徐敦明, 曾三妹, 柳訓才, 王鷺驍, 范群艷, 張小江, 方恩華

(1. 廈門海關(guān)技術(shù)中心, 福建 廈門 361026; 2. 廈門市燕之屋絲濃食品有限公司, 福建 廈門 361101)

燕窩,又名燕菜、燕蔬菜及燕根,是由部分雨燕科金絲燕用其唾液及絨羽等混合凝結(jié)筑成用于繁衍后代的巢窩,含有豐富的氨基酸、蛋白質(zhì)、唾液酸及微量的礦物質(zhì)元素等[1,2],具有抗氧化[3-5]、改善免疫[6]、延緩衰老[7]、抗病毒[8,9]、營養(yǎng)神經(jīng)[10]、防止胰島素抵抗[11]等功效,在《本草綱目拾遺》中有“大養(yǎng)肺陰,化痰止咳,補而能清,為調(diào)理虛損老擦之圣藥”的記載。燕窩自引入中國以來就被奉為高檔保健食品,廣受人們青睞。燕窩作為一種動物源性食品,其中激素的安全性問題也受到更多人的關(guān)注。通過索引,Ma等[12]采用免疫技術(shù)對燕窩中6種激素進行測定,國內(nèi)外有關(guān)采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)(LC-MS/MS)測定燕窩中激素含量的文獻報道甚少,鑒于此,建立一種準確可靠的燕窩中多種激素同時確證的分析方法非常必要。

研究表明,長期攝入激素對于人體健康存在一定風險與隱患。如雌激素其化學穩(wěn)定性高,不易降解,通過污水處理廠或養(yǎng)殖場廢棄物進入環(huán)境后,在水體、土壤系統(tǒng)中將發(fā)生吸附、遷移等行為[13],可在動物機體內(nèi)蓄積,并通過食物鏈傳遞進入人體,干擾內(nèi)分泌系統(tǒng),并引起發(fā)育、生殖、行為等方面的異常變化[14-16]。歐盟委員會禁止使用雌激素作為促生長劑用于動物育肥[17],我國農(nóng)業(yè)部公告250號[18]也規(guī)定食品動物中禁止使用己二烯雌酚、己烯雌酚、己烷雌酚及其鹽、酯。目前,在環(huán)境領(lǐng)域研究較多的是雌激素,而對其他幾種類固醇激素的研究偏少,且多是集中在少數(shù)幾種物質(zhì)上的基礎(chǔ)研究,對于動物源性食品中激素的研究主要針對肉制品、牛奶、蛋等食品。我國現(xiàn)行的動物源性食品中激素的檢測標準近30個,常用檢測痕量殘留激素的分析方法有主要有氣相色譜-質(zhì)譜法(GC-MS)[19,20]、電化學法[21,22]、酶免疫分析法[23]、放射免疫法[24]、高效液相色譜法[25]、液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法[26-30]等。其中,酶免疫分析法可測定范圍較窄且易存在假陽性結(jié)果和交叉污染情況,適用于檢測常見、單一性激素;高效液相色譜法對熱穩(wěn)定差、高沸點物質(zhì)有較好分離度,但是紫外檢測器靈敏度及準確性存在一定限制;GC-MS可對多種激素同時定性定量分析,但激素具有不易揮發(fā)及熱不穩(wěn)定性等特點,多數(shù)需要衍生,目前尚未有一種衍生試劑可對所有激素進行衍生化,而且衍生化過程還會出現(xiàn)副反應,使分析底物復雜化,過程繁瑣耗時。LC-MS/MS因具有檢測靈敏度高、選擇性和特異性好、分析時間短等特點,是目前應用最廣泛的激素殘留定量分析方法之一[31-35]。

本研究以燕窩為對象,以LC-MS/MS技術(shù)為檢測手段,建立了燕窩中皮質(zhì)激素、雌激素、雄激素及孕激素類等45種激素的測定方法,該方法操作簡單,靈敏度高,準確度好,對后續(xù)燕窩食品安全的監(jiān)管,以及回應社會對燕窩中激素安全性的擔憂具有重要參考意義。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Agilent 1290超高效液相色譜儀(美國Agilent公司), API5500三重四極桿質(zhì)譜儀(美國AB公司), CPX5800H超聲儀(美國Branson Ultrasonics公司), Supelco 24位固相萃取儀(美國Merck公司), N-EVAP-24氮吹儀(美國Organomation公司), MS3 Basic渦旋振蕩器(德國IKA公司), TDL-50B離心機(中國上海安亭科學儀器廠), Milli-Q Reference超純水器(美國Millipore公司), CPA225D電子天平(德國Sartorius公司)。

