萬 超，張 月，胡 莉，伍炳華，袁 媛

（福建農(nóng)林大學園藝學院，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意義】茉莉Jasminum sambac (L).Ait 為木犀科（Oleaceae）素馨屬（Jasminum）常綠灌木，茉莉花香氣馥郁，廣泛應用于“茉莉花茶”窨制、香料香精、化妝品藥品、食品和園林應用等方面，是著名的芳香植物[1]。香氣是茉莉花價值的重要體現(xiàn)方式。研究表明茉莉于夜間開放，主要香氣成分包括芳樟醇、法尼烯、乙酸芐酯[2]等，芳樟醇和法尼烯分別占單萜和倍半萜成分的92%和96%。前人通過對茉莉花中一些香氣相關酶活性的測定表明，其香氣釋放是有一定節(jié)律的，且其釋放是受嚴格調(diào)控的[3]，但相應的調(diào)控因子及調(diào)控機理還少有探究?！厩叭搜芯窟M展】MYB 類轉錄因子調(diào)控植物香氣合成在多種植物中均有報道，如矮牽牛的ODO1（ODORANT1）、EOBI（EMISSION OF BENZENOIDS I）、 EOBII（EMISSION OF BENZENOIDS II）交錯調(diào)控苯丙烷類香氣物質(zhì)代謝[4?6]；草莓FaEOBII 調(diào)控花瓣中丁香酚生物合成[7]；番茄SlMYB75 通過激活脂氧合酶途徑和萜類代謝途徑中的結構基因啟動子，從而調(diào)控果實中的香氣物質(zhì)合成[8]。茉莉香氣合成途徑中的一些重要的結構基因或相關啟動子序列已經(jīng)得到克隆和分離[9?16]，啟動子區(qū)域存在激素響應、光響應、MYB結合位點等多種順式作用元件，表明有些結構基因的表達可能受MYB 轉錄因子調(diào)控。【本研究切入點】茉莉JsMYB305 與矮牽牛、擬南芥中調(diào)控香氣合成的轉錄因子ODO1 及AtMYB21 高度同源，表達量與花朵香氣釋放同步，且與4 個茉莉花萜類合成酶基因 JsTPS（Terpene synthase）表達特征一致，前期研究中發(fā)現(xiàn)JsMYB305 可顯著提高茉莉愈傷組織中4 個 JsTPS 基因的表達[17]，并激活其啟動子的活性，推測JsMYB305 可能通過調(diào)控JsTPS 的表達從而調(diào)控香氣合成。但JsMYB305 是如何調(diào)控JsTPS 基因表達的機制卻并不明確?！緮M解決的關鍵問題】為進一步研究JsMYB305 調(diào)控茉莉香氣合成的機理，本研究通過原核表達的方式，在體外獲得JsMYB305 重組蛋白，研究結果可為將來研究JsMYB305 與JsTPSs 基因啟動子的體外結合及篩選JsMYB305 互作蛋白提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料

以雙瓣茉莉（Jasminum sambac）三年生植物花瓣為材料。取當天21：00 開放的茉莉花朵，用剪刀剪 下后迅速用鋁薄紙包好投入液氮中備用。

1.2 原核表達載體的構建

以茉莉花瓣為材料，參照EasyPure?Plant RNA Kit（北京全式金生物技術有限公司）的方法提取花瓣RNA。按 照One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金生物技術有限公司）說明書進行第一鏈cDNA 的合成。以cDNA 為模板，設計 含 有Bam H I 和Sal I 酶 切 位 點 的 特 異 性 引 物JsMYB305-F 和JsMYB305-R（表1）擴 增JsMYB305的編碼序列。擴增體系為：上游引物1 μL，下游引物1 μL， FastPfu PCR Super Mix（北京全式金生物技術有限公司）12.5 μL , H2O 8.5 μL, cDNA 2 μL。PCR擴增程序：95 ℃ 5 min；以下程序35 個循環(huán) ：95 ℃30 s，63 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min；接著72 ℃ 10 min。

