楊曉藝 王聰 鹿錦浩 呂紹芝 林海東 裴玉賀

摘要：為了研究MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能及其對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)，本研究對(duì)玉米自交系遼3162三葉期幼苗進(jìn)行干旱和鹽脅迫處理，克隆ZmMYB2基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，探究該基因在脅迫條件下的表達(dá)。該基因開放閱讀框長(zhǎng)1233bp，編碼410個(gè)氨基酸，具有多個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，為MYB轉(zhuǎn)錄因子。經(jīng)生物信息學(xué)分析推測(cè)ZmMYB2蛋白分子量為46.08kDa，等電點(diǎn)為6.38，屬于親水性酸性非分泌蛋白，具有2個(gè)MYB保守結(jié)構(gòu)域，定位在細(xì)胞核內(nèi)，與高粱、南荻的親緣關(guān)系較近。qRT-PCR結(jié)果表明，該基因在玉米葉片中的表達(dá)量最高，具有組織特異性，且能響應(yīng)干旱和鹽等非生物脅迫。初步判斷該基因?qū)τ衩椎姆巧锩{迫應(yīng)答起著重要作用。

關(guān)鍵詞：玉米;ZmMYB2;基因克隆;脅迫應(yīng)答;生物信息學(xué)分析;基因表達(dá)

MYB轉(zhuǎn)錄因子家族是一類DNA結(jié)合蛋白，在植物次生生長(zhǎng)發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)控和抗逆生理等方面有著重要作用。1987年P(guān)azAres等從玉米中發(fā)現(xiàn)并克隆了植物中第一個(gè)參與花青素合成的MYB基因ZmMYB2C1[1]，此后隨著研究的深入，越來(lái)越多的該家族成員被挖掘出來(lái)。MYB轉(zhuǎn)錄因子家族成員具有相似的結(jié)構(gòu)，完整的MYB蛋白由三部分組成：MYB結(jié)構(gòu)域、轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域和負(fù)調(diào)控結(jié)構(gòu)域。MYB結(jié)構(gòu)域位于MYB蛋白的N-末端，含有約52個(gè)氨基酸殘基[2]。MYB蛋白通常包含1～4個(gè)保守的MYB結(jié)構(gòu)域，根據(jù)MYB結(jié)構(gòu)域的數(shù)量分為4類———1R-MYB、2RMYB、3R-MYB、4R-MYB[3]。其中2R-MYB中的R2R3-MYB蛋白是高等植物所獨(dú)有的，由在N端高度保守的MYB域和在C端高度可變的C端域組成[4]，具有多種功能，是目前研究最廣泛的MYB蛋白，僅在被子植物基因組中就有超過(guò)100個(gè)成員[5]。

盡管MYB蛋白顯示出高度的結(jié)構(gòu)相似性，但來(lái)自不同物種或生物體的相似蛋白之間卻存在明顯的功能差異。例如，在煙草中過(guò)表達(dá)BpMYB4可以誘導(dǎo)一些木質(zhì)素生物合成基因的表達(dá)，導(dǎo)致次生壁增厚[6]。在擬南芥中過(guò)表達(dá)AtMYB75基因也會(huì)導(dǎo)致木質(zhì)素積累的輕微增加，參與木質(zhì)素生物合成的調(diào)控;AtMYB3R1和AtMYB3R4基因可以激活KNOLLE基因的表達(dá)，從而在核分裂中起到積極的調(diào)節(jié)作用;AtMYB88和AtMYB124基因可以控制細(xì)胞周期和細(xì)胞分化過(guò)程;AtMYB24、AtMYB57、AtMYB80等基因?qū)ㄋ幒突ǚ哿５陌l(fā)育起重要作用[7]。RgMYB10基因能促進(jìn)合成毛蕊花糖苷[8]，ZmMYB48能調(diào)控植物對(duì)干旱脅迫的防御[9]，ZmMYB268在植物抵御高溫方面起重要作用[10]。

本研究以玉米自交系遼3162幼苗為試材，對(duì)ZmMYB2基因進(jìn)行克隆并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過(guò)模擬鹽脅迫和干旱脅迫，研究其在非生物脅迫下的表達(dá)情況，旨在為玉米抗逆育種提供基因資源，為探究MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控非生物脅迫的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