群勃龍等45種標準品(純度≥98%,德國Dr. Ehrenstorfer公司、美國藥典公司、英國藥典公司、加拿大TRC公司)分別以甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標準儲備液,儲存于-20 ℃冰箱中,使用時根據(jù)需要配成不同質(zhì)量濃度的中間混合標準溶液及標準工作液。甲醇、乙腈、乙酸乙酯均為色譜純(美國Merck公司),其他試劑為分析純(國藥集團化學試劑有限公司); 3 mL/60 mg親水-親脂平衡固相萃取柱(HLB,美國Waters公司)。本研究共收集1 021份燕窩樣品,來自馬來西亞、印度尼西亞、泰國和越南等國家,測定時間2017～2021年。

1.2 色譜條件

1.2.1正離子模式

色譜柱:Phenomenex Kinetex C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm);柱溫:35 ℃;流動相:A相為0.1%甲酸水溶液,B相為乙腈;流速:0.3 mL/min。梯度洗脫程序:0～2.0 min, 70%A; 2.0～2.1 min, 70%A～50%A; 2.1～7.0 min, 50%A～36%A; 7.0～7.1 min, 36%A～16%A; 7.1～8.6 min, 16%A～0%A; 8.6～10.6 min, 0%A; 10.6～11.0 min, 0%A～70%A; 11.0～14.0 min, 70%A。進樣量:10 μL。

1.2.2負離子模式

色譜柱:Phenomenex Kinetex C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm);柱溫:35 ℃;流動相:A相為水,B相為乙腈;流速:0.3 mL/min;梯度洗脫程序:0～1.5 min, 98%A～65%A; 1.5～3.5 min, 65%A; 3.5～3.8 min, 65%A～35%A; 3.8～5.0 min, 35%A; 5.0～5.3 min, 35%A～5%A; 5.3～7.0 min, 5%A; 7.0～7.1 min, 5%A～98%A; 7.1～10.0 min, 98%A。進樣量:10 μL。

1.3 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源,正或負離子模式(ESI+或ESI-);離子源溫度:650 ℃;霧化氣壓力:413.7 kPa;干燥氣壓力:413.7 kPa;氣簾氣壓力:275.8 kPa;每個離子對駐留時間:10 ms。每種化合物的保留時間、檢測離子對、去簇電壓(DP)、碰撞能量(CE)等質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表 1 (續(xù))

1.4 樣品前處理

準確稱取1.0 g燕窩樣品,置于50 mL離心管中,加入8 mL水,旋渦混勻,超聲處理30 min。萃取劑為15 mL乙腈-乙酸乙酯(1∶1, v/v),均質(zhì)提取2 min,提取2次,室溫下離心5 min,轉(zhuǎn)速為4 000 r/min,合并上清液,于45 ℃氮吹濃縮至近干,加入5 mL 30%甲醇水溶液溶解殘渣。上樣至用3 mL甲醇和3 mL水活化過的HLB小柱中,然后依次用3 mL水、3 mL 50%甲醇水溶液淋洗,棄去淋洗液,再用3 mL甲醇洗脫,收集洗脫液,并于45 ℃水浴中氮吹濃縮至近干,用1 mL 50%乙腈水溶液溶解殘渣,旋渦混勻后經(jīng)0.22 μm有機相濾膜過濾,濾液供LC-MS/MS測定。

2 結(jié)果與討論

2.1 分析方法的建立

2.1.1質(zhì)譜分析條件的優(yōu)化

用單針進樣分析目標化合物標準溶液,分別在正離子和負離子模式下進行母離子全掃描,得到各化合物的準分子離子([M+H]+或[M-H]-),比較兩種模式掃描的靈敏度,選取響應值高的離子作為母離子。然后,對母離子施加一定的碰撞能量進行轟擊,獲得其相應的離子碎片,選擇信號較強、干擾較小的兩對子離子分別作為定量、定性離子。最后通過優(yōu)化碰撞能量,使每種化合物的特征碎片離子對強度達到最大。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表1。

2.1.2色譜條件的優(yōu)化

在文獻[31-35]的基礎(chǔ)上,實驗對比了Thermo Accucore-C18(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm)和Phenomenex Kinetex C18(100 mm×2.1 mm, 2.6 μm)色譜柱對待測物分離的效果。發(fā)現(xiàn)采用Phenomenex Kinetex C18色譜柱時,待測物色譜峰的保留時間、分離度以及對稱性都更優(yōu)。因此本方法選擇Phenomenex Kinetex C18色譜柱來分離待測物。

在正離子模式下,對比了水-乙腈、0.1%甲酸水溶液-乙腈作為流動相時待測物的分離效果。結(jié)果表明,流動相甲酸化后有利于[M+H]+的形成,目標化合物的響應明顯增強。在負離子模式下,比較了水-乙腈、0.1%氨水溶液-乙腈為流動相時的分離效果，發(fā)現(xiàn)流動相添加氨水后對[M-H]-的形成并無促進作用。因此,在正、負離子模式下,分別采用0.1%甲酸水溶液-乙腈、水-乙腈為流動相。45種化合物的總離子流色譜圖(TIC)見圖1。