表 1 構建原核表達載體時擴增JsMYB305 編碼序列的引物序列Table 1 Primer sequences for amplifying JsMYB305 coding sequence in prokaryotic expression vector construction

使用Bam H I 和Sal I 同時酶切pGEX-4T-1 載體和JsMYB305 擴增產(chǎn)物，酶切體系為：Bam H I 0.5 μL，Sal I 0.5 μL，PCR 產(chǎn) 物200 ng/載 體1 μg，快 切 酶Buffer 2 μL，無菌水補足至10 μL ，37 ℃酶切2 h。分別回收目的基因片段和酶切后的原核表達載體，使用T4 連接酶16 ℃連接過夜。連接體系為：T4 連接酶1 μL，連接酶Buffer 1 μL，載體酶切回收產(chǎn)物1.5 μL，目的基因酶切回收產(chǎn)物3.5 μL，無菌水3 μL。將連接產(chǎn)物取10 μL 轉化大腸桿菌DH5α 感受態(tài)，涂布于含50 mg·L?1氨芐的LB 平板，37 ℃過夜培養(yǎng)后，挑取單克隆使用載體上的測序引物（F: 5′-GGGCTG GCAAGCCACGTTTGGT-3′，R: 5′-CCGGGAGCT GCATGTGTCAGAGG-3′）進行PCR 鑒定，將陽性菌 液送福州鉑尚生物技術有限公司測序。

1.3 重組蛋白的誘導表達

將測序正確的重組質(zhì)粒通過熱激法轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)，涂布于含50 mg·L?1的氨芐LB 平板，37 ℃過夜培養(yǎng)。從平板上挑取一個單克隆至5 mL 含氨芐的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r·min?1，過夜培養(yǎng)。

取1 mL 過夜培養(yǎng)的大腸桿菌菌液，加入到10 mL含氨芐的LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃、200 r·min?1培養(yǎng)至OD600 nm約0.5 時，加入0.2 mmol·L?1異丙基-?-D-硫代半乳糖苷（IPTG），不加IPTG 的菌液為對照，在37 ℃進 行誘導培養(yǎng)4 h。

1.4 SDS-PAGE 檢測

將誘導表達后的菌液10 000 r·min?1離心1 min 收集菌體，用200 μL PBS（NaCl 8 g·L?1，KCl 0.2 g·L?1，KH2PO40.24 g·L?1, Na2HPO41.44 g·L?1）緩沖液重懸菌體。取50 μL 懸菌液加入10 μL 6×Protein loading buffer（北京全式金生物技術有限公司）混勻，沸水浴10 min，12000 r·min?1離心5 min。取10 μL 上清點樣至10% SDS-PAGE 膠，參照SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒（北京索萊寶科技有限公司）制備，InstaBlue protein stain solution（APE BIO，美國）染色，凝膠成像 分析儀（BIO RAD，美國）觀察結果。

1.5 重組蛋白的可溶性檢測

確定JsMYB305 可成功誘導表達后，摸索誘導表達可溶性蛋白的條件。設置37 、28 ℃兩個誘導溫度，誘導時間為4 h。誘導表達結束后用2 mL PBS緩沖液重懸菌體，取50 μL 懸菌液加入10 μL 6×Protein loading buffer，剩余菌液使用冰浴超聲破碎2 min，12 000 r·min?1離心5 min，收集上清，沉淀用1.95 mL PBS 重懸，分別取50 μL 上清和沉淀加入10μL 6×Protein loading buffer。將以上樣品沸水浴10 min，12 000r·min?１離心5 min，取10 μL 上清點樣至10%SDS-PAGE膠，染色，觀察結果。

