2 神經(jīng)功能缺陷評分

在大鼠復蘇后6 h、24 h、48 h及72 h被處死之前進行評估。神經(jīng)缺陷評分范圍為0～80(80表示正常大腦功能),是基于喚醒,神經(jīng)系統(tǒng)反射,運動功能和簡單行為反射的測試。每組大鼠根據(jù)神經(jīng)功能缺陷評分表獨立評分,取平均值,獲得最終的神經(jīng)缺陷分數(shù)[13]。

1.6.3 尼氏染色

將 5 μm石蠟切片常規(guī)脫蠟。用移液器在組織上滴加適量尼氏染液,染色8 min,ddH2O溶液洗滌2次,每次 30 s。再將切片分別置于 95%乙醇溶液Ⅰ、95%乙醇溶液Ⅱ、二甲苯溶液Ⅰ、二甲苯溶液Ⅱ中脫水透明,最后滴加中性樹膠,用蓋玻片封片。待自然風干后在光學顯微鏡觀察拍照。

1.6.4 TUNEL法檢測大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡

取海馬組織使用4%甲醛溶液固定24 h,石蠟包埋,切片,按照原位細胞凋亡檢測試劑盒說明書行 TUNEL檢測。每組大鼠取6張切片,顯微鏡下觀察大腦皮層神經(jīng)元的形態(tài),胞核成深棕色的細胞即為凋亡細胞,根據(jù)SOSLOW RA[14]方法計算凋亡指數(shù)。

1.6.5 血清IL-6、TNF-α水平檢測

血液自然凝固后以3 000 r/min離心10 min,取上清液,-20 ℃冷藏。采用ELISA法檢測血清IL-6、TNF-α水平。嚴格按照試劑盒說明書操作步驟進行操作,最后用普朗 DNM-9602酶標儀進行檢測,以空白孔調(diào)零,450 nm波長測每孔OD值。

1.7 統(tǒng)計學方法

采用 GraphPad Prism 8.0.1軟件進行統(tǒng)計學分析。符合正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示,對于不同時間點數(shù)據(jù)采用重復測量方差分析,其他數(shù)據(jù)采用單因素方差分析(OneWay-ANOVA),組間兩兩比較采用Tukey's檢驗。以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 3組大鼠心率和平均動脈壓的改變

復蘇前 3組大鼠心率及平均動脈壓比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。復蘇后6 h、24 h、48 h與假手術組比較,模型組和井穴組大鼠心率和平均動脈壓均下降,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),至復蘇后 72 h與假手術組比較,井穴組平均動脈壓比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),與模型組比較,井穴組平均動脈壓升高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。詳見表1。

表1 3組大鼠不同時間點心率和平均動脈壓水平比較 (±s)

表1 3組大鼠不同時間點心率和平均動脈壓水平比較 (±s)

注:與假手術組比較 1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

項目 組別 n 復蘇前 6 h 24 h心率(次/分)假手術組 6 317.33±11.81 343.83±17.82 342.67±14.27模型組 6 335.67±15.46 194.50±13.171) 219.67±15.111)井穴組 6 338.17±13.53 213.67±10.231) 250.00±12.151)2)平均動脈壓(mmHg)假手術組 6 106.67±9.18 104.17±8.68 104.00±8.12模型組 6 104.67±7.20 71.67±7.841) 80.17±11.021)井穴組 6 106.33±9.37 86.50±4.371) 90.33±4.381)48 h 72 h 334.50±20.36 333.67±11.47 252.00±15.521) 274.00±19.781)261.67±14.401) 288.67±11.271)101.50±9.14 105.00±8.32 83.33±9.071) 90.00±2.371)90.67±4.321) 105.17±7.332)

2.2 3組大鼠神經(jīng)缺陷分數(shù)的變化

復蘇前各組大鼠神經(jīng)功能缺陷評分比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05)。復蘇后與假手術組比較,模型組和井穴組經(jīng)功能缺陷評分均顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。其中6 h最為明顯,至72 h與假手術組比較,井穴組神經(jīng)功能缺陷評分比較,差異無統(tǒng)計學意義(P＞0.05),而模型組顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。詳見表2。

表2 3組大鼠復蘇不同時間點神經(jīng)功能缺陷評分水平比較 (±s,分)

表2 3組大鼠復蘇不同時間點神經(jīng)功能缺陷評分水平比較 (±s,分)

注:與假手術組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

組別 n 復蘇前 6 h 24 h 48 h 72 h假手術組 6 77.75±1.08 78.00±0.71 78.25±0.82 78.00±0.89 78.33±1.17模型組 6 78.25±0.76 29.83±3.721) 41.83±3.371) 48.33±5.791) 58.17±2.111)井穴組 6 78.00±1.14 33.25±2.141) 45.83±1.371)2) 56.7±2.701)2) 74.58±5.302)

2.3 3組大鼠海馬神經(jīng)細胞尼氏染色觀察

甲苯胺藍染色顯示,假手術組大鼠海馬神經(jīng)元細胞胞質內(nèi)可見深藍色斑塊狀或虎斑樣尼氏體,細胞核大,核仁明顯;模型組大鼠海馬神經(jīng)元細胞胞質內(nèi)尼氏小體固縮壞死,溶解、液化后形成空泡樣結構;與模型組比較,井穴組大鼠腦組織神經(jīng)元水腫較輕,神經(jīng)元形態(tài)較好,僅見少量空泡樣改變,有部分神經(jīng)元細胞核腫大,核仁消失。詳見圖1。

圖1 3組大鼠海馬神經(jīng)細胞尼氏染色觀察(×400)

