張秀堯, 蔡欣欣, 張曉藝, 李瑞芬, 趙云峰

(1. 溫州市疾病預防控制中心, 浙江 溫州 325001; 2. 國家食品安全風險評估中心, 北京 100022)

毒蘑菇又稱毒蕈,我國有480多種有毒蘑菇[1],每年都有毒蘑菇中毒事件發(fā)生,以春夏季最為多見,常致人死亡。據(jù)報道[2], 2020年我國24個省份發(fā)生了676起蘑菇中毒事件,共計1 719人中毒,涉及約102種毒蘑菇,造成25人死亡,病死率為1.45%,其中17例由造成急性肝損害型的含鵝膏毒肽類(amatoxins)的毒蘑菇引起。引起中毒的蘑菇毒素種類較多,其中鵝膏毒肽類為致死的主要毒素,分布在鵝膏屬(Amanita)、環(huán)柄菇屬(Lepiota)和盔孢傘屬(Galerina)等蘑菇中的一類雙環(huán)八肽。目前，研究人員已經(jīng)分離出9種鵝膏毒肽,其中α-、β-、γ-鵝膏毒肽(α-、β-、γ-amanitin)在毒蘑菇中含量最高、毒性最大,是引起肝損害型中毒的主要毒素。鵝膏毒肽類人類致死量約為0.1 mg/(kg·bw),它們能強烈抑制細胞RNA聚合酶的活性,從而阻礙蛋白質(zhì)的合成,引起多種臟器細胞特別是肝細胞的壞死,導致中毒者6～16 d內(nèi)死亡[3-5]。

鵝膏毒肽引起的中毒往往要經(jīng)歷潛伏期(8～12 h)、胃腸炎期(8～48 h)、假愈期(48～72 h)和內(nèi)臟損害期(72～96 h),通常在攝入9～72 h后才出現(xiàn)中毒癥狀[3-7],對于沒有經(jīng)驗的醫(yī)療機構往往在病人攝入毒物數(shù)天后才能確診。此時鵝膏毒肽已進入肝、腎等組織,血液和尿液中鵝膏毒肽含量很低,即便是高靈敏的液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法也無法檢出,我們曾用超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法檢測了多起毒蘑菇中毒事件中數(shù)十份血液和尿液樣品[8],但均未檢出鵝膏毒肽,而在引起中毒的野生蘑菇和含野生蘑菇的食物樣本中檢出了高濃度的鵝膏毒肽和鬼筆毒肽[9,10]。Jaeger等[7]從中毒初期患者的血漿和尿液中檢出α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽，同時發(fā)現(xiàn)血漿和尿液中鵝膏毒肽的含量高度依賴于攝入毒物到采樣的時間間隔，攝入鵝膏毒肽后，可分別在24 h和72 h內(nèi)的血漿和尿液樣本中檢出鵝膏毒肽，超過這個時間間隔，樣品中鵝膏毒肽含量往往較低，難以檢出。文獻[11,12]認為檢測不出鵝膏毒肽的原因是檢測方法的靈敏度不夠。因此,開發(fā)建立一種檢測尿液和血漿中鵝膏毒肽的超高靈敏度的確證檢測方法,可以在中毒發(fā)生后更長的時間內(nèi)檢出鵝膏毒肽,對于疑似中毒病人的診斷、治療、降低死亡率都具有非常重要的現(xiàn)實意義。

目前尿液和血漿中鵝膏毒肽類的檢測方法主要有液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜法[10,13-19]和液相色譜-高分辨質(zhì)譜法[20,21]等,尿液的檢出限為0.15～5 ng/mL,血漿的檢出限為0.1～10 ng/mL。最近,徐小民等[22]報道了在線固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用檢測尿液中α-鵝膏毒肽的方法,方法檢出限達0.03 ng/mL,可以在中毒患者食用毒蘑菇72 h,甚至92 h后的尿液中檢出α-鵝膏毒肽,并在9名急性肝損害型中毒患者尿液中檢出α-鵝膏毒肽,含量分別為0.11～53.1 ng/mL。