取玉米自交系遼3162種植在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)培養(yǎng)室內(nèi)，培養(yǎng)條件為（25±2）℃、16h光照/8h黑暗、相對(duì)濕度70%，培養(yǎng)至三葉一心時(shí)進(jìn)行鹽和干旱脅迫處理，分別用250mmol/L的NaCl溶液和20%的PEG-6000溶液澆灌幼苗，分別在處理0、6、12、24、48h采集玉米幼嫩的根、莖、葉，于-80℃冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2RNA提取及cDNA合成

使用TaKaRaMiniBESTPlantRNAExtractionKit（TaKaRa公司），從三葉期幼苗組織中提取RNA。用超微量分光光度計(jì)（Nanodrop2000，美國(guó)）對(duì)提取的總RNA濃度和純度進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)一步檢測(cè)RNA質(zhì)量。采用HiScriptⅡQRTSuperMixforqPCR（+gDNAwiper）試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）進(jìn)行cDNA第一鏈的合成。

1.3ZmMYB2基因的克隆

用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物。以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的cDNA為模板，利用高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行1%的瓊脂糖凝膠電泳后切膠回收;將目的條帶與克隆載體pMD19-T進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α，LB培養(yǎng)基復(fù)蘇后篩選出多個(gè)陽(yáng)性克隆，選擇單菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增，選擇擴(kuò)增出目標(biāo)條帶的細(xì)菌溶液，送樣測(cè)序。

1.4ZmMYB2的生物信息學(xué)分析

通過(guò)NCBI搜索獲得基因基本信息，然后利用在線分析工具ExPASy、NetPhos3.1、SignalP4.1、SOPMA、TMHMM、PlantCARE等[11-15]對(duì)ZmMYB2蛋白的理化性質(zhì)、磷酸位點(diǎn)、保守結(jié)構(gòu)域、亞細(xì)胞定位、進(jìn)化關(guān)系、二三級(jí)結(jié)構(gòu)、啟動(dòng)子順式作用元件等進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

1.5熒光定量PCR

通過(guò)檢索獲得的ZmMYB2基因序列，設(shè)計(jì)cDNA快速擴(kuò)增的上、下游引物（表1）。使用試劑盒ChamQTMUniversalSYBRqPCRMasterMix（南京諾唯贊生物科技有限公司）在熒光定量PCR儀（QuantStudio3，美國(guó)ABI）上進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。采用2-ΔΔCt方法[16]計(jì)算ZmMYB2基因在幼嫩根、莖、葉中的相對(duì)表達(dá)量及處理0、6、12、24、48h的相對(duì)表達(dá)量。使用MicrosoftExcel2010處理數(shù)據(jù)并進(jìn)行差異顯著性分析和作圖。

2結(jié)果與分析

2.1ZmMYB2基因的克隆及鑒定

根據(jù)基因序列設(shè)計(jì)全長(zhǎng)編碼區(qū)引物，以cDNA為模板對(duì)ZmMYB2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，從玉米自交系遼3162中擴(kuò)增出一條長(zhǎng)度為1233bp的基因序列，用瓊脂糖凝膠電泳對(duì)RNA和目的基因序列進(jìn)行驗(yàn)證（圖1），根據(jù)ORFfinder可知該基因編碼410個(gè)氨基酸（圖2）。

2.2ZmMYB2的啟動(dòng)子序列順式作用元件預(yù)測(cè)分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)獲得ZmMYB2基因的啟動(dòng)子前3000bp序列，使用在線軟件plantCARE對(duì)啟動(dòng)子序列的順式作用元件進(jìn)行預(yù)測(cè)，結(jié)果（表2）發(fā)現(xiàn)，在ZmMYB2基因上游不僅有CAAT-box、TATA-box等常見的核心啟動(dòng)子元件，還發(fā)現(xiàn)了13個(gè)MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，表明ZmMYB2具有啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的功能，可能受玉米MYB家族成員的調(diào)控。