1.6 JsMYB305 重組蛋白的大量誘導及純化

取5 mL 過夜培養(yǎng)的菌液加入到500 mL 含有氨芐的LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床震蕩培養(yǎng)至OD600 nm值約為0.5 后，加入IPTG 至終濃度為0.2 mmol·L?1，28 ℃誘導4 h 后收集全部菌體。使用15 mL Binding buffer（1×PBS，1% Triton x-100）重懸菌體，加入100 mmol·L?1PMSF（Phenylmethanesulfonyl fluoride，苯甲基磺酰氟）至終濃度為1 mmol·L?1，冰浴超聲破碎10 min，功率50%，工作10 s，休息10 s。超聲結束后在4 ℃，12 000 r·min?1離心20 min。

JsMYB305 重 組 蛋 白 純 化：取5 mL proteinIso GST Resin（北京全式金生物技術有限公司）加入到層析柱，靜置；用5 mL Binding buffer（1×PBS，1% Triton x-100）平衡層析柱；加入離心后的上清，收集流出液；用5 mL Binding buffer（1×PBS，1% Triton x-100）洗滌層析柱，收集流出液；用Elute buffer（50 mmol·L?1Tris，5 mmol·L?1GSH）配 制 濃 度 分 別 為10、20、30 mmol·L?1的還原型谷胱甘肽（GSH）溶液用于洗脫目的蛋白。每個GSH 濃度洗脫體積為5 mL，收集洗脫液，用于SDS-PAGE 檢測。

1.7 Western Blot 檢測重組蛋白

將 純 化 后 的 重 組 蛋 白 取50 μL 加 入10 μL 6×Protein loading buffer，沸水浴10 min，12 000 r min?1

離心5 min，取10 μL 上清點樣至10%SDS-PAGE 膠，電泳結束將凝膠于Trans blot SD 半干轉膜儀（BIO RAD，美國）轉移至NC 膜（Ge.Healthcare）上，5%脫脂牛奶室溫封閉3 h，GST 單克隆抗體（北京全式金生物技術有限公司）4 ℃孵育過夜，PBST（1×PBS，1‰ tween 20）洗膜30 min，HRP 標記GST 抗體室溫孵育1 h，PBST（1×PBS，1‰ tween 20）洗膜30 min，于膜上滴加2 mL eECL 顯色液（北京康為世紀生物科技有限公司），凝膠成像分析儀（BIOR AD，美國）觀察結果。

2 結果與分析

2.1 pGEX-4T-1-JsMYB305 原核表達載體的構建

以茉莉花cDNA 為模板，JsMYB305-F 和 JsMYB305-R 為引物，擴增獲得約600 bp 的特異性條帶（圖1-A），經(jīng)測序顯示長度為588 bp，與JsMYB305 編碼序列相符。回收擴增產(chǎn)物進行雙酶切，酶切后進行回收，結果顯示回收成功（圖1-B）。連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌后，經(jīng)載體上的測序引物鑒定，PCR 擴增獲得約750 bp 的片段（圖1-C），測序結果顯示為746 bp，表 明pGEX-4T-1-JsMYB305 重組質(zhì)粒構建成功。

圖1 茉莉JsMYB305 基因編碼序列的擴增、酶切回收及菌液PCR 鑒定Fig. 1 Amplification of JsMYB305 coding sequence, recovery of PCR product after enzyme digestion, and PCR identification of bacteria注：M 為DL2000 Marker ；A 為茉莉JsMYB305 基因編碼序列的擴增，其中2 為JsMYB305 基因；B 為JsMYB305 基因擴增產(chǎn)物酶切回收后的產(chǎn)物，其中5 為目的基因，1、3、4 為其他基因條帶；C 為重組載體pGEX-4T-1-JsMYB305 的菌液PCR 鑒定，1～5 為陽性條帶。Note: M: DL 2000 marker; A: amplification of JsMYB305 encoding sequence, 2: JsMYB305; B: amplification product of JsMYB305 after enzyme digestion and recovery; 5: JsMYB305; 1, 3, and 4: bands of other genes; C: identification of recombinant vector pGEX-4T-1-JsMYB305; 1-5: positive bands.