本研究基于對超高效液相色譜分離條件、質(zhì)譜測定條件的優(yōu)化,提高了方法的靈敏度,特別是對免疫親和柱凈化條件的優(yōu)化,達到了尿液和血漿中痕量毒素高靈敏檢測的目的,為鵝膏毒肽類中毒的鑒別診斷以及確診提供了可靠的技術支持。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

Acquity I-Class超高效液相色譜儀(美國Waters公司); QTRAP 6500三重四極桿/線性離子阱復合質(zhì)譜儀(美國AB Sciex公司); MS3旋渦混旋器(德國IKA公司); Orion 5-star酸度計(美國Orion公司); 24孔N-EVAP氮吹儀(美國Organomation公司); Gradient A10 Mill-Q超純水器(法國Millipore公司)。

甲醇和乙腈為色譜級(德國Merck公司);丙酮和甲酸為色譜級(美國Tedia公司);鵝膏毒肽免疫親和柱(3 mL,北京華安麥科生物技術有限公司)。α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽和二羥鬼筆毒肽標準品(純度均大于90%,加拿大Alexis Biochemicals公司),用甲醇配制成100 μg/mL標準儲備溶液,保存于-35 ℃冰箱中。磷酸鹽緩沖溶液(PBS緩沖液,pH 7.3):稱取12.90 g十二水合磷酸氫二鈉、2.18 g二水合磷酸二氫鈉、8.50 g氯化鈉,用800 mL水溶解,調(diào)節(jié)pH至7.3,用水定容至1 000 mL。健康人血漿經(jīng)浙江省衛(wèi)生行政部門審批后由溫州市中心血站提供,尿液由健康志愿者提供。

1.2 標準溶液和質(zhì)控樣的制備

吸取各100 μL 3種鵝膏毒肽標準儲備溶液(100 μg/mL),于10 mL容量瓶中,用10%(v/v)甲醇水溶液定容,先制成3種鵝膏毒肽混合標準使用溶液(1.00 μg/mL)。然后再用10%(v/v)甲醇水溶液稀釋成3種鵝膏毒肽系列標準溶液(0.1、0.3、1.0、5.0、50和200 ng/mL)。

質(zhì)控樣品按歐洲藥品管理局(EMEA)等要求制備[23,24]。每次測定時在空白尿液和血漿中分別加入3種鵝膏毒肽,制成定量限(LOQ)、低(3×LOQ)、中(medium QC)和高(為85%的測定上限,high QC)4個水平的質(zhì)控樣品,其中尿液質(zhì)控樣品的水平分別為0.005、0.015、0.25和8.5 ng/mL,血漿質(zhì)控樣品水平分別為0.01、0.030、0.50和17.0 ng/mL。用于進行準確度、精密度、基質(zhì)效應、提取回收率和穩(wěn)定性等試驗。

1.3 樣品前處理

尿樣采集后保存于具塞塑料離心管中,于-20 ℃保存。全血樣品采集于含抗凝劑的采血管中,以3 000 r/min離心10 min,取上層血漿于塑料離心管中,于-20 ℃保存。

吸取2.00 mL尿樣或1.00 mL血漿,于15 mL塑料具塞離心管中,加入8.00 mL PBS緩沖溶液,混勻,以0.5～1.0 mL/min的流速上樣至免疫親和柱,再分別用10 mL PBS緩沖溶液和13 mL水淋洗,抽干,用3.00 mL甲醇-丙酮(1∶1, v/v)溶液洗脫,洗脫液于55 ℃水浴中氮氣吹干,加入100 μL 10%(v/v)甲醇水溶液溶解殘渣,溶解液過0.22 μm濾膜,濾液轉移至微量自動進樣瓶中,待測。

1.4 色譜條件

分析柱為Kinetex Biphenyl色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm)，保護柱為Security Guard ULTRA Kinetex Biphenyl(2.1 mm, 1.7 μm)(美國Phenomenex公司);柱溫45 ℃;流動相A:甲醇,流動相B: 0.005%(v/v)甲酸水溶液;流速:0.300 mL/min。梯度洗脫程序:0～6.0 min, 5%A～50%A; 6.0～6.1 min, 50%A～95%A; 6.1～8.0 min, 95%A; 8.0～8.1 min, 95%A～5%A; 8.1～10.0 min, 5%A。進樣體積:10 μL。