2.4 3組大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡情況

復蘇72 h后與假手術組比較,模型組和井穴組凋亡指數(shù)顯著增高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05);與模型組比較,井穴組凋亡指數(shù)顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。詳見圖2、圖3。

圖2 3組大鼠海馬神經(jīng)細胞凋亡情況觀察(TUNEL法染色,×400)

圖3 3組大鼠凋亡指數(shù)比較

2.5 3組大鼠復蘇不同時間點血清IL-6、TNF-α水平比較

隨著復蘇時間延長,模型組和井穴組血清 IL-6、TNF-α水平均呈先升高后降低的趨勢,IL-6于復蘇后24 h達峰值,TNF-α于復蘇后 48 h達峰值,復蘇后72 h均降低。自復蘇后6 h開始,與假手術組比較,模型組和井穴組血清IL-6、TNF-α水平顯著增高,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05)。與模型組比較,井穴組血清IL-6于復蘇后24 h、72 h,血清TNF-α于復蘇后24 h、48 h、72 h均顯著降低,差異有統(tǒng)計學意義(P＜0.05),兩組在實驗結束時血清 IL-6、TNF-α均未恢復到正常水平。詳見表3。

表3 3組大鼠復蘇不同時間點血清IL-6和TNF-α水平比較 (±s, ng/L)

表3 3組大鼠復蘇不同時間點血清IL-6和TNF-α水平比較 (±s, ng/L)

注:與假手術組比較1)P＜0.05;與模型組比較2)P＜0.05

項目 n 組別 復蘇前 6 h 24 h 48 h 72 h IL-6 6 假手術組 20.98±0.99 20.94±1.02 21.64±0.87 21.70±0.95 21.78±1.37 6 模型組 20.94±1.02 63.57±4.161) 94.94±6.421) 80.79±3.291) 70.97±3.801)6 井穴組 21.00±2.23 62.50±3.231) 86.05±9.551)2) 75.78±6.881) 62.1±10.131)2)TNF-α 6 假手術組 19.21±2.00 18.32±1.39 18.65±2.02 17.41±1.68 17.48±2.31 6 模型組 17.50±1.23 47.50±2.511) 58.90±2.231) 88.82±2.111) 68.65±4.241)6 井穴組 17.93±2.39 43.19±3.411) 50.86±5.591)2) 77.68±8.411)2) 61.85±8.021)2)

3 討論

《醫(yī)宗金鑒》指出:“商陽主刺卒中風,暴仆昏沉痰涎壅,少商、中沖、關沖、少澤、商陽,使氣血流行,乃起死回生救急之妙穴?！毙呐K驟停在中醫(yī)學屬于“厥癥”范疇,基本病機為氣血陰陽不相順接,陰陽離絕[15]。經(jīng)心肺復蘇呼吸循環(huán)恢復后患者氣血陰陽初復,氣血運行無力,易出現(xiàn)瘀血痰濁上蒙清竅,故仍昏迷不醒?！鹅`樞·九針十二原》:“病在臟者,取之井。”手十二井穴位于手三陰三陽經(jīng)交匯處刺絡放血可調(diào)整陰陽,開竅醒神[16]。此時應用手十二井穴刺絡放血可續(xù)接陰陽,活血祛瘀,化痰開竅,促進患者蘇醒,神經(jīng)功能恢復。

本研究采用經(jīng)典窒息法[17]誘導心跳驟停,制作復蘇后腦損傷動物模型,與假手術組相比模型組心率及血壓降低、神經(jīng)功能評分減少、大腦海馬區(qū)凋亡細胞明顯增多,尼氏染色顯示海馬區(qū)神經(jīng)元細胞壞死溶解液化明顯增多,提示造模成功。而手十二井穴刺絡放血組與模型組比較心率及血壓升高、神經(jīng)功能評分增高,大腦海馬區(qū)尼氏染色顯示神經(jīng)元細胞壞死溶解液化減少,TUNEL法檢測凋亡細胞明顯減少,提示手十二井穴刺絡放血對復蘇后腦損傷有明顯的防治作用。

研究表明心跳驟停復蘇成功后,機體經(jīng)歷了缺血再灌注過程,復蘇后全身各臟器的再灌注損傷產(chǎn)生大量氧自由基、乳酸、花生四烯酸的代謝產(chǎn)物等炎性介質,導致全身的炎癥反應[18-19],心臟驟停1 h后,血液中細胞因子 IL-6和 TNF-α會迅速升高[20-22]。TNF-α可以誘導白細胞介素和次級炎癥介質的合成,高表達時會產(chǎn)生嚴重的神經(jīng)毒性[23-24],IL-6可引起神經(jīng)系統(tǒng)的損傷[25],引起中樞神經(jīng)細胞發(fā)生調(diào)亡[26],有研究表明手十二井穴刺絡放血可調(diào)節(jié)患者血清 IL-6、TNF-α水平治療丘腦梗死神經(jīng)后遺癥[27-28]。本研究結果提示,大鼠心跳驟停復蘇后6 h、24 h、48 h、72 h時血液中細胞因子IL-6和TNF-α與假手術組相比明顯升高。其中6 h升高最為明顯,與之對應的神經(jīng)功能缺陷評分也最低。而井穴組與模型組相比,血清IL-6和TNF-α水平減少,海馬區(qū)神經(jīng)元凋亡細胞減少,神經(jīng)功能恢復較好,且差別有統(tǒng)計學意義,這表明手十二井穴刺絡放血能夠減少炎性細胞因子的升高,減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷,改善心肺復蘇后神經(jīng)功能障礙。因此本研究認為減輕心臟驟停后機體炎癥反應可能是手十二井穴刺絡放血防治復蘇后腦損傷的機制之一。