安明珠 馬向麗 周凱 段新慧 姜華 韓博

摘要：為建立適宜MsDUF基因轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化體系，本試驗(yàn)在已知的紫花苜蓿再生體系的基礎(chǔ)上，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，以保定紫花苜蓿（MedicagosativaL.cv.Baoding）下胚軸和子葉為轉(zhuǎn)化受體，將MsDUF基因?qū)氲阶匣ㄜ俎Ｖ?，通過對(duì)愈傷誘導(dǎo)、分化及生根培養(yǎng)階段抗生素濃度的篩選建立了優(yōu)化的遺傳轉(zhuǎn)化體系，同時(shí)對(duì)篩選獲得的轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿進(jìn)行PCR和RT-PCR檢測(cè)。結(jié)果表明，農(nóng)桿菌介導(dǎo)的MsDUF基因遺傳轉(zhuǎn)化的最佳條件為：將預(yù)培養(yǎng)2d的紫花苜蓿下胚軸用含pCAMBIA1301-MsDUF質(zhì)粒的農(nóng)桿菌菌液（OD600為0.3～0.5）侵染10min，共培養(yǎng)暗處理2d后轉(zhuǎn)入含30mg/LHyg和500mg/LCef的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基和分化培養(yǎng)基上誘導(dǎo)分化，待抗性芽長(zhǎng)到2～3cm高時(shí)轉(zhuǎn)入含30mg/LHyg和300mg/LCef的生根培養(yǎng)基上，得到6株經(jīng)PCR檢測(cè)為陽性的抗性植株;選取5株進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，均檢測(cè)出大小與目的條帶相吻合的清晰條帶，證明MsDUF基因已成功轉(zhuǎn)入保定紫花苜蓿中。本試驗(yàn)成功建立了農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高效MsDUF基因轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化體系，為進(jìn)一步研究MsDUF基因功能奠定了基礎(chǔ)，同時(shí)為紫花苜蓿育種和種質(zhì)創(chuàng)新提供了基礎(chǔ)材料。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿;MsDUF基因;農(nóng)桿菌介導(dǎo);遺傳轉(zhuǎn)化體系;PCR檢測(cè);RT-PCR檢測(cè)

紫花苜蓿（MedicagosativaL.）是世界上重要的優(yōu)質(zhì)豆科牧草之一，具有營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富、產(chǎn)量高、適口性好等優(yōu)點(diǎn)[1，2]，主要集中在我國(guó)西北干旱、半干旱及鹽堿地區(qū)種植[3，4]。紫花苜蓿不僅是一種重要的經(jīng)濟(jì)飼料作物，還是一種很好的水土保持植物，在畜牧業(yè)可持續(xù)發(fā)展和環(huán)境改善等方面具有重要作用[5]。

紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化率較低，易受多種因素的影響，例如外植體材料、植物激素、抗生素濃度等[6-8]。穩(wěn)定的遺傳轉(zhuǎn)化體系是提高紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化率及產(chǎn)量的前提[9]。Deak等[10]在1986年首次對(duì)紫花苜蓿進(jìn)行轉(zhuǎn)基因改良，建立了紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系。此后，研究人員在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步優(yōu)化遺傳轉(zhuǎn)化體系，以期能夠獲得較高的轉(zhuǎn)化率，提高紫花苜蓿的耐性[11，12]。He等[13]研究4個(gè)苜蓿品種的再生能力時(shí)，通過改變植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的濃度，進(jìn)一步改良用于遺傳轉(zhuǎn)化的再生體系。李晶等[14]采用下胚軸作為轉(zhuǎn)化受體，利用不同濃度潮霉素對(duì)轉(zhuǎn)化植株進(jìn)行篩選，建立了一個(gè)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的紫花苜蓿smt1富硒基因遺傳轉(zhuǎn)化體系，為富硒苜蓿新品種選育奠定了基礎(chǔ)。薛曉峰[15]通過對(duì)紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化條件進(jìn)行完善，將SeNHX1鹽角草逆向轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?qū)胱匣ㄜ俎Ｖ校⒘溯^為完善的苜蓿再生體系，為提高苜蓿的抗鹽性提供了方法。張靜[16]將LYZGFP雙元基因?qū)?個(gè)苜蓿品種中，并對(duì)其遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了優(yōu)化，為研究轉(zhuǎn)基因抗病苜蓿新品種奠定了基礎(chǔ)。