運行開始時,色譜柱流出液經(jīng)六通切換閥流至廢液;4.50～6.30 min,六通切換閥將柱流出液切換到質(zhì)譜。

1.5 質(zhì)譜條件

電噴霧電離源、負離子、多反應監(jiān)測(MRM)模式檢測。離子化電壓(IS): -4 500 V,離子源溫度(TEM): 500 ℃,氣簾氣(CUR)壓力:208 kPa,噴霧氣(GS1)壓力:312 kPa,輔助加熱氣壓力(GS2): 483 kPa,碰撞氣(CAD): High。其他參數(shù)見表1。

表 1 3種鵝膏毒肽的質(zhì)譜參數(shù)

2 結果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

文獻報道的鵝膏毒肽測定條件多在電噴霧電離正離子模式下進行[10,13-20],也少量報道在電噴霧電離負離子模式下進行[22]。利用針泵泵入鵝膏毒肽的標準溶液,在正負大氣壓化學電離方式下,3種鵝膏毒肽的響應值都較低。在電噴霧電離正離子模式下的質(zhì)譜可見[M+H]+、[M+Na]+和[M+K]+峰,但它們的碎片離子不穩(wěn)定,響應值也不高;而在電噴霧電離負離子模式下,出現(xiàn)了較強的[M-H]-峰,以[M-H]-作為母離子進行碰撞解離,通過子離子掃描得到目標化合物碎片離子的信息,見圖1,響應值優(yōu)于電噴霧電離正離子模式下的響應值。因此后續(xù)測定在電噴霧負離子方式下進行。

圖 1 3種鵝膏毒肽的子離子掃描質(zhì)譜圖Fig. 1 Product ion scan mass spectra of the three kinds of amanitins

實驗對去簇電壓、碰撞能量等參數(shù)進行優(yōu)化,使得分子離子對的信號達到最高。每種待測物選擇響應最高的兩對分子離子對,以其中響應高的分子離子對作為定量離子對,另一分子離子對作為定性離子對。優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見1.5節(jié)。

2.2 色譜條件的優(yōu)化

鵝膏毒肽類的分離大多在近中性條件下進行[10,13,15,18-20],也有在酸性[14]或堿性[25]條件下分離,大部分選用反相液相色譜柱[10,14-20,25],也有選用親水液相色譜柱[13]。本文首先采用通用性強的ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱(100 mm×2.1 mm, 1.7 μm, Waters公司)進行分離優(yōu)化,有機相分別采用甲醇和乙腈,水相分別采用水、2 mmol/L乙酸銨水溶液、0.05%氨水溶液和0.01%甲酸水溶液。實驗發(fā)現(xiàn),3種鵝膏毒肽的質(zhì)譜響應對流動相的組成非常敏感,與甲醇-水或乙腈-水相比較,乙酸銨對3種鵝膏毒肽的質(zhì)譜信號有明顯的抑制作用,而0.05%氨水或0.01%甲酸水溶液對3種鵝膏毒肽的質(zhì)譜信號有明顯的增強作用。嘗試了不同體積分數(shù)的氨水(0.01%～0.05%)作為水相,但是無論乙腈還是甲醇作為有機相時,3種鵝膏毒肽的質(zhì)譜響應均非常不穩(wěn)定。采用甲醇-0.01%甲酸水溶液或乙腈-0.01%甲酸水溶液作為流動相時,3種鵝膏毒肽的質(zhì)譜信號穩(wěn)定,其中以甲醇-0.01%甲酸水溶液響應值更高,但是α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽在BEH C18色譜柱上不能完全分離,而這2種鵝膏毒肽的母離子僅相差1 Da,α-鵝膏毒肽的M+1同位素峰在β-鵝膏毒肽的質(zhì)譜通道中有明顯的響應,因此必須將二者完全分離,否則α-鵝膏毒肽會干擾β-鵝膏毒肽的測定。