2.2 重組蛋白的誘導表達及可溶性檢測

將轉化了pGEX-4T-1-JsMYB305 的大腸桿菌于 37 ℃誘導4 h。結果顯示，與對照相比，誘導后的菌液在55 kDa 附近出現(xiàn)一條差異條帶，大小約為49 kDa（圖2-A），與預期的重組蛋白大小相符，表明JsMYB 305 能在大腸桿菌中成功表達。

分別于37 ℃和28 ℃誘導pGEX-4T-1-JsMYB305的表達，將誘導表達后所得的菌液超聲破碎后分別取上清和沉淀部分進行SDS-PAGE 電泳檢測，發(fā)現(xiàn)37 ℃誘導的重組蛋白主要存在于沉淀中（圖2-B），28 ℃誘導下，重組蛋白在上清中的含量比37 ℃更高（圖2-C），因此28 ℃誘導重組蛋白適合后續(xù)大量誘導和純化。

圖2 JsMYB305 重組蛋白的誘導表達及可溶性檢測Fig. 2 Inducible expression and soluble detection of JsMYB305 recombinant protein注：M：Protein ladder。A：JsMYB305 重組蛋白的誘導表達，1：未誘導的菌體蛋白，2：0.2 mmol·L?1IPTG 誘導后的菌體蛋白。B：37 ℃誘導重組蛋白表達，1：未誘導的菌體蛋白；2、3、4 分別為37 ℃ 0.2 mmol·L?1IPTG 誘導的菌體蛋白、上清、沉淀。C：28 ℃誘導重組蛋白表達，5：未誘導的菌體蛋白，6、7、8 分別為28 ℃ 0.2 mmol·L?1IPTG 誘導的菌體蛋白、上清、沉淀。Note: M: protein ladder; A: induced expression of recombinant protein of JsMYB305; 1: uninduced bacterial protein; 2: bacterial protein induced by 0.2 mmol·L?1IPTG; B: recombinant protein expression induced at 37 ℃; 1: uninduced bacterial protein; 2, 3 and 4: bacterial protein, supernatant, and precipitate, respectively, induced by 0.2 mmol·L?1IPTG at 37 ℃; C: recombinant protein expression induced at 28 ℃; 5: uninduced bacterial protein; 6, 7,and 8: bacterial protein, supernatant, and precipitate, respectively, induced by 0.2 mmol·L?1IPTG at 28 ℃.

2.3 重組蛋白的純化及檢測

基于以上誘導溫度的選擇，在28 ℃對重組蛋白進行大量的誘導，取上清進行蛋白純化。上清中的蛋白經(jīng)過層析柱吸附后，依次使用10、20、30 mmol·L?1的GSH 進行洗脫。不同濃度GSH 洗脫后的洗脫液SDS-PAGE 電泳分析顯示，蛋白上清的流出液和洗滌液中不含目的蛋白（圖3-A），表明目的蛋白與GST樹脂的結合性較好。在20 mmol·L?1的GSH 洗脫下，重組蛋白能被成功洗脫，條帶較為單一，表明重組蛋白成功純化。

圖3 重組蛋白的純化及Western Blot 檢測Fig. 3 Purification and western blot identification of recombinant protein注：M：protein ladder 。A：重組蛋白的純化 ，1：未誘導的菌體蛋白；2：0.2 mmol·L?1IPTG 誘導后的菌體蛋白；3：超聲破碎后的菌體蛋白上清；4：流出液；5：洗滌液；6：10 mmol·L?1GSH 洗脫液；7：20 mmol·L?1GSH 洗脫液；8：30 mmol·L?1GSH 洗脫液；箭頭標注的是純化的重組蛋白。B：純化蛋白的Western Blot 檢測，箭頭標注的是JsMYB305 重組蛋白與GST 單克隆抗體雜交后的條帶。Note: M: 15-180 kDa protein ladder; A: purification of recombinant protein; 1: uninduced bacterial protein; 2: bacterial protein induced by 0.2 mmol·L?1IPTG; 3: supernatant of bacterial protein after ultrasonic crushing; 4: effluent; 5: washing liquid; 6: eluent of 10 mmol·L?1GSH; 7: eluent of 20 mmol·L?1GSH; 8: eluent of 30 mmol·L?1GSH; arrow points at purified recombinant protein; B: detection of purified protein by western blot; arrow points at band after hybridization of JsMYB305 recombinant protein with GST monoclonal antibody.

