張連美，朱亞寧，孫蘇安

南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院病理科，江蘇 淮安 223300

心包積液在臨床中較為常見(jiàn)，其中惡性腫瘤性心包積液的比例約為20%，惡性腫瘤性心包積液可能導(dǎo)致患者出現(xiàn)心臟壓塞及血流動(dòng)力學(xué)改變，甚至可能是腫瘤患者的首發(fā)癥狀[1]。因此，臨床上快速準(zhǔn)確地找到惡性心包積液的腫瘤來(lái)源，對(duì)后續(xù)治療和預(yù)后具有重要意義。心包積液較為隱匿，直接穿刺心包，獲取心包積液并進(jìn)一步鑒定其理化性質(zhì)和細(xì)胞學(xué)成分是診斷惡性心包積液最主要的方法[2]。然而，目前尚無(wú)特異性的檢測(cè)指標(biāo)和明確的診斷標(biāo)準(zhǔn)，這給惡性心包積液的診斷造成了困難[3]。本研究對(duì)50例惡性心包積液標(biāo)本給予細(xì)胞蠟塊聯(lián)合基因檢測(cè)，以確定腫瘤來(lái)源，并分析肺腺癌標(biāo)本的腫瘤基因突變情況，以期為肺腺癌的個(gè)體化治療提供幫助，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象

選取2015年1月至2020年12月南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院送檢至病理科的50例惡性心包積液患者的惡性心包積液標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：年齡≥18歲；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并其他惡性腫瘤。50例患者中，男31例，女19例；年齡26～85歲，平均（65.4±4.6）歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審批通過(guò)，所有患者均對(duì)本研究知情同意并簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

細(xì)胞學(xué)涂片及蠟塊制備：收集200～500 ml心包積液，室溫靜置20 min后，去除一半上清液，再次室溫靜置20 min，去除一半上清液，直至液體量少于50 ml，將液體收集至10 ml離心管中，共5管，室溫3000 r/min離心5 min后，去除上清液，吸取沉淀進(jìn)行細(xì)胞涂片，固定后進(jìn)行染色。在沉淀物中輕輕加入95%酒精，3000 r/min離心5 min，室溫下靜置2 h，去除上清液，取出沉淀物，經(jīng)常規(guī)石蠟包埋制備蠟塊，蘇木素-伊紅（hematoxylin and eosin，HE）染色后在光鏡下進(jìn)行觀察，記錄并分析結(jié)果。

細(xì)胞蠟塊免疫組化染色：采用全自動(dòng)免疫組化染色儀進(jìn)行免疫組化染色，所有抗體均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，常規(guī)設(shè)置陽(yáng)性和陰性對(duì)照。細(xì)胞蠟塊切片厚度為2.0～3.0 μm，60℃放置1 h后，根據(jù)細(xì)胞學(xué)涂片、細(xì)胞蠟塊切片中的細(xì)胞學(xué)形態(tài)以及患者的臨床病史選擇相應(yīng)的特異性免疫組化抗體，主要包括鈣網(wǎng)膜蛋白（calretinin，CR）、間皮細(xì)胞（mesothelial cell，MC）、腎母細(xì)胞瘤基因1（Wilms tumor 1，WT1）、癌胚抗原M2A單克隆抗體D2-40、尾型同源盒轉(zhuǎn)錄因子2（caudate homeobox transcription factor 2，CDX2）、絨毛蛋白（villin）、黏蛋白5AC（mucin 5AC，MUC5AC）、甲狀腺轉(zhuǎn)錄因子-1（thyroid transcription factor-1，TTF-1）、天冬氨酸肽酶A（napsin A）、細(xì)胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）、神經(jīng)細(xì)胞黏附分子（neural cell adhesion molecule，NCAM，又稱(chēng) CD56）、嗜鉻粒蛋白 A（chromogranin A，CgA）、突觸素（synapsin，Syn）、細(xì)胞角蛋白 5/6（cytokeratin 5/6，CK5/6）、p63、p40、p16、雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長(zhǎng)因子受體 2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）、GATA結(jié)合蛋白3（GATA binding protein 3，GATA3）、叉 頭 框 蛋 白 A1（forkhead box A1，F(xiàn)OXA1）、配對(duì)盒轉(zhuǎn)錄因子8（paired box 8，PAX8）、糖類(lèi)抗原125（carbohydrate antigen 125，CA125）、廣譜細(xì)胞角蛋白（pan cytokeratin，p-CK）、上皮細(xì)胞膜抗原（epithelial membrane antigen，EMA）、波形蛋白（vimentin）等，根據(jù)細(xì)胞蠟塊的免疫組化陽(yáng)性結(jié)果判斷腫瘤來(lái)源及病理分型。