實驗再對不同體積分數(shù)的甲酸進行優(yōu)化,結果見圖2。3種鵝膏毒肽在甲醇-水中質(zhì)譜響應最低,在流動相中加入甲酸,3種鵝膏毒肽的質(zhì)譜響應值隨之增加,當甲酸體積分數(shù)為0.002 5%～0.005%時質(zhì)譜響應最高且達到平臺,此時α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽基本達到基線分離(分離度Rs為1.4),考慮到較大的緩沖容量易于保持保留時間的穩(wěn)定,因此選擇甲醇-0.005%(v/v)甲酸水溶液作為流動相進行后續(xù)試驗。標準溶液中3種鵝膏毒肽(0.1 ng/mL)的色譜圖見圖3。

圖 2 流動相中甲酸的體積分數(shù)對3種鵝膏毒肽響應值的影響Fig. 2 Effect of volume fractions of formic acid in the mobile phases on the responses of the three kinds of amanitins

圖 3 標準溶液中3種鵝膏毒肽(0.1 ng/mL)的色譜圖Fig. 3 Chromatograms of the three kinds of amanitins (0.1 ng/mL) in standard solution

2.3 樣品前處理條件的優(yōu)化

尿液和血漿中鵝膏毒肽的常見樣品前處理方法有反相固相萃取法[13-15,20]、陽離子交換固相萃取法[19]、Turboflow在線固相萃取法[18,26]和在線固相萃取法[22],這些方法均屬于非特異性凈化方法,選擇性不強,去除雜質(zhì)效果不好,而尿液和血漿基質(zhì)又非常復雜,樣品中基質(zhì)成分會影響檢測方法的靈敏度、準確度和精密度。Maurer等[16]提出了免疫親和柱凈化方法,選擇性強、凈化效果好,但需要制備抗原、提取和純化抗體等煩瑣的操作,且α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽的絕對回收率分別僅有61%～63%和57%～58%,方法的靈敏度不高。

本實驗采用商品化免疫親和柱,上樣各250 ng的α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽、羧基二羥鬼筆毒肽和二羥鬼筆毒肽,平行測定3次,測得α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽、γ-鵝膏毒肽的平均吸附率分別為83.6%、89.6%和86.4%,羧基二羥鬼筆毒肽和二羥鬼筆毒肽的平均吸附率均為0,說明免疫親和柱特異性較強,只保留3種鵝膏毒肽,而不保留羧基二羥鬼筆毒肽和二羥鬼筆毒肽。取1.0 μgα-鵝膏毒肽上樣,平行測定4次,測得最大柱容量為670 ng,柱容量較大。

尿液和血漿樣品經(jīng)PBS緩沖溶液(pH 7.3)稀釋,確保上樣液的pH在6～8范圍內(nèi),符合免疫親和柱對上樣液pH的要求。樣品上樣后先用PBS緩沖溶液淋洗除去內(nèi)源性雜質(zhì),然后再用水淋洗除去PBS緩沖溶液中的鹽分,避免了磷酸緩沖鹽對質(zhì)譜的不良影響。分別采用甲醇、2%乙酸甲醇溶液、甲醇-丙酮(1∶1, v/v)、乙腈、2%乙酸乙腈溶液和乙腈-丙酮(1∶1, v/v)作為洗脫劑進行3次洗脫,洗脫體積分別為2.0、1.0和1.0 mL,它們對3種鵝膏毒肽的洗脫率見圖4。在6種洗脫劑中甲醇-丙酮(1∶1, v/v)的洗脫效果最好,采用3.0 mL洗脫時,3種鵝膏毒肽的絕對回收率分別為99.9%、93.9%、99.3%,明顯優(yōu)于文獻[16]報道結果。對6份來自不同個體的空白尿液和空白血漿樣品進行測定,結果未顯示有任何影響3種鵝膏毒肽的干擾峰，凈化效果好，方法選擇性強。

