陳永萍，何水林，劉志欽，陳桂信 ，蔣際謀

（1. 福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/福建省龍眼枇杷育種工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350013；2. 福建農(nóng)林大學(xué)農(nóng)學(xué)院，福建 福州 350002；3. 福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002）

0 引言

【研究意義】油柰（Prunus salicina lindley）是薔薇科（Rosaceae）李屬（Prunus）核果類落葉果樹，是福建省特色水果和稀優(yōu)李資源，具有較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]，但逆境脅迫（如極端溫度[2]、干旱[3]等）均會(huì)影響油柰的生長發(fā)育，嚴(yán)重時(shí)甚至造成減產(chǎn)[4]。植物對(duì)各種逆境脅迫的響應(yīng)需通過一系列信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的感知、傳導(dǎo)和傳遞[5]，故研究植物在逆境脅迫下的信號(hào)感知傳遞過程及其分子機(jī)制，對(duì)研究植物抗逆機(jī)理，提高植物抗性具有重要意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】在植物應(yīng)答各種非生物脅迫的過程中，作為植物體內(nèi)最大轉(zhuǎn)錄因子家族之一的WRKY轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)節(jié)植物應(yīng)答逆境脅迫的防御反應(yīng)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[5?8]。研究表明，在擬南芥中，ABA、干旱、鹽處理能誘導(dǎo)增強(qiáng)AtWRKY33 和AtWRKY25的表達(dá)，通過表達(dá)可增強(qiáng)擬南芥對(duì)鹽的耐受性[9]。分別在擬南芥中過表達(dá)TaWRKY33[10]和CkWRKY33[11]可提高轉(zhuǎn)基因株系在高溫脅迫和干旱脅迫下的存活率。在紫花苜蓿中過表達(dá)MsWRKY33 可以提高轉(zhuǎn)基因材料的耐鹽性[12]。在葡萄中VaERF092 通過結(jié)合VaWRKY33 啟動(dòng)子GCC-box 調(diào)控VaWRKY33，從而增強(qiáng)植物的耐寒性[13]。在油柰上，外源SA 處理下能顯著抑制PsWRKY22啟動(dòng)子在擬南芥中的表達(dá)，表明SA 能調(diào)控PsWRKY22的表達(dá)[14]。【本研究切入點(diǎn)】基于前人相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)有關(guān)油柰的抗性基因研究相對(duì)較少，本研究前期通過對(duì)油柰cDNA 文庫的篩選，獲得一個(gè)能響應(yīng)SA 的WRKY 基因并命名為PsWRKY33，經(jīng)克隆PsWRKY33啟動(dòng)子全長以及缺失序列構(gòu)建含有GUS報(bào)告基因的載體，通過轉(zhuǎn)基因到擬南芥來分析PsWRKY33 啟動(dòng)子不同片段在不同處理下的表達(dá)模式。【擬解決的關(guān)鍵問題】利用模擬各種非生物脅迫，探測(cè)轉(zhuǎn)基因PsWRKY33 啟動(dòng)子不同片段在不同脅迫處理下的應(yīng)答模式，以期為進(jìn)一步研究油柰WRKY基因生物學(xué)功能 及其調(diào)控機(jī)制提供科學(xué)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 植物材料和生長條件

以福建古田地區(qū)標(biāo)準(zhǔn)室外嫁接育苗的一年生翠屏晚柰品種作為研究對(duì)象。取葉片樣品，迅速冷凍于液氮中用于提取油柰基因組DNA。

將野生型（Columbia）擬南芥以及轉(zhuǎn)基因的種子播種于裝有經(jīng)高壓滅菌后的基質(zhì)中[V（泥炭苔）：V（蛭石）=2∶1]。置于（25±1） ℃、光照強(qiáng)度為100 μmol·ms?1（12 h 光 / 12 h 暗循環(huán)）、相對(duì)濕度為60%的條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)基因擬南芥種子在4 ℃暗處理3 d 后用滅菌水洗1 次，后用75 %酒精洗3～5 min，最后用無菌水洗5 次。轉(zhuǎn)基因T0 和T1 代種子播種在含50 mg·L?1潮霉素的?MS 固體培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選。將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)箱中，在（23±1） ℃、相對(duì)濕度8 0%的條件（12 h 光/12 h 暗循環(huán)）下培養(yǎng)。