將純化后的JsMYB305 重組蛋白，采用GST 單克隆抗體進行Western blotting 檢測，結果表明，純化后的重組JsMYB305 蛋白，與GST 單克隆抗體有雜交條帶，且條帶大小與實際相符合（圖3-B）。結果 說明純化后的重組蛋白為JsMYB305 重組蛋白。

3 討論

外源基因能否在原核表達系統(tǒng)中成功表達受到多種因素影響，如目的基因本身特性、誘導溫度和時間等[18?19]。溫度會顯著影響原核蛋白的表達，在高溫誘導時，大腸桿菌的生長速度較快，蛋白表達的速度會隨之增快，導致表達的蛋白不能正確折疊，易形成包涵體[20?21]。本研究中，相比37 ℃誘導溫度，28 ℃能誘導JsMYB305 蛋白更多地在上清中存在，與前人的研究結論一致。表達載體和表達菌株的選擇同樣對蛋白的誘導表達起十分重要的作用，如AtSTK 基因利用大腸桿菌Rosetta 菌和pET-32a 載體可以更好地表達出目的蛋白[22]。孫偉等[23]利用大腸桿菌Transetta（DE3）菌株表達ZmAGO18b 時發(fā)現(xiàn)，pET-28a 能夠誘導出目的蛋白的表達，而pGEX-6p 基本沒有檢測到目的蛋白。本研究也發(fā)現(xiàn)類似的現(xiàn)象，將JsMYB305 編碼序列構建到pQE30 載體并在BL21 株系誘導表達時基因無法成功誘導表達，換用pGEX-4T-1 表達載體后能成功誘導JsMYB305重組蛋白的表達和純化。這可能是谷胱甘肽S-轉移酶（Glutathione S-transferase，GST）與目的蛋白融合后，能提高目的蛋白的可溶性[24]，從而成功表達目的蛋白。

在研究蛋白質(zhì)的相互作用及篩選已知蛋白的未知互作蛋白方面，GST 標簽有著廣泛的應用。為驗證兩個蛋白間是否具有相互作用，朱炳森[25]和王意程[26]將目的蛋白分別構建到帶HIS 和GST 標簽的原核表達載體，誘導表達并純化后，利用pull down 試驗驗證兩個蛋白間的相互作用。趙杰等[27]和竇萬福等[28]分別利用 GST-pull down 技術聯(lián)合LC-MS/MS，鑒定出128 個與毛白楊天冬氨酸蛋白酶PtoAED3 和53個與柑橘抗?jié)儾∞D錄因子CsBZIP40 特異結合的互作蛋白。本研究中也選擇了GST 標簽，為后續(xù)利用pull down 技術篩選JsMYB305 的互作蛋白提供基礎。

本研究首次將茉莉花中調(diào)控香氣的轉錄因子JsMYB305 在大腸桿菌中誘導表達，并能通過GST 柱層析純化獲得，可為后續(xù)利用凝膠阻滯（EMSA）試驗分析JsMYB305 對TPS 基因啟動子的作用，以及利用GST-pull down 聯(lián)合LC-MS/MS 及免疫共沉淀（coip）篩選JsMYB305 的互作蛋白奠定堅實基礎，為深入分析JsMYB305 蛋白功能，并基于此基因功能探索茉莉花香氣分子育種提供借鑒。