MsDUF基因是從紫花苜蓿自身提取出的，是DUF4228家族成員之一，在紫花苜蓿各組織中均有發(fā)現(xiàn)，能在不同的逆境下上調(diào)表達(dá)[17]。但其他植物能否通過表達(dá)該基因而使抗逆能力提高還有待研究。

本試驗(yàn)采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，通過篩選轉(zhuǎn)化受體及愈傷誘導(dǎo)、分化和生根培養(yǎng)基的最優(yōu)抗生素濃度，建立了一套高效的MsDUF基因轉(zhuǎn)化紫花苜蓿的遺傳轉(zhuǎn)化體系，這將為進(jìn)一步研究MsDUF基因的功能奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1轉(zhuǎn)化材料 供試品種為保定紫花苜蓿（MedicagosativaL.cv.Baoding），購自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所。選取7日齡無菌苗的葉片和下胚軸作為遺傳轉(zhuǎn)化受體。

大腸桿菌DH5α由北京天根生化科技有限公司提供，農(nóng)桿菌菌株GV3101由西北農(nóng)林科技大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院張大鵬提供;植物表達(dá)載體質(zhì)粒pCAMBIA1301-MsDUF，由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建，該質(zhì)粒攜帶有MsDUF基因。

1.1.2培養(yǎng)基 種子萌發(fā)培養(yǎng)基為1/2MS固體培養(yǎng)基，農(nóng)桿菌介導(dǎo)培養(yǎng)基為YEB培養(yǎng)基，愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基為UM+2mg/L2，4-D+0.25mg/LKT，分化培養(yǎng)基為UM+0.7mg/LKT，生根培養(yǎng)基為1/2MS培養(yǎng)基，預(yù)培養(yǎng)基、共培養(yǎng)基均為MS培養(yǎng)基。

YEB、MS、UM、1/2MS培養(yǎng)基配方參照《植物生理學(xué)實(shí)驗(yàn)》[18]，所有培養(yǎng)基均需在121℃下滅菌25min，抗生素用BiosharpBS-PES-2233mm0.22μm一次性針頭濾器進(jìn)行過濾。培養(yǎng)基的大量元素、微量元素、鐵鹽和有機(jī)質(zhì)母液的配制均參照《實(shí)用植物組織培養(yǎng)技術(shù)教程》[19]。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1轉(zhuǎn)化受體的篩選及農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化 選取保定紫花苜蓿成熟種子，用75%乙醇消毒5min后，無菌水沖洗;再用10%次氯酸鈉消毒10min，無菌水反復(fù)沖洗幾次后將種子置于含有1/2MS固體培養(yǎng)基的無菌三角瓶中，在（25±2）℃培養(yǎng)箱中發(fā)芽并生長(zhǎng)一周后，取無菌苗的子葉和下胚軸各100個(gè)作為外植體。

把pCAMBIA1301-MsDUF質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌中，然后在YEB培養(yǎng)基中低速振蕩培養(yǎng)至OD600值為0.3～0.5;將苜蓿子葉和下胚軸放入MS培養(yǎng)基中預(yù)培養(yǎng)2d后，將其轉(zhuǎn)移到上述含有農(nóng)桿菌的YEB培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)10min，然后將外植體材料取出用無菌紙吸干后放在MS共培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)2d，轉(zhuǎn)到愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基上，統(tǒng)計(jì)誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)及愈傷組織誘導(dǎo)率。

1.2.2愈傷組織誘導(dǎo)的抗生素濃度篩選 將苜蓿材料（每個(gè)處理50個(gè)樣本，重復(fù)5次）從MS共培養(yǎng)基中取出后依次用滅菌水、含有400μg/mL頭孢（Cef）的滅菌水沖洗，并在液體MS培養(yǎng)基里清洗幾分鐘，然后轉(zhuǎn)到含有不同濃度潮霉素（Hyg濃度為10、30、50、70mg/L）和頭孢（Cef濃度為100、300、500、700mg/L）的愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，每20天繼代一次，繼代2次，觀察抗生素抑制農(nóng)桿菌的狀況及愈傷組織的褐化情況，并統(tǒng)計(jì)愈傷數(shù)及愈傷率，選擇最適抗生素濃度。

1.2.3分化培養(yǎng)的抗生素濃度篩選 將愈傷組織轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基（抗生素濃度設(shè)計(jì)與愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的相同）上，每個(gè)處理轉(zhuǎn)移50個(gè)愈傷，重復(fù)5次，30d后觀察胚狀體分化及污染狀況，統(tǒng)計(jì)分化出的胚狀體數(shù)及分化率。