1.2 生物信息學(xué)分析

在NCBI 數(shù)據(jù)庫blastp 比對(duì)獲得與PsWRKY 氨基酸序列同源性較高的5 種植物的蛋白序列，利用MEGA 6.06 軟件將以上6 種植物氨基酸序列進(jìn)行同源比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

利用PlantCARE 數(shù)據(jù)庫（http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析預(yù)測(cè)PsWRKY33 5 ′端上游啟動(dòng)子區(qū)域存在的順式作用調(diào)控元件。

1.3 載體構(gòu)建、植物轉(zhuǎn)化、脅迫處理

利用染色體步移法從油柰基因組DNA 中克隆出PsWRKY33 啟動(dòng)子片段，在此基礎(chǔ)上利用PCR 技術(shù)擴(kuò)增出3 個(gè)不同缺失片段（表1），載體構(gòu)建過程、轉(zhuǎn) 基因過程、脅迫處理等過程參照陳永萍等[14]的方法。

表 1 引物序列Table 1 Sequences of primers

1.4 組織化學(xué)染色和熒光法檢測(cè)GUS 活性

采集不同脅迫處理下的7 日齡T3 轉(zhuǎn)基因株系的葉片，以及T3 代轉(zhuǎn)基因株系的葉片、花序和角果進(jìn)行GUS 染色并拍照，具體操作方法過程參照陳永萍等[14]的方法。

參照陳永萍等[14]的方法，采用熒光法定量測(cè)定脅迫處理下的轉(zhuǎn)基因植株GUS 相對(duì)活性。數(shù)據(jù)整理后用SigmaPlot 12.5 軟件作圖。所有試驗(yàn)重復(fù)3 次。采 用t 檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 PsWRKY33 系統(tǒng)發(fā)育分析

為確定PsWRKY 基因與其他物種之間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，將獲得的PsWRKY 氨基酸序列與梅花PmWRKY33（accession no. XP_008231402.2）、歐 洲甜櫻桃PaWRKY24L（accession no. XP_021810565.1）、東京櫻花PyWRKY33（accession no. PQM41056.1）、巴旦木PpWRKY24（accession no. XP_007208290.1）和擬南芥AtWRKY33蛋白序列（accession no. NP_181381.2）進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。結(jié)果表明，PsWRKY 與擬南芥AtWRKY33 具有較高的序列相似性。因此，我們將該基因命名為PsWRKY33（圖1）。

圖1 系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 1 Phylogenetic tree

2.2 PsWRKY33 啟動(dòng)子序列的克隆及順式元件分析

利用染色體步移法獲得PsWRKY33 的ATG 起始密碼子上游1 872 bp 的片段，并利用PlantCARE 網(wǎng)站對(duì)其啟動(dòng)子序列進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)（圖2），PsWRKY33 啟動(dòng)子含有大量參與激素誘導(dǎo)響應(yīng)、逆境脅迫響應(yīng)等順式作用元件，如分別響應(yīng)低溫、生長素、SA、ABA、乙烯等的LTR、AuxRR-core、TCA、ABRE、ERE 等順式元件。在此基礎(chǔ)上，通過對(duì)不同的響應(yīng)元件進(jìn)行切除獲得不同缺失片段，并分別構(gòu)建到pMDC163 表達(dá)載體上（圖3）。經(jīng)浸花法分別轉(zhuǎn)化大野生型擬南芥中，經(jīng)潮霉素篩選與PCR 檢測(cè)轉(zhuǎn)基因陽性植株（圖4），最終獲得含有pPsWRKY33、P1、P2、P3 的轉(zhuǎn)基因株系，分別命名為pPsWRKY33::GUS、 pPsWRKY33-P1::GUS、 pPsWRKY33-P2::GUS和 pPsWRKY33-P3::GUS。