基因突變檢測(cè)：將診斷為肺腺癌來(lái)源的惡性心包積液的細(xì)胞蠟塊切成切片卷，置于1.5 ml離心管中，提取表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、棘皮動(dòng)物微管相關(guān)樣蛋白4（echinoderm microtubule associated protein like 4，EML4）-間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）的DNA，試劑盒購(gòu)自廈門(mén)艾德生物醫(yī)藥科技有限公司，具體步驟按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，提取后確定DNA樣本的濃度與質(zhì)量。采用安捷倫Mx3000P實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀檢測(cè)EGFR突變情況，采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription PCR，RT-PCR）分析EML4-ALK融合基因情況，設(shè)立陰性、陽(yáng)性對(duì)照，記錄兩種基因類(lèi)型的陽(yáng)性范圍Ct值。

2 結(jié)果

2.1 惡性心包積液細(xì)胞蠟塊組織切片觀察

惡性心包積液細(xì)胞蠟塊組織切片中，腺癌細(xì)胞呈腺樣、乳頭狀、條索狀排列或單個(gè)散在，細(xì)胞異型性明顯，核質(zhì)比例增大；鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞聚集呈巢團(tuán)狀或片巢狀排列，細(xì)胞質(zhì)嗜酸性，細(xì)胞核深染，可見(jiàn)細(xì)胞間橋；小細(xì)胞癌細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞較小，但較背景淋巴細(xì)胞大，呈圓形或卵圓形、細(xì)胞質(zhì)極少，細(xì)胞核深染，部分細(xì)胞呈拉長(zhǎng)、變形、擠壓的燕麥狀；惡性間皮瘤上皮成分常呈乳頭狀、腺樣、實(shí)性、腺泡樣、微乳頭樣排列，肉瘤區(qū)常見(jiàn)梭形細(xì)胞呈短束狀排列。（圖1）

圖1 轉(zhuǎn)移性肺腺癌的惡性心包積液涂片、細(xì)胞蠟塊組織切片及免疫組化染色結(jié)果

2.2 50例惡性心包積液經(jīng)細(xì)胞蠟塊結(jié)合免疫組化染色的分型診斷結(jié)果

50例惡性心包積液經(jīng)細(xì)胞蠟塊聯(lián)合免疫組化染色，結(jié)果顯示，腺癌40例，小細(xì)胞癌4例，鱗狀細(xì)胞癌5例，惡性間皮瘤l例，其中腺癌來(lái)源：肺30例，乳腺3例，消化道5例，卵巢2例。肺腺癌30例，TTF-1、napsin A、CEA均呈陽(yáng)性表達(dá)；乳腺癌3例，GATA3、FOXA1均呈陽(yáng)性表達(dá)，ER、PR、HER2均呈不同程度表達(dá)；消化道腺癌5例，CDX2、villin、MUC5AC均呈陽(yáng)性表達(dá)；卵巢癌2例，PAX8、CA125、p16、WT1均呈陽(yáng)性表達(dá)；小細(xì)胞癌4例，CD56、Syn均呈陽(yáng)性表達(dá)，CgA呈不同程度表達(dá)；鱗狀細(xì)胞癌5例，CK5/6、p63、p40均呈陽(yáng)性表達(dá)；惡性間皮瘤l例，CR、MC、WT1、D2-40均呈陽(yáng)性表達(dá)。

2.3 腫瘤基因突變檢測(cè)結(jié)果

30例源于肺腺癌的惡性心包積液細(xì)胞蠟塊中，EGFR基因突變11例，其中19del突變5例、L858R突變6例，EML4-ALK融合基因1例，其余18例未見(jiàn)EGFR基因突變及EML4-ALK融合基因。（圖2）

圖2 肺腺癌患者惡性心包積液細(xì)胞胞蠟中EGFR 基因的突變情況

3 討論

當(dāng)腫瘤患者出現(xiàn)惡性心包積液并伴有胸悶、呼吸困難、心悸等癥狀時(shí)，表明患者的腫瘤已經(jīng)擴(kuò)散并發(fā)展至晚期，其發(fā)生機(jī)制可能是腫瘤細(xì)胞播散于心包腔表面，導(dǎo)致心包的分泌和再吸收功能受損[4]。心包積液標(biāo)本不僅易于收集，創(chuàng)傷小，安全可靠，患者容易接受，而且能夠迅速地作出明確診斷，獲得了臨床醫(yī)師和患者的廣泛認(rèn)可[5]。

