華茂圳，黃寶生 ，俞濤濤，蔣樂霞，張家國 ，張長峰，孫崇德

（1. 上海海洋大學(xué)水產(chǎn)科學(xué)國家級實驗教學(xué)示范中心，上海 201306；2. 山東省農(nóng)產(chǎn)品貯運保鮮技術(shù)重點實驗室，山東 濟南 250103；3. 國家農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)代物流工程技術(shù)研究中心，山東 濟南 250103；4. 廣東海洋大學(xué)，廣東 湛江 524000）

0 引言

【研究意義】斑石鯛（Oplegnathus punctatus），俗稱斑鯛、花金鼓、黑金鼓，極具食用與醫(yī)用價值，肉質(zhì)獨特，口感豐富，富含多種氨基酸與不飽和脂肪酸，可用于治療脾腎虛寒、產(chǎn)后腰痛、陰虛消渴等，食用方法以刺身為主，在日本料理中具有“刺身絕品”之譽[1]，是極具商業(yè)價值的優(yōu)質(zhì)海水魚。其中鮮活斑石鯛售價最高，可達(dá)200 元·kg?1[2]。但當(dāng)前斑石鯛的運輸還是停留在有水運輸階段，運輸過程需要大量的水輔助，運輸途中由于斑石鯛的呼吸和排泄，水質(zhì)快速惡化，斑石鯛產(chǎn)生嚴(yán)重應(yīng)激反應(yīng)，損傷免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致大量死亡，運輸成活率偏低。因此如何減緩運輸途中的應(yīng)激反應(yīng)，提高成活率，滿足市場需求，具有重要研究價值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】無水活運技術(shù)是一種綠色環(huán)保、無污染、安全、優(yōu)質(zhì)和高效的新型冷鏈活體物流技術(shù)[3]。該技術(shù)是通過物理降溫手段使活體處于休眠或半休眠狀態(tài)，降低新陳代謝速率，減緩應(yīng)激反應(yīng)，實現(xiàn)長時間運輸?shù)耐瑫r，提高存活率[4?6]。研究表明[7?10]，物理降溫誘導(dǎo)休眠可以有效提高牙鲆（Paralichthysolivaceus）、大菱鲆（Scophthalmus maximus）、半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis）、鯽 魚（Carassius auratus auratus）、珍珠 龍 膽 石 斑 魚 （♀Epinephelusfuscoguttatus×♂Epinepheluslanceolatus）、鯪魚（Cirrhinus molitorella）、尼羅羅非魚（Oreochromis niloticus）、黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）等魚類的運輸時長和存活率，保證肌肉品質(zhì)的同時，有效降低皮質(zhì)醇、腎上腺素等激素的質(zhì)量濃度，緩解應(yīng)激反應(yīng)和機體損傷。以上研究充分說明部分水產(chǎn)品可以通過降溫誘導(dǎo)休眠的方式無水保活，但降溫方式多采用循環(huán)水系統(tǒng)或冷水機降溫，方式粗糙，難以實現(xiàn)精準(zhǔn)恒定降溫速率降溫。降溫速率的變化對魚類的應(yīng)激反應(yīng)和品質(zhì)產(chǎn)生一定的影響，張玉晗[4]等發(fā)現(xiàn)不同降溫速率對花鱸無水?；钚Ч町愶@著，3 ℃·h?1降溫處理的花鱸肝臟損傷程度低于1、5 ℃·h?1降溫組，這與加州鱸、鯽魚的研究結(jié)果一致[10?11]。【本研究切入點】目前，關(guān)于不同降溫速率對斑石鯛無水?；钸^程中生理應(yīng)激反應(yīng)的影響還缺乏相關(guān)研究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過國家農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)代物流工程技術(shù)研究中心自主研發(fā)的鮮活水產(chǎn)品智能冷馴化喚醒箱，精準(zhǔn)控制降溫速率，通過比較不同降溫速率條件下不同保活時間對魚體生理代謝指標(biāo)和應(yīng)激反應(yīng)的代表性激素變化情況，確定合理的降溫方法，為斑 石鯛無水?；钐峁├碚摶A(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