圖 1 45種激素的總離子流色譜圖Fig. 1 TIC chromatograms of the 45 hormones

2.1.3提取溶劑的選擇

根據(jù)現(xiàn)有的文獻方法[31-35],結(jié)合目標化合物的性質(zhì),實驗比較了乙腈、甲醇、0.1%乙酸乙腈、乙腈-乙酸乙酯(1∶1, v/v)等4種不同提取溶劑對45種激素(10 μg/kg)的提取效果。結(jié)果表明,當提取溶劑為乙腈-乙酸乙酯(1∶1, v/v)時,甲睪酮的回收率為65%、布地奈德為69%,其他43種目標物的回收率為74%～92%。而以乙腈、甲醇、0.1%乙酸乙腈為提取溶劑時,目標物回收率分別為34%～64%、26%～59%和42%～70%。故本文選擇乙腈-乙酸乙酯(1∶1, v/v)作為提取溶劑。

2.2 基質(zhì)效應

與其他分析手段不同的是,質(zhì)譜分析尤其是以電噴霧電離為離子源的質(zhì)譜分析可能會存在基質(zhì)效應。燕窩是天然材料,基質(zhì)中的雜質(zhì)會對目標化合物的分析產(chǎn)生一定干擾,影響分析的準確度、靈敏度和精密度。本實驗選取了燕窩基質(zhì)溶液與50%乙腈水溶液分別配制相同濃度的標準溶液。采用公式ME=(基質(zhì)匹配曲線的斜率/溶劑標準曲線的斜率-1)×100%計算基質(zhì)效應[28,33]?；|(zhì)效應為負值時,表示存在基質(zhì)抑制效應;基質(zhì)效應為正值時,表示存在基質(zhì)增強效應?；|(zhì)效應的研究結(jié)果表明,醛固酮、醋酸氟輕松、炔諾酮、地塞米松、醋酸甲羥孕酮表現(xiàn)為增強效應;其他40種化合物均表現(xiàn)為抑制效應,其中21-羥基孕酮、17α-羥基孕酮、康力龍等3個分析目標物的ME>15%,但<20%?？傮w評估,燕窩基質(zhì)對多數(shù)分析目標物基質(zhì)效應不明顯,對回收率的影響在可接受范圍內(nèi),考慮到檢測的效率與成本,故本研究采用溶劑配制標準溶液,外標法定量。

2.3 方法學驗證

2.3.1線性范圍、檢出限及定量限

配制45種激素的系列混合標準溶液,以各分析物的質(zhì)量濃度(x, μg/L)為橫坐標,各激素定量離子對的峰面積(y)為縱坐標繪制標準曲線,得到的線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)(R2)見表2。線性相關(guān)系數(shù)均≥0.999 0,在線性范圍內(nèi)線性良好。通過向燕窩樣品中添加45種激素考察方法的檢出限(S/N=3)和定量限(S/N=10),分析目標物檢出限和定量限分別為0.04～0.70 μg/kg和0.16～2.00 μg/kg。

表 2 45種激素的回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限、定量限及回收率(n=6)

2.3.2準確度和精密度

分別添加適量混合中間標準溶液至燕窩樣品中,添加水平為2.0(靈敏度最差目標物的LOQ)、4.0和20.0 μg/kg,按照本文建立的方法進行測定,通過添加回收試驗考察方法的準確度和精密度(n=6),結(jié)果見表2。醛固酮、醋酸氟輕松、氟米龍、布地奈德、炔雌醇的回收率為40.2%～63.6%,其他40種激素的平均加標回收率為72.2%～112.3%,相對標準偏差(RSD)為2.5%～11.6%, 40種分析目標物的準確度和精密度均符合殘留分析要求。

在多殘留分析時,涉及的化合物性質(zhì)存在差異,取得統(tǒng)一良好的回收率有一定難度。本研究中醛固酮等5種目標物的回收率偏低,但考慮到其定量限分別為1.02、0.48、0.96、0.48、0.96 μg/kg,根據(jù)最低回收率折算(LOQ×40.2%),檢出值分別為0.41、0.19、0.39、0.19、0.39 μg/kg,均高于5種化合物的檢出限0.31、0.10、0.32、0.14、0.30 μg/kg,故本方法不會造成假陰性,可對醛固酮等5種目標物進行定性分析。如需準確定量可以考慮使用同位素內(nèi)標、基質(zhì)匹配、標準加入等方法。