2.4 標準曲線和線性范圍

采用1.4和1.5節(jié)條件對1.2節(jié)配制的標準溶液進行測定。以定量離子對的峰面積(Y)對標準溶液的質(zhì)量濃度(X, μg/L)進行回歸(權重取1/X),α-鵝膏毒肽、β-鵝膏毒肽和γ-鵝膏毒肽在0.1～200 ng/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關系,線性方程分別為Y=5.290×104X+8.351×102、Y=2.332×104X+3.228×102和Y=5.450×104X+6.988×102,相關系數(shù)(r)均大于0.999。

2.5 檢出限和定量限

在空白尿液和空白血漿樣品中分別加入系列低濃度的待測物進行測定,以分子離子對的信噪比≥3和≥10時的含量分別作為檢出限(LOD)和定量限(LOQ),同時定量限還要滿足準確度在標稱值的±20%之內(nèi)、精度小于20%的要求。當尿液取樣量為2.00 mL時,測得3種鵝膏毒肽檢出限和定量限均為0.002 ng/mL和0.005 ng/mL;當血漿取樣量為1.00 mL時,測得3種鵝膏毒肽檢出限和定量限均為0.004 ng/mL和0.01 ng/mL。方法的靈敏度比文獻[10,13-20]報道值有數(shù)十倍的提高。

2.6 基質(zhì)效應和提取回收率

基質(zhì)效應和提取回收率采用Matuszewski等[27]提出的簡易評估方法進行評估,在定量限、低、中、高4種水平下制備了3組樣品。第1組是以10%(v/v)甲醇水溶液為溶劑的純?nèi)軇藴氏盗?平行樣6份;第2組則是取6份來自6個不同個體的空白尿液或空白血漿樣品經(jīng)樣品前處理后,加入與第1組相同濃度的待測物制成的尿液或血漿的基質(zhì)標準系列;第3組采用與第2組相同的空白樣品,加入與第1組相同系列濃度的待測成分,樣品前處理后得到的尿液或血漿基質(zhì)加標系列。進樣分析分別得到測得每個水平濃度的峰面積(A、B和C),然后分別計算每個水平的基質(zhì)效應和提取回收率及相應的變異系數(shù),其中:基質(zhì)效應=B/A×100%,提取回收率=C/B×100%。

測得尿液和血漿中3種鵝膏毒肽的平均基質(zhì)效應和提取回收率以及相應的變異系數(shù)見附表1(詳見https://www.chrom-China.com)。3種鵝膏毒肽的基質(zhì)效應和提取回收率分別為92%～108%和90%～103%,變異系數(shù)均小于13%,說明來自6個不同個體的尿液均無明顯的基質(zhì)效應,提取回收率又接近100%,因此可以采用溶劑標準外標法定量,方便操作。

2.7 準確度和精度

8個連續(xù)工作日對定量限、低、中和高等4種水平的尿液和血漿質(zhì)控樣品進行測定,每個水平平行測定2份,計算平均含量、準確度、重復性(RSDr)和中間精度(RSDt),其中準確度以標稱濃度的偏差來表示。以單因素方差解析法(ANOVA)計算重復性和中間精度[24]

測得的準確度、重復性和中間精度見附表1,尿液和血漿中3種鵝膏毒肽的準確度分別為-9.4%～8.0%和-13%～8.0%,重復性分別為3.0%～14%和3.9%～9.7%,中間精度分別為3.5%～18%和5.5%～12%,符合歐洲藥品管理局(EMEA)關于方法確認的要求[23]。

2.8 穩(wěn)定性

系列溶劑標準溶液儲存于聚丙烯自動進樣瓶中,在(15±5) ℃下至少穩(wěn)定1個月。加標水平為0.015 ng/mL和8.5 ng/mL的尿液樣品和0.030 ng/mL和17.0 ng/mL的血漿樣品處理液在(15±5) ℃下在1周內(nèi)可穩(wěn)定保存。