試驗用斑石鯛購自山東萊州明波水產(chǎn)公司，挑選健康活躍、體表無損傷、大小均勻的60 尾成魚用于試驗，個體初始體重（330 ± 46） g，暫養(yǎng)于國家農(nóng)產(chǎn)品現(xiàn)代物流工程技術(shù)研究中心水產(chǎn)品控溫循環(huán)水過濾系統(tǒng)中，水溫（18 ± 1 ）℃，溶氧為6 mg·L?1以上，pH 為7～8，鹽度為31‰，暫養(yǎng)2 d 后進(jìn)行試驗。

魚皮質(zhì)醇（Cortisol）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、魚腎上腺素（E）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、MDA 檢測試劑盒、乳酸（LAC）測試盒、糖原（Glycogen）測定試 劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.2 儀器與設(shè)備

全自動生化分析儀BK-280，山東博科生物產(chǎn)業(yè)有限公司；紫外分光光度計T9S，北京譜析通用儀器有限責(zé)任公司；Multiscan MK3 酶標(biāo)儀，賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；臺式高速冷凍離心機H205OR，湖南湖儀實驗室儀器開發(fā)有限公司；醫(yī)用低溫保存箱DW-86L626，青島海爾生物醫(yī)療股份有限公司；鮮活水產(chǎn)品智能冷馴化/喚醒箱，山東省農(nóng)產(chǎn)品貯運保鮮技術(shù)重點實驗室自主研發(fā)（專利號ZL201310447777.8）；人工氣候箱QHX-300BSH-Ⅲ，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；水產(chǎn)養(yǎng)殖及循環(huán)水處理系統(tǒng)，青島中科海水處理設(shè)備工程有限公司；高速振蕩機CM-1000，上海愛朗儀器有限公司；數(shù)顯恒溫水浴鍋HH-S4，金壇市醫(yī)療儀器廠；電子天平JZ-06-004，上海菁海儀器有限公司；優(yōu)普系列超純水器UPR-11-10T；塑料自封袋、充氣泵、數(shù)字溫度計、秒表、5 mL 注射器 、解剖刀、紗布、抗凝管。

1 .3 試驗方法

1.3.1 冷馴化處理 通過自主設(shè)計的冷馴化智能降溫裝置完成對斑石鯛的冷馴化[12]。裝置按照1、3、5 ℃·h?1降溫速率將暫養(yǎng)池中的水溫從17.5～18.5 ℃降至生態(tài)冰溫點10 ℃，各組降溫時長分別為7.8 h、2.5 h、1.6 h，此時斑石鯛呼吸頻率（33±3） 次·min?1，失去平衡，腹部向上，魚鰓不能完全閉合，應(yīng)激反應(yīng)微弱，呼吸不規(guī)律，伴隨魚體劇烈扭動，對觸及反 應(yīng)已無明顯響應(yīng)。

1.3.2 無水保活 冷馴化處理后的斑石鯛裝入內(nèi)壁濕潤的自封袋內(nèi)，將空氣排空后，用封口機對塑料袋封口，充入氧氣，放進(jìn)人工氣候箱進(jìn)行無水保活，?；顪囟雀鶕?jù)前期的預(yù)試驗結(jié)果設(shè)定為10 ℃。試驗組共分為3 組，每組樣品30 條。取樣時間點為：無水保活0 h、2 h、4 h、6 h，各個時間點觀察記錄一次 成活率并隨機取出3 尾魚取樣進(jìn)行指標(biāo)測定。

1.3.3 指標(biāo)測定 斑石鯛從人工氣候箱中取出后，尾靜脈取血，用規(guī)格為1 mL 的一次性注射器取血5 mL 以上，取出的血液在4 ℃冰箱放置5 h 后，4 ℃、12 000 r·min?1離心15 min，取上清液放入 80 ℃冰箱保存，取完血的斑石鯛放置在盛有冰塊的托盤中解剖，取出肝臟和肌肉，放入80 ℃冰箱保存。

（1）血清中皮質(zhì)醇、腎上腺素的測定

分別采用魚皮質(zhì)醇（Cortisol）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒、魚腎上腺素（EPI）酶聯(lián)免疫檢測試劑盒檢測血清中皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度（ng·mL?1）和腎上腺素質(zhì)量濃度（ng·mL?1）。測定斑石鯛降溫前腎上腺素和皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度值分別為（45.34 ± 2.16） ng·mL?1、（58.09 ± 4.07） ng·mL?1。