1.2.4生根培養(yǎng)的抗生素濃度篩選 待抗性芽生長(zhǎng)至2～3cm高時(shí)轉(zhuǎn)入含有不同濃度抗生素（抗生素濃度設(shè)計(jì)與愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基中的相同）的生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，統(tǒng)計(jì)生根率，然后將獲得的轉(zhuǎn)基因植株移栽到花盆中進(jìn)行煉苗。

1.2.5轉(zhuǎn)基因植株的鑒定 （1）PCR檢測(cè)：以CTAB法提取出的轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿葉片基因組為模板，使用目的基因特異引物MsDUF-F（5′-CTAATGGGGAACACTTTTGG-3′）和MsDUF-R（5′-AAATCTCCTCAGTTTGGTGAG-3′）進(jìn)行PCR檢測(cè)。

（2）RT-PCR檢測(cè)：利用Trizol法提取經(jīng)PCR檢測(cè)陽性的轉(zhuǎn)基因紫花苜蓿總RNA，并使用TaKaRa公司的去基因組DNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄為cDNA，以紫花苜蓿看家基因β-Actin作為內(nèi)參，MsDUF-F和MsDUF-R為基因特異性引物，對(duì)MsDUF基因進(jìn)行Real-TimePCR檢測(cè)。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用MicrosoftExcel2010整理和分析數(shù)據(jù)。涉及的計(jì)算公式為：

愈傷誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)出愈傷組織的外植體數(shù)/接種的外植體總數(shù)×100 ;

分化率（%）=分化的胚狀體數(shù)/轉(zhuǎn)移的愈傷數(shù)×100 ;

生根率（%）=生根株數(shù)/分化株數(shù)×10

2結(jié)果與分析

2.1轉(zhuǎn)化受體的選擇

分別以下胚軸和子葉為外植體進(jìn)行愈傷組織誘導(dǎo)，培養(yǎng)20d后下胚軸的愈傷誘導(dǎo)率達(dá)到99%（表1），高于子葉（90%），故選擇下胚軸作為最優(yōu)外植體。

2.2愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基的抗生素濃度篩選

結(jié)果顯示，當(dāng)Hyg和Cef濃度較低時(shí)，愈傷組織呈現(xiàn)出淡黃色，內(nèi)部致密外部松散，表面干燥，生長(zhǎng)較快，但污染率較高;Hyg和Cef濃度高時(shí)，愈傷組織塊表現(xiàn)為黃褐色，結(jié)構(gòu)松軟，用手捻碎愈傷塊可發(fā)現(xiàn)水分含量較高，愈傷組織死亡率增加，愈傷誘導(dǎo)率降低，但污染率最低，表明抗生素濃度高對(duì)愈傷組織產(chǎn)生強(qiáng)烈的抑制作用。綜合比較，30mg/LHyg+500mg/LCef處理的愈傷組織誘導(dǎo)效果最好（表2）;在此條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)5d，下胚軸開始膨脹變大，形成愈傷組織;10d后，愈傷組織塊增大，呈白色或淡黃色，質(zhì)地緊密（圖1）

2.3分化培養(yǎng)基抗生素濃度的篩選

將愈傷組織轉(zhuǎn)入含有不同濃度抗生素的分化培養(yǎng)基中，觀察發(fā)現(xiàn)20d時(shí)，愈傷組織出現(xiàn)淡綠色的胚狀體;30d后，隨著抗生素濃度的增加，分化的胚狀體數(shù)逐漸減少，分化率降低，抗生素濃度最高時(shí)全部褐化死亡。表明高濃度抗生素對(duì)愈傷組織分化有明顯的抑制作用。綜合愈傷組織污染及分化情況，選用30mg/LHyg+500mg/LCef作為分化培養(yǎng)的最適抗生素濃度處理（表3）。

2.4生根培養(yǎng)基的抗生素濃度篩選

抗性芽在添加不同濃度抗生素的1/2MS培養(yǎng)基上的生根率隨抗生素濃度的升高而降低，甚至出現(xiàn)死亡（表4）。綜合來看，當(dāng)抗生素濃度為30mg/LHyg+300mg/LCef時(shí)根系的生長(zhǎng)狀況最佳，根系長(zhǎng)、粗壯、須根發(fā)達(dá)（圖2）。

2.5轉(zhuǎn)基因苜蓿的PCR檢測(cè)