圖2 PsWRKY33 基因啟動(dòng)子序列Fig. 2 Cis-elements of PsWRKY33 promoter注：-60 表示ATG 上游60 個(gè)核苷酸。紅色粗體字母加框表示預(yù)測(cè)的順式作用元件序列。pPsWRKY33、P1、P2、P3 加箭頭加黑色下劃線表示為4 個(gè)片段（?1 872、?852、?357 和?271 bp）的特異性引物，箭頭表示它們的方向。Note: -60 represented the 60 nucleotides upstream of the ATG. Bold red letters with boxes indicated the predicted sequence of cis-acting elements. pPsWRKY33, P1, P2 and P3 add arrows and black underlines represented the specific primers of four fragments (?1 872, ?852, ?357 and ?271 bp), the arrows indicated their direction.

圖3 PsWRKY33 啟動(dòng)子各片段的GUS 載體Fig. 3 Schematic diagram of GUS vector of individual PsWRKY33 promoter fragments注：不同啟動(dòng)子區(qū)域的數(shù)目表示PsWRKY33 翻譯起始ATG 密碼子上游的核苷酸位置。 attR1 和attR2 限制性位點(diǎn)： 將pDMC163 載體中的CaMV35S 啟動(dòng)子替換為PsWRKY33 啟動(dòng)子片段。LB 和RB：代表T-DNA 的左右邊緣；Hyg：潮霉素標(biāo)記基因； GUSA： GUS 基因編碼區(qū)域。 黃色的條形圖代表PsWRKY33::GUS、 PsWRKY33-P1::GUS、 PsWRKY33-P2::GUS 和PsWRKY33-P3::GUS 結(jié)構(gòu)的-1 872 bp、-852 bp、-357 bp 和-271 bpPsWRKY33 啟動(dòng)子片段。Note: The number of different promoter regions represents the nucleotide position upstream of the PsWRKY33 translation initiation ATG codon.The CaMV35S promoter in pDMC163 vector was replaced by PsWRKY33 promoter fragment by attR1 and attR2 restriction sites. LB and RB represent the left and right edges of T-DNA; Hyg, hygromycin B marker gene; GUS is the region that codes for the GUS gene. The yellow bars represent the -1 872 bp, -852 bp, -357 bp and -271 bp PsWRKY33 promoter fragments of PsWRKY33::GUS, PsWRKY33-P1::GUS,PsWRKY33-P2::GUS and PsWRKY33-P3::GUS, respectively.

2.3 PsWRKY33 啟動(dòng)子在不同組織的活性分析

利用GUS 組織化學(xué)方法分析4 個(gè)啟動(dòng)子片段在轉(zhuǎn)基因擬南芥T3 幼苗中的表達(dá)特征。結(jié)果表明，在轉(zhuǎn)基因擬南芥T3 代苗的葉片、花序和角果中，PsWRKY33 啟動(dòng)子的4 個(gè)缺失片段存在不同的表達(dá)模式。pPsWRKY33::GUS在葉片、花序和花序梗中均檢測(cè)到較強(qiáng)的GUS 活性，且隨著啟動(dòng)子片段縮短，葉片和花序梗中的GUS 活性越弱。4 個(gè)缺失片段在角果上均未發(fā)現(xiàn)明顯的GUS 活性，其中在pPsWRKY33::GUS、pPsWRKY33-P1::GUS 和pPsWRKY33-P2::GUS 的角果莢 底部觀察到輕微的GUS 活性（圖5）。