（2）肝糖原、肌糖原、乳酸含量的測定

采用糖原（Glycogen）測定試劑盒分別檢測肝臟中肝糖原含量（mg·g?1）和肌肉中肌糖原含量（mg·g?1）；采用乳酸（LAC）測試盒檢測血清中乳酸含量（mmol·L?1）。測定斑石鯛降溫前肝糖原、肌糖 原、乳 酸 含 量 分 別 為（15.17 ± 2.56） mg·g?1、（1.38 ± 0.11） mg·g?1、（4.34 ± 0.46） mmol·L?1。

（3）血清生化指標(biāo)的分析

制備好的血清采用全自動生化分析儀測定生化指標(biāo)，項目包括谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、血糖（GLU）；采用丙二醛（MDA）測試盒檢測血清中丙二醛含量（nmol·mL?1）。測定斑石鯛降溫前谷草轉(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、血糖、丙二醛 含 量 分 別 為（113.06 ± 4.27） U·L?1、（17.45 ±2.47） U·L?1、（4.35 ± 1.24） mmol·L?1、（1.45 ± 0.23）n mol·mL?1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

應(yīng)用SPSS 22.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計分析，顯著性差異采用Duncan 多重比較法，圖表的繪制采用O rigin 2018 軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同降溫速率對斑石鯛無水?；钸^程中存活率的影響

如表1 所示，斑石鯛經(jīng)過冷馴化后無水?；?，各處理組存活率明顯下降，分別為60%、76.7%、46.7%。其中，5 ℃·h?1降溫組在保活2 h 便出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，且隨著?；顣r間的延長，存活率不斷下降，為3 個處理組中最低。3 ℃·h?1降溫處理組經(jīng)過6 h 無水?；钸^程后，存活率最高，但仍與業(yè)界期望值存在差距。

表1 不同降溫速率下斑石鯛保活不同時間的存活率Table 1 Survival rates of O. punctatus chilled at various temperature lowering rates out-of-water for different durations

2.2 不同降溫速率對斑石鯛無水?；钸^程中腎上腺素和皮質(zhì)醇的影響

如表2 所示，與斑石鯛降溫前腎上腺素質(zhì)量濃度（45.34 ± 2.16） ng·mL?1相比，各處理組試驗魚無水?；? h，血清腎上腺素質(zhì)量濃度均明顯升高。無水?；钸^程中，3、5 ℃·h?1降溫處理組血清腎上腺素呈下降趨勢，1 ℃·h?1降溫處理組呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。無水?；? h，5 ℃·h?1降溫處理組血清腎上腺素質(zhì)量濃度顯著高于1、3 ℃·h?1降溫組（P＜0.05）；無水?；? h，3 ℃·h?1降溫處理組血清腎上腺素質(zhì)量濃度顯著低于1 ℃·h?1降溫處理組，與5 ℃·h?1降溫處理組無顯著差異（P＞0.05）。無水?；钸^程中，3 ℃·h?1降溫處理組血清腎上腺素質(zhì)量濃度除無水保活0 h 外，均顯著低于1 ℃·h?1降溫處理組（P＜0.05）。同時，比較無水保活4～6 h， 1、3、5 ℃·h?1降溫處理組斑石鯛腎上腺素含量分別下降了56.9%、11.24%、25.26%。

表2 不同降溫速率對斑石鯛無水?；钪醒迥I上腺素和皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度的影響Table 2 Effects of chilling rate on serum epinephrine and cortisol contents in survived O. punctatus under treatments

如表2 所示，冷馴化結(jié)束后，各處理組對比斑石鯛降溫前皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度[（58.09 ± 4.07）ng·mL?1]均升高。1、3 ℃·h?1降溫處理組皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度隨保活時間延長總體呈現(xiàn)上升趨勢，5 ℃·h?1降溫處理組呈現(xiàn)下降趨勢。無水?；? h，5 ℃·h?1降溫處理組斑石鯛皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度顯著高于1、3 ℃·h?1降溫組（P＜0.05）。?；? h 后，1、3 ℃·h?1降溫處理組皮質(zhì)醇分別上升27.17%、30.98%。無水?；? h，5 ℃·h?1處理組血清皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度顯著低于1 ℃·h?1處 理組（P＜0.05）。