在(15±5) ℃下保存,尿液中加標水平為0.015 ng/mL的α-鵝膏毒肽和γ-鵝膏毒肽在3 d內(nèi)穩(wěn)定,β-鵝膏毒肽穩(wěn)定性較差,第1天分解了11%,第3天分解了27%(見圖5a);尿液中加標水平為8.5 ng/mL的γ-鵝膏毒肽在15 d內(nèi)穩(wěn)定,α-鵝膏毒肽和β-鵝膏毒肽則只在3 d內(nèi)穩(wěn)定(見圖5b)。在4 ℃下保存,尿液中α-鵝膏毒肽和γ-鵝膏毒肽至少在15 d內(nèi)穩(wěn)定,而低水平β-鵝膏毒肽在3 d內(nèi)穩(wěn)定,高水平β-鵝膏毒肽在6 d內(nèi)穩(wěn)定。尿液中3種鵝膏毒肽于-20 ℃保存1個月后再測定,沒有明顯分解;2個月后再測定,α-鵝膏毒肽和γ-鵝膏毒肽穩(wěn)定,而β-鵝膏毒肽則有分解。

圖 5 空白加標尿液在(15±5) ℃和4 ℃條件下的穩(wěn)定性試驗Fig. 5 Stability tests for blank spiked urine samples stored at (15±5) ℃ and 4 ℃a. 0.015 ng/mL; b. 8.5 ng/mL.

血漿樣品中3種鵝膏毒肽比較穩(wěn)定,在(15±5) ℃、4 ℃和-20 ℃下保存3個月沒有明顯的分解,與文獻[14]報道相一致。甚至血漿樣品在-20 ℃下冷凍保存7個月,α-鵝膏毒肽無明顯分解。

經(jīng)過3個過夜冷凍(-20 ℃, 4 h)室溫融化過程后,加標水平為0.015 ng/mL、8.5 ng/mL的尿液樣品和0.030 ng/mL、17.0 ng/mL的血漿中3種鵝膏毒肽沒有明顯分解。

2.9 實際應用

2020年6月5日浙江省溫州市發(fā)生一起食用野生蘑菇的中毒事件,1人中毒,患者于6月5日中餐和晚餐食用了野生蘑菇,6日就醫(yī)時出現(xiàn)肝損害癥狀。6月11日中午采集尿液(晚餐攝入野生蘑菇后138 h),按本法進行前處理,測得尿中α-鵝膏毒肽的含量為0.006 7 ng/mL,β-鵝膏毒肽的含量為0.005 9 ng/mL,γ-鵝膏毒肽未檢出。尿液的MRM色譜圖見圖6a。

圖 6 實際中毒(a)尿液樣品和(b)血漿樣品的MRM色譜圖Fig. 6 MRM chromatograms of actual poisoned (a) urine sample and (b) plasma sample

2021年3月對-20 ℃冷凍保存7個月的血漿樣品(采樣時間距離攝入野生蘑菇20 h,浙江省疾病預防控制中心友情贈予)進行測定,樣品取200 μL,按本文方法處理后定容至100 μL,測得α-鵝膏毒肽的含量為0.225 ng/mL,與浙江省疾病預防控制中心原測定值0.20 ng/mL一致,同時還測得β-鵝膏毒肽的含量為0.203 ng/mL,γ-鵝膏毒肽未檢出,其MRM色譜圖見圖6b。

3 結論

本文建立了高靈敏測定尿液和血漿中3種鵝膏毒肽的超高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜分析方法。通過對色譜分離條件、質(zhì)譜檢測條件和樣品前處理方法的優(yōu)化,方法得到了較高的檢測靈敏度;通過對免疫親和柱樣品凈化效果和基質(zhì)效應的評估,證明了樣品前處理方法的有效性。方法學驗證結果表明,本法靈敏度高、選擇性好、定量準確、精密,已應用于鵝膏毒肽實際中毒樣品的檢測,得到滿意結果。本法已成功解決中毒患者尿液和血漿中超痕量鵝膏毒肽的檢測難題,對于疑似中毒病人的早診斷、早治療、降低死亡率都具有非常重要的現(xiàn)實意義,也為今后開展此類毒素的毒理作用及機體代謝規(guī)律的研究提供了可靠的技術支撐。