本研究結(jié)合患者的臨床資料、細(xì)胞學(xué)特征及免疫組化結(jié)果分析50例惡性心包積液的組織學(xué)來(lái)源及類(lèi)型，結(jié)果顯示，來(lái)源于腺癌40例、小細(xì)胞癌4例、鱗狀細(xì)胞癌5例、惡性間皮瘤1例。腺癌來(lái)源：肺30例，乳腺3例，消化道5例，卵巢2例。細(xì)胞蠟塊聯(lián)合免疫組化診斷心包積液的良惡性及判斷其來(lái)源的準(zhǔn)確率明顯高于常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片。與細(xì)胞學(xué)涂片相比，細(xì)胞蠟塊組織切片中腺癌細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和常規(guī)組織HE切片相似，細(xì)胞聚集呈腺樣、乳頭狀或單發(fā)散在，腫瘤細(xì)胞具有明顯的異型性，背景中的間皮細(xì)胞密集分布或平鋪分布，腺腔很少形成[6-7]。常規(guī)組織HE切片上的鱗狀細(xì)胞癌，細(xì)胞嵌套，可見(jiàn)細(xì)胞間橋。小細(xì)胞癌涂片和組織切片上的細(xì)胞形態(tài)相似，細(xì)胞小，呈圓形或燕麥樣，細(xì)胞質(zhì)極少，細(xì)胞界限不清[8]。一些晚期腫瘤患者的第一癥狀是體腔積液[9]。傳統(tǒng)的細(xì)胞學(xué)涂片只能對(duì)惡性腫瘤細(xì)胞進(jìn)行診斷，而不能診斷其來(lái)源[10]。細(xì)胞蠟塊可連續(xù)反復(fù)切片，通過(guò)免疫組化染色可判斷腫瘤分型及部分腫瘤來(lái)源，常規(guī)細(xì)胞學(xué)涂片聯(lián)合細(xì)胞蠟塊HE染色明顯提高了惡性心包積液的診斷率[11-12]。CR、MC、WT1、D2-40是間皮細(xì)胞的標(biāo)志物，CDX2、villin、MUC5AC是消化道來(lái)源的標(biāo)志物，TTF-1、napsinA是肺腺癌的標(biāo)志物，CD56、CgA和Syn是小細(xì)胞癌的標(biāo)志物，CK5/6、p63、p40是鱗狀細(xì)胞癌的標(biāo)志物，ER、PR、HER2、GATA3、FOXA1是 乳 腺 癌 的 標(biāo) 志 物 ，PAX8、CA125、p16、WT1是卵巢癌的標(biāo)志物[13]。

近年來(lái)，肺癌的發(fā)病率呈顯著上升趨勢(shì)，而非小細(xì)胞肺癌約占原發(fā)性肺癌的80%[14]。隨著對(duì)腫瘤發(fā)病機(jī)制的深入研究，分子靶向治療已成為肺癌治療的研究熱點(diǎn)，如EGFR-酪氨酸激酶抑制劑（tyrosine kinase inhibitor，TKI）是一種應(yīng)用較為廣泛的分子靶向治療藥物[15]。EGFR基因位于人類(lèi)7號(hào)染色體短臂的12～14區(qū)，包含28個(gè)外顯子，其中18～24外顯子可以編碼該受體的酪氨酸激酶部分，但超過(guò)90%的EGFR突變發(fā)生在19～21外顯子，尤其是19外顯子，約占所有突變的60%，而19外顯子堿基缺失和21外顯子的點(diǎn)突變往往對(duì)EGFR-TKI治療敏感。突變后EGFR可不依賴(lài)表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）而進(jìn)行自激活，EGFR作為一種酪氨酸蛋白激酶受體，與相應(yīng)配體結(jié)合后激活酪氨酸激酶（tyrosine kinase，TK），使其磷酸化，從而激活下游的磷脂酰肌醇3激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）-蛋白激酶B（protein kinase，PKB，又稱(chēng)AKT）-雷帕霉素靶蛋白（mechanistic target of rapamycin kinase，MTOR）通路和鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子（son of sevenless，SOS）-大鼠肉瘤蛋白（rat sarcoma，RAS）-迅速加速性纖維肉瘤蛋白（rapidly accelerated fibrosarcoma，RAF）-絲裂原活化的細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（mitogen-activated extracellular signal-regulated kinase，MEK）-絲裂原活化 蛋 白 激 酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）通路，使自噬減少，同時(shí)加速轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）、白細(xì)胞介素（interleukin，IL）-8、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）和血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的分泌，促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)，使腫瘤細(xì)胞獲得不死性，進(jìn)入“瘋長(zhǎng)-分裂”的惡性循環(huán)模式。因此，EGFR的過(guò)表達(dá)或活性增強(qiáng)均會(huì)使細(xì)胞生長(zhǎng)加快，自噬受到抑制，導(dǎo)致腫瘤的產(chǎn)生。靶向藥物EGFR-TKI可靶向EGFR的酪氨酸激酶的胞內(nèi)區(qū)，使其活性減弱，自噬增強(qiáng)，從而達(dá)到治療目的。EML4-ALK融合基因是非小細(xì)胞肺癌一個(gè)重要的治療靶點(diǎn)。ALK包含許多重要的生物學(xué)信號(hào)通路，影響腫瘤細(xì)胞的增殖、分化與凋亡[16]。本研究結(jié)果顯示，肺腺癌患者的惡性心包積液細(xì)胞蠟塊中，EGFR基因突變11例，其中19del突變5例、L858R突變6例，EML4-ALK融合基因1例，其余18例均未見(jiàn)EGFR基因突變及EML4-ALK融合基因。臨床醫(yī)師可以根據(jù)基因突變情況給予患者個(gè)性化的分子靶向治療，從而改善患者的治療效果和預(yù)后。

綜上所述，惡性心包積液細(xì)胞蠟塊聯(lián)合基因檢測(cè)可為腫瘤起源及分型提供線索，并有利于肺腺癌個(gè)體化治療方案的制訂。