2.3 不同降溫速率對斑石鯛無水?；钸^程中AST、ALT 和MDA 活力的影響

如表3 所示，無水?；? h，1、3、5 ℃·h?1降溫處理組斑石鯛AST、ALT 活力均明顯高于初始值[（113.06 ± 4.27） U·L?1、（17.45 ± 2.47） U·L?1]。同時，各試驗組血清AST、ALT 活力呈現(xiàn)上升趨勢。無水?；? h，3 ℃·h?1降溫處理組斑石鯛血清AST、ALT 活力整體低于1、5 ℃·h?1降溫組。無水保活2～6 h，3 ℃·h?1降溫處理組斑石鯛血清AST、ALT 活力顯著降低（P＜0.05）。

表3 不同降溫速率對斑石鯛無水?；钪醒骞炔蒉D(zhuǎn)氨酶、谷丙轉(zhuǎn)氨酶和丙二醛活力的影響Table 3 Effects of chilling rate on serum AST, ALT, and MDA activities in survived O. punctatus under treatments

如表3 所示，冷馴化結(jié)束后，試驗組MDA 含量較降溫前（1.45 ± 0.23） nmol·mL?1均增加，且隨著?；顣r間的延長，MDA 含量呈現(xiàn)穩(wěn)定上升趨勢，3 ℃·h?1降溫處理組MDA 增長速度整體平穩(wěn)于1、5 ℃·h?1降溫處理組。無水?；? h 及6 h，3 ℃·h?1降溫處理組 MDA 含量顯著低于1、5 ℃·h?1降溫組（P＜0.05）。

2.4 同降溫速率對不斑石鯛無水保活過程中血糖、肝糖原、肌糖原和乳酸的影響

如表4 所示，各組降溫結(jié)束后斑石鯛血糖含量明顯高于降溫前含量[（4.35 ± 1.24） mmol·L?1]，隨?；顣r間的延長，1、5 ℃·h?1處理組血糖呈先上升后下降的趨勢，3 ℃·h?1處理組呈上升趨勢。無水?；? h，5 ℃·h?1降溫處理組血糖含量顯著高于1、3 ℃·h?1降溫組（P＜0.05）。無水保活6 h，1、5 ℃·h?1降溫處理組對比無水?；? h，血糖含量分別下降7.5%、39.09%，3 ℃·h?1降溫處理組血糖含量繼續(xù)上升。

表4 不同降溫速率對斑石鯛無水?；钪醒?、肝糖原、肌糖原和乳酸含量的影響Table 4 Effects of chilling rate on GLU, hepatic glycogen, muscle glycogen, and LAC contents in survived O. punctatus under treatments

如表4 所示，無水保活0 h，各降溫試驗組斑石鯛肝糖原均明顯低于降溫前含量[（15.17 ± 2.56）mg·g?1]，隨著?；顣r間的延長，3 個試驗組呈現(xiàn)下降的趨勢，與血糖的趨勢相反。無水?；?～6 h，1、5 ℃·h?1降溫處理組肝糖原開始出現(xiàn)明顯上升趨勢，3 ℃·h?1降溫處理組肝糖原含量繼續(xù)下降。

如表4 所示，無水?；? h，各降溫處理組斑石鯛肌糖原含量均明顯低于降溫前含量[（1.38 ± 0.11）mg·g?1]。各降溫處理組肌糖原含量隨保活時間的延長呈下降趨勢，分別下降52.67%、44.92%、46.79%，1 ℃·h?1降溫處理組肌糖原下降幅度明顯高于3、5 ℃·h?1降溫組。無水保活6 h，3 ℃·h?1降溫組肌糖原顯著高于5 ℃·h?1降溫組。

如表4 所示，降溫結(jié)束后，各降溫試驗組斑石鯛血清乳酸含量明顯高于降溫前含量[（4.34 ± 0.46）mmol·L?1]。各降溫試驗組血清乳酸含量均隨?；顣r間的延長呈先下降后上升的趨勢。無水?；? h，各處理組乳酸含量較0 h 下降，無水?；?～6 h，乳酸含量快速上升。無水?；? h，3 ℃·h?1降溫處理組乳酸含量顯著低于1、5 ℃·h?1降溫處理組（P＜0 .05）。