利用提取的轉(zhuǎn)基因植株DNA為模板，以MsDUF-F和MsDUF-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以經(jīng)過相同再生過程的野生型紫花苜蓿為陰性對(duì)照，水為空白對(duì)照，發(fā)現(xiàn)選取的7株轉(zhuǎn)基因苜蓿中有6株檢測(cè)出與目的基因大小相同的條帶，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，產(chǎn)物長(zhǎng)度為714bp（圖3）。初步得到6株轉(zhuǎn)基因陽性植株。

2.6轉(zhuǎn)基因苜蓿的RT-PCR檢測(cè)

以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板、以MsDUF-F和MsDUF-R為引物進(jìn)行Real-TimePCR擴(kuò)增，經(jīng)電泳檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，從選取的5株再生苜蓿（分別對(duì)應(yīng)圖3中的6、7、8、9、10）中均檢測(cè)出與目的基因大小相吻合的清晰條帶（圖4），表明目的基因已整合進(jìn)紫花苜蓿中，同時(shí)可以在RNA水平上正常表達(dá)。

3討論

紫花苜蓿在畜牧業(yè)發(fā)展和環(huán)境改良中具有重要作用，但隨著干旱范圍的擴(kuò)大，紫花苜蓿的生長(zhǎng)及產(chǎn)量受到了極大的限制[17]。高效的紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化體系能夠降低成本，減少損失，使轉(zhuǎn)化率增高[20]，對(duì)進(jìn)一步研究轉(zhuǎn)化后的紫花苜蓿MsDUF基因功能具有重要作用。

要建立高效的紫花苜蓿遺傳轉(zhuǎn)化再生體系，選擇再生能力好的外植體材料及適宜的抗生素濃度非常關(guān)鍵。紫花苜蓿外植體大多選用葉片、下胚軸及子葉。本研究分別用保定紫花苜蓿的下胚軸和子葉為外植體進(jìn)行愈傷誘導(dǎo)率對(duì)比，發(fā)現(xiàn)用下胚軸為外植體時(shí)的愈傷誘導(dǎo)率較高，這與錢瑾[21]和王涌鑫等[22]的研究結(jié)果一致，而與謝鑫星等[23]的研究結(jié)果有所不同，可能是由于所用紫花苜蓿品種不同造成的。

在使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)MsDUF基因轉(zhuǎn)入到紫花苜蓿中時(shí)，殘留的農(nóng)桿菌往往會(huì)造成培養(yǎng)基污染，使植株成活率降低。為解決該問題，通常采用在培養(yǎng)基中加入抗生素的方法來抑制農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)化率。但高濃度抗生素又會(huì)對(duì)植物細(xì)胞產(chǎn)生損傷[24，25]，因此，選擇適宜的抗生素濃度對(duì)于遺傳轉(zhuǎn)化成功尤為重要。本試驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)抗生素濃度低時(shí)，愈傷組織成活率較高，但污染率也較高;而當(dāng)抗生素濃度高時(shí)，雖然污染率降低，但是愈傷組織死亡率升高。這與馬伶俐[26]和許來俊[27]的研究結(jié)果一致，也證明了選用適宜濃度的抗生素對(duì)獲得較高遺傳轉(zhuǎn)化效率具有重要影響。

4結(jié)論

本研究建立了適宜農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)MsDUF基因保定紫花苜蓿的最佳遺傳轉(zhuǎn)化體系：以下胚軸為外植體，在MS培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2d后，轉(zhuǎn)移到OD600為0.3～0.5的農(nóng)桿菌（含有pCAMBIA1301-MsDUF質(zhì)粒）菌液內(nèi)振蕩培養(yǎng)10min，在MS共培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)2d，再轉(zhuǎn)入到愈傷培養(yǎng)基（UM+2mg/L2，4-D+0.25mg/LKT+30mg/LHyg+500mg/LCef）上誘導(dǎo)愈傷組織，光照16h、黑暗8h，每隔20天繼代一次，繼代2次后轉(zhuǎn)移到分化培養(yǎng)基（UM+0.7mg/LKT+30mg/LHyg+500mg/LCef）上進(jìn)行分化，30d后待抗性芽生長(zhǎng)至2～3cm高時(shí)轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基（1/2MS+30mg/LHyg+300mg/LCef）進(jìn)行生根培養(yǎng)，獲得完整植株后移栽到花盆中，經(jīng)PCR和RT-PCR檢測(cè)獲得轉(zhuǎn)基因陽性植株，說明MsDUF基因已經(jīng)整合到植物基因組中。