2.3ZmMYB2蛋白的理化性質(zhì)分析

利用在線軟件ExPASy對(duì)ZmMYB2蛋白進(jìn)行理化性質(zhì)分析，結(jié)果（表3）顯示，ZmMYB2蛋白分子式為C2003H3157N589O636S13，由20種常見氨基酸組成，含量最高的為亮氨酸（Leu），占總含量的9.8%，谷氨酸（Glu）和絲氨酸（Ser）次之，占總含量的8.5%，色氨酸（Trp）含量最低，僅占0.5%;理論等電點(diǎn)為6.38，小于7，表明ZmMYB2蛋白是一個(gè)弱酸性蛋白;親水指數(shù)為-0.714，推測(cè)為親水性蛋白。利用在線工具ProtScale分析得到玉米ZmMYB2蛋白的親/疏水信號(hào)圖（圖3），其多肽鏈N端和C端皆表現(xiàn)為親水性，中間部位多數(shù)也表現(xiàn)為親水性，親水峰值在-0.5以下的信號(hào)明顯多于峰值在0.5以上的信號(hào)，進(jìn)一步證明了ZmMYB2蛋白具有親水性。

2.4ZmMYB2蛋白的磷酸位點(diǎn)、信號(hào)肽、結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)及亞細(xì)胞定位

通過(guò)在線軟件NetPhos3.1分析可知，ZmMYB2蛋白可能存在46種磷酸化位點(diǎn)（圖4），分別為28個(gè)絲氨酸（Ser）位點(diǎn)、12個(gè)蘇氨酸（Thr）位點(diǎn)和6個(gè)酪氨酸（Tyr）位點(diǎn)，可以與磷酸基團(tuán)結(jié)合，傳遞磷酸基團(tuán)。利用在線軟件SignalP4.1和TMHMM對(duì)ZmMYB2蛋白進(jìn)行信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，結(jié)果顯示ZmMYB2基因編碼的蛋白中不存在信號(hào)肽和跨膜結(jié)構(gòu)域，從而推測(cè)ZmMYB2蛋白為非分泌蛋白，是在細(xì)胞內(nèi)起作用的蛋白。根據(jù)在線工具CDSearch，查找ZmMYB2基因的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)果（圖5）表明，ZmMYB2蛋白含有MYB-SHAQKYF和MYB-CC-LHEQLE兩個(gè)MYB域，推測(cè)ZmMYB2蛋白屬于MYB家族的轉(zhuǎn)錄因子。利用在線工具Plant-mPLoc對(duì)ZmMYB2蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明ZmMYB2蛋白定位在細(xì)胞核中的可能性最大，推斷ZmMYB2蛋白最有可能在細(xì)胞核中起作用，是能夠與DNA特定片段結(jié)合調(diào)控下游基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子。

2.5ZmMYB2蛋白的二三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

利用在線工具SOPMA分析得知，ZmMYB蛋白的多肽鏈中多以無(wú)規(guī)則卷曲為主，含量為55.85%，其次為34.88%的α-螺旋，延伸鏈和β-折疊含量較少，各占7.07%和2.20%。利用在線工具SWISS-MODEL對(duì)ZmMYB2蛋白的410個(gè)氨基酸進(jìn)行3D建模，模板覆蓋率為62.07%，得到ZmMYB2蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)（圖6）。

2.6ZmMYB2蛋白的序列對(duì)比和進(jìn)化分析

利用在線工具DNAMAN6.0，以ZmMYB2基因序列為探針，按照最大似然法，將ZmMYB2蛋白序列與高粱（Sorghumbicolor）、南荻（Miscanthuslutarioriparius）、柳枝稷（Panicumvirgatum）、黍（Panicumhallii）、粟（Setariaitalica）、福尼奧小米（Digitariaexilis）、野生二粒小麥（Triticumdicoccoides）、秈稻（Oryzasativasubsp.indica）、大麥（Hordeumvulgare）等植物的MYB序列進(jìn)行對(duì)比，結(jié)果（圖7）顯示MYB蛋白序列的重疊性較高，表明MYB轉(zhuǎn)錄因子具有較高的同源性，在進(jìn)化過(guò)程中具有一定的保守性。采用DNAMAN6.0進(jìn)行多序列比對(duì)，利用MEGA-X構(gòu)建各植物蛋白的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖8），發(fā)現(xiàn)ZmMYB2蛋白序列與高粱和南荻的MYB序列親緣關(guān)系最近，同屬高粱族，而與秈稻、野生二粒小麥和烏拉爾圖小麥（Triticumurartu）的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。