3 討論

3.1 不同降溫速率對斑石鯛無水?；钸^程中應(yīng)激反應(yīng)的影響

當(dāng)魚類受到刺激、損傷或死亡信號等指令，頭和腎作為主要組織，由嗜鉻細(xì)胞釋放大量的兒茶酚胺類激素（Catecholamine），導(dǎo)致血液中腎上腺素（EPI）含量顯著升高，使心跳加速、呼吸加快、血壓升高，為魚體活動提供更多能量并將血壓及時輸送至重要器官[13]；而后腦垂體受下丘腦釋放的促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子（Corticotrophin releasing factor）刺激，分泌促腎上腺皮質(zhì)激素（Adrenocorticotropic hormone）傳遞給腎間組織，由腎間組織產(chǎn)生以皮質(zhì)醇（Cortisol）為主的皮質(zhì)類固醇，并釋放到血液中，血液中皮質(zhì)醇含量的升高，可以加強能量動員，提高血糖水平，短期內(nèi)增強機體非特異性免疫功能，相反，皮質(zhì)醇分泌過多，也會抑制機體免疫能力，導(dǎo)致機體受損[14]。因此腎上腺素和皮質(zhì)醇的檢測是機體發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)后的常規(guī)檢測，也是直接判斷是否發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)和機體應(yīng)激反應(yīng)程度的重要指標(biāo)[15?16]。

孟振等[17]研究急性熱應(yīng)激對大菱鲆（Scophthalmus maximus）血液生化指標(biāo)時，發(fā)現(xiàn)溫度變化會使大菱鲆腎上腺素濃度升高，這與本試驗結(jié)果一致，說明斑石鯛在冷馴化過程中，受長時間低溫脅迫，嗜鉻細(xì)胞釋放腎上腺素提供能量，抵御低溫，維持生命活動。無水?；钸^程中，3、5 ℃·h?1降溫處理組血清腎上腺素呈下降趨勢，因為斑石鯛在前期冷馴化過程中，一直處于高速率降溫條件下，釋放了大量腎上腺素提供能量。1 ℃·h?1降溫處理組呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，可能是因為冷馴化過程中較低的降溫速率使斑石鯛逐漸適應(yīng)了慢性應(yīng)激源，自身能量維持生命活動的前提下，釋放少量腎上腺素進(jìn)行能量輔助[18]，而無水?；钸^程中靜態(tài)的溫度環(huán)境被斑石鯛側(cè)線器官感知引起腦神經(jīng)興奮，刺激腎上腺素的分泌，使得含量上升；5 ℃·h?1降溫處理組冷馴化結(jié)束后，血清腎上腺素質(zhì)量濃度明顯高于1、3 ℃·h?1降溫組，是因為降溫速率高，降溫至生態(tài)冰溫點時間短，斑石鯛產(chǎn)生強烈應(yīng)激，大量釋放了頭和腎組織中嗜鉻細(xì)胞貯存的兒茶酚胺類激素，血液中腎上腺素濃度顯著升高。席峰[19]在研究環(huán)境脅迫對虹鱒（Oncorhynchus mykiss）的影響時發(fā)現(xiàn)應(yīng)激10 min 后，虹鱒血清腎上腺素升高了23 倍，這與本研究結(jié)果一致。無水?；钸^程中，3 ℃·h?1降溫處理組血清腎上腺素含量一直維持在穩(wěn)定水平，同時，比較無水?；?～6 h，各降溫處理組斑石鯛腎上腺素濃度分別下降了56.9%、11.24%、25.26%，說明斑石鯛分泌腎上腺素的能力開始下降，意味著保活6 h，魚體不同程度地受到了損傷，而3 ℃·h?1降溫組魚體損傷程度最低。