2.4 4個(gè)PsWRKY33啟動(dòng)子片段對(duì)不同脅迫的響應(yīng)特征

為確定PsWRKY33 啟動(dòng)子是否能響應(yīng)不同的逆境脅迫，故對(duì)7 日齡T3 轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進(jìn)行ABA、SA、MeJA、ACC（ETH)、NaCl、MAN 和低溫（4 ℃）處理12 h，檢測(cè)其GUS 染色（圖6）以及相關(guān)GUS酶活（圖7）。經(jīng)GUS 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)PsWRKY33 啟動(dòng)子4 個(gè)缺失片段在不同脅迫處理下的GUS 活性強(qiáng)弱不同。不同PsWRKY33 啟動(dòng)子片段在4 ℃低溫處理下，各片段GUS 活性均強(qiáng)于對(duì)照組，而在SA 處理下4 個(gè)缺失片段的GUS 活性最弱，其中在全長、P1 和P2 缺失片段的植株發(fā)育真葉中檢測(cè)到微弱的GUS 活性，而在P3 缺失片段的轉(zhuǎn)基因植株中未能明顯觀察到GUS 活性。同時(shí)發(fā)現(xiàn)4 個(gè)PsWRKY33 啟動(dòng)子片段轉(zhuǎn)基因植株在對(duì)照組及NaCl 和ABA 處理下隨著片段缺失長度的增加，其GUS 活性逐漸減弱；而在MAN 和ETH 處理下，隨著越長的片段缺失，其GUS 活性反而明顯增強(qiáng)。而在MeJA 處理下，全長和P3 缺失片段植株的GUS 活性強(qiáng)于P1 和P2 缺失片段植物的GUS 活性（圖6）。

圖6 不同脅迫處理下轉(zhuǎn)基因擬南芥GUS 組織染色Fig. 6 GUS staining of transgenic Arabidopsis under different stresses

為進(jìn)一步定量分析各片段GUS 活性在各脅迫下的變化趨勢(shì)，同時(shí)對(duì)各脅迫下的4 個(gè)PsWRKY33 啟動(dòng)子缺失片段轉(zhuǎn)基因擬南芥幼苗進(jìn)行GUS 相對(duì)酶活測(cè)定分析。結(jié)果圖7 可見，不同長度的GUS 活性在不同處理下呈現(xiàn)出不同的變化趨勢(shì)。在對(duì)照組、4 ℃低溫、鹽、ABA、SA 處理下，各片段GUS 活性表現(xiàn)出片段越短，其GUS 活性越低的變化模式，并且發(fā)現(xiàn)在除了乙烯處理外的各個(gè)處理下，全長GUS 活性均不同程度上高于3 個(gè)缺失片段。在乙烯和MeJA處理下，全長和P3 的GUS 活性高于P1 和P2 的GUS活性。相比于對(duì)照組，4 ℃低溫處理下各片段GUS活性表現(xiàn)出不同程度上地提高，而ABA 和SA 處理下，4 個(gè)片段GUS 活性顯著降低?？傮w上GUS 活性變化趨勢(shì)與GUS 染色結(jié)果相似。

圖7 轉(zhuǎn)基因擬南芥在不同脅迫處理下的GUS 相對(duì)活性Fig. 7 GUS relative activity in transgenic Arabidopsis under different stresses注： 圖中不同大、 小寫字母表示同一處理達(dá)極顯著（P＜0.01）、顯著（P＜0.05）差異。Note: Different uppercase and lowercase letters indicate highly significant (P＜0.01) and significant (P＜0.05) differences in the same treatment .