2.4 燕窩中激素含量

2.4.1燕窩中激素含量情況

2017～2021年期間,采用本文建立的方法對1 021個樣品進行了測定,僅勃地酮、雄烯二酮、孕酮有檢出(測定值≥LOD),其他激素水平均小于檢出限。勃地酮、雄烯二酮與孕酮有檢出的樣品個數(shù)分別為807個(檢出比率79%)、909個(檢出比率89%)、1 021個(檢出率為100%),測定值范圍分別為0～0.096、0～1.77、0.097～3.58 μg/kg。將檢出的測定值分成5等,統(tǒng)計每一等所占比例,結(jié)果見圖2。檢出的結(jié)果中,所有樣品中勃地酮測定值均<0.1 μg/kg; 764個樣品中雄烯二酮測定值<1.0 μg/kg; 888個樣品中孕酮測定值<1.0 μg/kg。所有樣品中檢出的激素含量均未超過5 μg/kg。此外,本次研究未檢出國家或地區(qū)禁止的類固醇激素。

圖 2 燕窩中勃地酮、雄烯二酮和孕酮的含量分布Fig. 2 Content distributions of boldenone, androstenedione, and progesterone in edible bird’s nest (EBN)

2.4.2燕窩中檢出激素的質(zhì)譜解析

勃地酮、雄烯二酮與孕酮的相對分子質(zhì)量分別為286.4、286.4和314.5，其形成的[M+H]+通過碰撞池時發(fā)生裂解生成產(chǎn)物離子,見圖3。勃地酮的[M+H]+丟失一個H2O,得到m/z為269.1的二級離子,丟失質(zhì)量數(shù)為152(C10H16O)的中性碎片,得到m/z為135.0的二級離子,丟失質(zhì)量數(shù)為166(C11H18O)的中性碎片,得到m/z為121.0的二級離子。雄烯二酮的[M+H]+丟失一個H2O,得到m/z為269.2的二級離子,丟失質(zhì)量數(shù)為178(C12H18O)的中性碎片,得到m/z為109.1的二級離子,丟失質(zhì)量數(shù)為190(C13H18O)的中性碎片,得到m/z為97.1的二級離子。孕酮的[M+H]+丟失一個H2O,得到m/z為297.3的二級離子,丟失質(zhì)量數(shù)為206(C14H22O)的中性碎片,得到m/z為109.0的二級離子,丟失質(zhì)量數(shù)為218(C15H22O)的中性碎片,得到m/z為97.0的二級離子。

圖 3 勃地酮、雄烯二酮、孕酮的二級碎片質(zhì)譜圖和裂解示意圖Fig. 3 Secondary fragment ion mass spectra and fragmentation schematics of boldenone, androstenedione, and progesterone

2.4.3燕窩、乳制品與雞蛋中激素水平比較分析

隨著人類活動范圍越來越大,人工合成激素被大量使用并通過環(huán)境傳播或食物鏈富集導致食品污染，即便在非直接接觸的食品中亦可檢出其存在，且通過食品加工措施并不能改變其含量和性質(zhì),直接或間接影響到人體生理代謝。

本研究按GB/T 21981-2008方法對市售的16批純牛奶、70批乳制品以及15批雞蛋中的勃地酮、雄烯二酮和孕酮進行測定,結(jié)果見表3。 勃地酮在4類產(chǎn)品中的含量差別不大，均為微量；15批雞蛋中均檢出雄烯二酮，含量比其他3類產(chǎn)品略高；孕酮含量在雞蛋中最高，其次是純牛奶，燕窩中含量最低，部分乳制品中未檢出，可能是產(chǎn)品含乳量低的原因。

表 3 不同動物源食品中勃地酮、雄烯二酮和孕酮的含量

以檢出的3種激素中含量最高的孕酮的平均含量進行分析,常人每人每天燕窩食用量為5 g[36],雞蛋為40～50 g[37],牛奶為300 g[37],根據(jù)安全風險評估方法[38],估算出每人每天孕酮的攝入量為牛奶(3.54 μg/d)>雞蛋(1.09 μg/d)>燕窩(0.003 0 μg/d),由此可知食用燕窩時激素的攝入量遠低于食用牛奶或雞蛋時激素的攝入量，對健康的影響較小。

3 結(jié)論

本文建立了燕窩中45種激素的HPLC-MS/MS分析方法,對醛固酮、醋酸氟輕松、氟米龍、布地奈德、炔雌醇可進行定性分析,對其他40種激素可進行定性定量分析。該方法的線性范圍、檢出限、回收率及精密度等方法學指標均滿足燕窩中40種激素的定性定量分析要求,且方法簡便快速,溶劑用量少,激素檢測的種類廣、數(shù)量多,可望為燕窩中激素的監(jiān)測和風險評估提供方法學基礎(chǔ)。采用本研究建立的方法對燕窩中激素進行監(jiān)測,結(jié)果表明燕窩中激素含量水平低于蛋與乳制品,對健康影響較小。