徐鋼春等[20]研究鹽度對長江刀鱭（Coilia nasus）運輸脅迫應(yīng)激指標(biāo)的影響時發(fā)現(xiàn)，刀鱭經(jīng)過運輸前處理后，血清皮質(zhì)醇含量顯著高于未處理組（P＜0.05），這與本研究結(jié)果一致，表明冷馴化使斑石鯛產(chǎn)生了應(yīng)激反應(yīng)，且馴化結(jié)束后神經(jīng)內(nèi)分泌反應(yīng)不能及時恢復(fù)到應(yīng)激前的狀態(tài)。1、3 ℃·h?1降溫處理組皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度總體呈現(xiàn)上升趨勢，表明斑石鯛通過動態(tài)冷馴化后，對溫度的變化產(chǎn)生適應(yīng)性，此時，斑石鯛進(jìn)行無水保活，等同于人為因素將動態(tài)環(huán)境轉(zhuǎn)為靜態(tài)，誘使腎間組織分泌皮質(zhì)醇，使其達(dá)到較高水平來應(yīng)對不利因素；5 ℃·h?1降溫處理組呈現(xiàn)下降趨勢，表明隨著?；顣r間的延長，處于高值的血清皮質(zhì)醇會抑制斑石鯛免疫能力，使得腎間組織分泌皮質(zhì)醇的能力下降，這與鮭鱒魚類的研究一致[21]。無水保活0 h，5 ℃·h?1降溫處理組斑石鯛皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度顯著高于1、3 ℃·h?1降溫組，這可能是因為短時間快速降溫對斑石鯛產(chǎn)生的應(yīng)激更為劇烈。隨著?；顣r間的延長，1、3 ℃·h?1降溫組皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度顯著上升（P＜0.05），這與劉驍?shù)萚22]研究團頭魴（Megalobrama amblycephala）無水保活結(jié)果一致。保活4 h 后，1、3 ℃·h?1降溫處理組皮質(zhì)醇分別上升27.17%、30.98%，Chen 等[23]發(fā)現(xiàn)將鯉魚置于4 ℃的水中6 h，皮質(zhì)醇含量快速上升，表明持續(xù)的低溫會使魚類皮質(zhì)醇含量上升。無水?；? h，5 ℃·h?1處理組血清皮質(zhì)醇質(zhì)量濃度顯著低于1 ℃·h?1處理組（P＜0.05）。以上研究表明，經(jīng)過5 ℃·h?1冷馴化后的斑石鯛，在無水?；钸^程中機體免疫能力受損，導(dǎo)致皮質(zhì)醇分泌能力下降，無法應(yīng)對不利因素維持正常生命活動[24]，合理解釋了無水?；顣r間的延長，降低了斑石鯛的存活率。3 ℃·h?1的降溫速率較1 、5 ℃·h?1更適用于斑石鯛降溫休眠。

3.2 不同降溫速率對斑石鯛無水保活過程中肝臟的影響

谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）是魚體細(xì)胞內(nèi)重要的功能酶，是魚類代謝過程中必不可少的催化劑，主要存在于肝細(xì)胞和心肌細(xì)胞中，當(dāng)肝細(xì)胞和心肌細(xì)胞受損時，細(xì)胞膜通透性增加，AST和ALT 會被釋放到血液中，因此血清中AST 和ALT被認(rèn)為是肝功能和心臟是否正常的最具特異性和廣泛使用的指標(biāo)[25]。當(dāng)魚類在無水?；钸^程中一直處于不利環(huán)境，自身會遭受傷害，該過程體內(nèi)活性氧會不斷積累進(jìn)而誘發(fā)膜脂過氧化，膜脂過氧化的產(chǎn)物有脂類過氧化物、丙二醛（MDA）、乙烷等，其中MDA 是膜脂過氧化最重要的產(chǎn)物之一，因此可以通過測定 MDA 的含量了解膜脂過氧化的程度，以間接測定肝臟細(xì)胞膜系統(tǒng)受損程度[26]。

吳勝澤等[27]研究對鯽魚（Carassius auratus）無水?；顥l件下生理生化指標(biāo)的變化時發(fā)現(xiàn)，鯽魚經(jīng)過梯度降溫后，血清AST、ALT 活性顯著高于對照組，表明降溫處理會損傷肝臟，這與本研究結(jié)果一致。無水?；? h，3 ℃·h?1降溫處理組斑石鯛血清AST、ALT 活力整體低于1、5 ℃·h?1降溫組，是因為3 ℃·h?1的降溫速率對斑石鯛進(jìn)行冷馴化，所需要的時間短、溫差小，能適當(dāng)減緩斑石鯛無水保活過程中的肝臟損傷，這與何蓉等[28]研究不同溫度無水活運中華鱉（Trionyx Sinensis）結(jié)論一致。?；钸^程中，3 個試驗組血清AST、ALT 活力均呈現(xiàn)上升趨勢，表明無水?；顣r間和降溫速率會對斑石鯛肝臟造成損傷，3 ℃·h?1降溫條件下的斑石鯛肝臟損傷程度最低。