2.7ZmMYB2基因的表達(dá)分析

qRT-PCR分析ZmMYB2基因在不同組織中的表達(dá)，結(jié)果（圖9）顯示，ZmMYB2基因在玉米根、莖、葉中均有表達(dá)，但不同部位的表達(dá)量存在差異，根中的表達(dá)量最低，葉中最高，為根的3.88倍，莖中的表達(dá)量?jī)H次于葉，為根的3.15倍，說(shuō)明ZmMYB2基因的表達(dá)具有組織特異性。ZmMYB2基因在鹽脅迫和干旱脅迫0～48h的表達(dá)水平變化情況如圖10所示，可見，ZmMYB2基因的表達(dá)量在NaCl脅迫后呈現(xiàn)先降低后升高、處理48h后又顯著下降的變化趨勢(shì);在模擬干旱處理下呈現(xiàn)升-降-升-降的波動(dòng)趨勢(shì)，在處理的12h后顯著升高，24h時(shí)達(dá)到最高。推測(cè)ZmMYB2基因能夠響應(yīng)NaCl和PEG脅迫。

3討論與結(jié)論

本研究從玉米中克隆出ZmMYB2基因，生物信息學(xué)分析結(jié)果表明該蛋白為弱酸性親水性非分泌蛋白，定位在細(xì)胞核內(nèi);上游序列中含有多個(gè)啟動(dòng)子順式作用元件，具有多個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，包括MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn);含有MYBSHAQKYF和MYB-CC-LHEQLE兩個(gè)保守結(jié)構(gòu)域。說(shuō)明ZmMYB2屬于MYB轉(zhuǎn)錄因子家族。

本研究發(fā)現(xiàn)，ZmMYB2基因主要在玉米葉片中表達(dá)，其次為莖中，在根中的表達(dá)量較低。與前人研究結(jié)果類似，如澳洲堅(jiān)果MiMYB2基因主要在枝葉中表達(dá)，在花中的表達(dá)量較低[17];地黃RgMYB10基因主要在須根中表達(dá)，在塊根中的表達(dá)量較低[8]。Chen等利用擬南芥非生物脅迫反應(yīng)MYB蛋白序列，通過(guò)比較基因組學(xué)，從玉米中鑒定到46個(gè)可能參與非生物脅迫的MYB基因，其中，轉(zhuǎn)ZmMYB30基因能夠提高擬南芥對(duì)鹽脅迫的耐受性，并能增加非生物脅迫相關(guān)基因的表達(dá)數(shù)目[18];胡育峰等研究發(fā)現(xiàn)在胚乳中過(guò)表達(dá)MYB14能夠提高玉米籽粒淀粉含量[19];TaMYB3R1、TaMYB1和TaMYBsdu1基因也在小麥干旱反應(yīng)中起著重要作用，TaMYB2A、TaMYB3R1、TaPIMP1等基因通過(guò)抑制植物蛋白磷酸酶2C的表達(dá)來(lái)提高小麥耐鹽性[20];TaMYBsm3基因通過(guò)提高P5CS1、DREB2A、RD29A等非生物脅迫應(yīng)答基因的表達(dá)水平來(lái)增強(qiáng)小麥抗旱性[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽脅迫和干旱脅迫均能使ZmMYB2基因表達(dá)量上調(diào)。綜合上述分析，可推斷MYB家族基因的表達(dá)具有組織特異性，并對(duì)植物抵御非生物脅迫起著重要的調(diào)控作用。

本研究結(jié)果可為進(jìn)一步研究ZmMYB2基因的生物學(xué)功能以及玉米對(duì)非生物脅迫應(yīng)答的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。