冷馴化結(jié)束后，3 個試驗組MDA 濃度均增加，且隨著?；顣r間的延長，MDA 濃度呈現(xiàn)穩(wěn)定上升趨勢。無水?；? h，3 ℃·h?1降溫處理組MDA 濃度顯著低于1、5 ℃·h?1降溫組（P＜0.05），表明3 ℃·h?1降溫能夠有效降低斑石鯛體內(nèi)活性氧的積累，減輕氧化應(yīng)激。張玉晗等[4]研究低溫預(yù)處理對花鱸（Lateolabrax japonicus）無水活運時間的影響時發(fā)現(xiàn)，不同的降溫速率會對花鱸無水運輸產(chǎn)生劇烈脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，造成肝組織細(xì)胞大量損傷和凋亡，這與本研究結(jié)果一致。以上研究結(jié)果顯示，冷馴化速率和無水?；顣r間會對斑石鯛肝臟造成損傷，這可能是 斑石鯛無法進(jìn)行長時間無水?；畹闹匾颉?/p>

3.3 不同降溫速率對斑石鯛無水?；钸^程中能量代謝的影響

血糖作為血液中最重要的能源物質(zhì)，是魚類各種生命活動所需能量的直接來源[29]。血糖在常態(tài)下會在血液中保持一個正常范圍，但是發(fā)生應(yīng)激反應(yīng)時，肝糖原會分解為葡萄糖，使魚體血糖含量升高[30]。無水保活過程中，魚類為了保持正常狀態(tài)，以血糖代謝為主，將糖原物質(zhì)轉(zhuǎn)化為葡萄糖，使葡萄糖含量增加，以此抵御寒冷。隨著?；顣r間的延長，葡萄糖被進(jìn)一步分解提供能量，此時葡萄糖濃度下降，機體與肝臟組織抵抗寒冷的能力也下降[31]。肌糖原是機體新陳代謝得以維持的重要能量來源，主要存在于肌肉中，是反應(yīng)外界環(huán)境應(yīng)激程度的重要指標(biāo)，其變化規(guī)律能清晰反映機體對環(huán)境的適應(yīng)情況[32]。乳酸是反應(yīng)機體細(xì)胞是否缺氧的敏感標(biāo)志物，是肌糖原在缺氧狀態(tài)下，通過一系列酶促反應(yīng)產(chǎn)生的糖代謝產(chǎn)物，只能在肝臟和腎臟中清除，當(dāng)肝、腎受損時，會導(dǎo)致細(xì)胞膜通透性增高，血清乳酸含量升高。

各試驗組降溫結(jié)束后斑石鯛血糖含量顯著高于降溫前，表明冷馴化過程中，斑石鯛為了御寒，將糖原物質(zhì)分解為葡萄糖。隨著保活時間的延長，各試驗組呈先上升后下降的趨勢，說明葡萄糖被進(jìn)一步分解供能，這與范秀萍[33]研究低溫休眠對珍珠龍膽石斑魚（♀Epinephelusfuscoguttatus×♂Epinepheluslanceolatus）的脅迫響應(yīng)和機制時的結(jié)果一致。無水?；? h，5 ℃·h?1降溫試驗組血糖含量顯著高于1、3 ℃·h?1降溫組（P＜0.05），這可能是因為5 ℃·h?1降溫組降溫速率高，溫差大，需要足夠多的葡萄糖供能。無水保活6 h，1、5 ℃·h?1降溫處理組較保活4 h，血糖含量分別下降7.5%、39.09%，說明隨著保活時間的延長，斑石鯛為了維持正常生命活動，體內(nèi)葡萄糖被分解提供能量。紀(jì)利芹等[34]研究連續(xù)降溫對大菱鲆代謝機能時發(fā)現(xiàn)，溫度持續(xù)的降低，會加劇ATP 的消耗，活化葡萄糖酶，使葡萄糖含量下降，這與本試驗結(jié)果一致。3 ℃·h?1降溫處理組血糖含量繼續(xù)上升，說明斑石鯛以3 ℃·h?1的速率冷馴化，應(yīng)激程度較1、5 ℃·h?1降溫組弱，葡萄糖酶處于低值。

張麗[35]研究大黃魚（Larimichthys crocea）?；钸\輸技術(shù)時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過降溫后的大黃魚，肝糖原含量顯著低于未降溫組（P＜0.05），降溫引起大黃魚強烈應(yīng)激，誘使糖原磷酸化酶分解肝糖原，這與本研究結(jié)果一致。隨著保活時間的延長，3 個試驗組呈現(xiàn)下降的趨勢，與血糖的趨勢相反，說明持續(xù)的低溫脅迫威脅斑石鯛生命，肝糖原分解提供能量，增強機體抗低溫脅迫能力。無水保活4～6 h，1、5 ℃·h?1降溫處理組肝糖原開始出現(xiàn)明顯上升趨勢，說明此時血液中葡萄糖被分解完全，而葡萄糖的來源一般是肝糖原分解提供，因此肝臟增加了肝糖原的合成。3 ℃·h?1降溫處理組肝糖原含量繼續(xù)保持下降，表明3 ℃·h?1冷馴化的斑石鯛體內(nèi)肝糖原的儲存量能夠滿足無水保活過程中的消耗，無需肝臟額外合成，同時對環(huán)境改變的適應(yīng)能力也更強，更適合無水?；睢?/p>

無水?；? h，各降溫試驗組斑石鯛肌糖原含量均顯著低于降溫前，表明溫度下降使斑石鯛產(chǎn)生應(yīng)激，為了抵御寒冷壓力，利用糖原分解產(chǎn)生的能量供能。Nie 等[36]分析大菱鲆冷馴化過程生理學(xué)變化時發(fā)現(xiàn)，溫度迅速下降會使大菱鲆分解糖原和糖基化供能，這與本試驗結(jié)果一致。而后，隨保活時間的延長，各降溫試驗組肌糖原顯著降低，這可能是因為斑石鯛在無水保活過程中呼吸方式為鰓部直接與空氣接觸，而該方式效率上不明確[37]，從而導(dǎo)致缺氧，肌糖原分解為乳酸。?；罱Y(jié)束，各降溫處理組肝糖原含量分別下降52.67%、44.92%、46.79%，1 ℃·h?1降溫處理組肌糖原下降幅度顯著高于3、5 ℃·h?1降溫組，可能是1 ℃·h?1降溫組冷馴化時間長，對斑石鯛肝臟產(chǎn)生損傷，導(dǎo)致肌糖原的分解效率下降[38]。

降溫結(jié)束后，各降溫試驗組斑石鯛血清乳酸含量明顯高于降溫前，說明斑石鯛接近生態(tài)冰溫點時應(yīng)激劇烈，導(dǎo)致肌糖原分解，乳酸含量升高，這與王彩霞等[11]探索加州鱸（Micropterus salmoides）生態(tài)冰溫點時的結(jié)果一致。整個無水?；钸^程，各降溫試驗組血清乳酸含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。無水?；? h，各試驗組乳酸含量下降，可能是斑石鯛新陳代謝緩慢，呼吸頻率逐漸減弱，且處于相對富氧的狀態(tài)。無水?；?～6 h，乳酸含量顯著上升（P＜0.05），說明斑石鯛長時間處于無水環(huán)境中，肝臟和腎臟嚴(yán)重?fù)p傷，無氧代謝加劇，乳酸在體內(nèi)無法及時清除產(chǎn)生積累。Virani 等[39]研究缺氧對墨西哥灣刺魚（gulf killifish）個體乳酸變化時發(fā)現(xiàn)，隨著缺氧時間的延長，墨西哥灣刺魚體內(nèi)乳酸呈上升趨勢，這與本研究結(jié)果一致。無水?；? h，5 ℃·h?1降溫處理組乳酸含量顯著高于1、3 ℃·h?1降溫組，說明5 ℃·h?1降溫對斑石鯛機體損傷大，不適合作為斑 石鯛降溫休眠速率。

4 結(jié)論

本研究通過不同降溫速率開展斑石鯛的無水?；钤囼灡砻鳎呤牽梢酝ㄟ^冷馴化的方式進(jìn)行無水?；睿渲? ℃·h?1降溫處理對斑石鯛產(chǎn)生的應(yīng)激反應(yīng)弱、肝臟損傷小，可以實現(xiàn)無水?；? h。下一步可以借助現(xiàn)代分子生物學(xué)手段，研究魚類應(yīng)激誘導(dǎo)生命體征波動與無水保活時間的動態(tài)關(guān)聯(lián)機制，闡明降溫速率對斑石鯛無水保活過程中生理應(yīng)激的影響調(diào)控機制。