綜上所述，在對(duì)照組及4 ℃、鹽、ABA 和SA 的脅迫下，隨著缺失的片段越長，其GUS 活性下降越明顯。這表明，PsWRKY33 啟動(dòng)子的3 個(gè)缺失片段失去 對(duì)4 ℃、ABA、SA 和NaCl 脅迫響應(yīng)的特性。

3 討論與結(jié)論

WRKY 轉(zhuǎn)錄因子是植物體內(nèi)最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，廣泛參與植物生長發(fā)育過程，以及對(duì)各逆境脅迫（生物、非生物及激素脅迫）的響應(yīng)[15]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過激活相關(guān)信號(hào)通路[16]，與各種脅迫應(yīng)答基因啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件相互作用，正向或負(fù)向調(diào)節(jié)激素相關(guān)基因或各種脅迫防御應(yīng)答基因的表達(dá)，參與防御反應(yīng)，促使植物在分子、生理生化等水平做出調(diào)節(jié)以適應(yīng)各種環(huán)境脅迫[17]。啟動(dòng)子是基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)前的一段重要序列，對(duì)基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控起著重要影響[18]。油柰上發(fā)現(xiàn)PsWRKY22 基因能被外源激素SA 處理誘導(dǎo)差異表達(dá)[19]，在擬南芥中過表達(dá)PsWRKY22 基因啟動(dòng)子[14]發(fā)現(xiàn)該基因啟動(dòng)子在SA 處理下表達(dá)被顯著抑制，為研究同樣能被外源激素SA 處理誘導(dǎo)差異表達(dá)的PsWRKY33 基因[19]轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制，本研究借鑒PsWRKY22 基因啟動(dòng)子[14]應(yīng)答不同脅迫處理的研究方法，以期探討PsWRKY33啟動(dòng)子的功能和表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制。

啟動(dòng)子序列上包含核心元件及一些響應(yīng)逆境脅迫的順式元件，研究順式作用元件對(duì)啟動(dòng)子以及基因功能的作用，對(duì)分析目的基因的功能具有重要意義[18]。PsWRKY22 基因啟動(dòng)子上含有響應(yīng)多個(gè)響應(yīng)激素、逆境相關(guān)的順式元件[14]，尤其含有SA 響應(yīng)元件TCA-element，經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)PsWRKY22 基因啟動(dòng)子在SA 處理下活性被抑制表達(dá)與該元件有關(guān)。本研究經(jīng)網(wǎng)頁預(yù)測(cè)也發(fā)現(xiàn)PsWRKY33 基因啟動(dòng)子區(qū)域含有多種響應(yīng)激素、逆境相關(guān)的順式作用元件，如ABA響應(yīng)元件ABRE、生長素響應(yīng)元件AuxRR-core、ETH響應(yīng)元件ERE、GA 響應(yīng)元件P-box 和TATC-box、SA 響應(yīng)元件TCA、低溫響應(yīng)元件LTR、響應(yīng)干旱和ABA 元件MYB、響應(yīng)干旱、ABA 和低溫脅迫元件MYC、響應(yīng)機(jī)械損傷元件WUN-motif，推測(cè)該基因的表達(dá)可能會(huì)受ABA、ETH、低溫等的誘導(dǎo)或抑制。

高永峰等[20]分析顯示SlWRKY31 基因啟動(dòng)子上含有分別響應(yīng)熱脅迫、干旱、ABA 和SA 的HSE、MBS、ABRE 和TCA-element 元件，通過不同脅迫處理后發(fā)現(xiàn)該啟動(dòng)子顯著受到鹽、甘露醇、SA、ABA和42 ℃高溫的誘導(dǎo)表達(dá)，說明SlWRKY31 基因啟動(dòng)子是一個(gè)可以響應(yīng)多種逆境脅迫的誘導(dǎo)型啟動(dòng)子[14]。劉志欽等[21]通過構(gòu)建CaWRKYK5 啟動(dòng)子5′端不同缺失片段的載體，經(jīng)青枯病菌、激素等處理分析后得出CaWRKYK5 啟動(dòng)子應(yīng)答青枯菌、MeJA 等的順式元件區(qū)域。本研究經(jīng)多種脅迫處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在SA 處理下，PsWRKY33 啟動(dòng)子GUS 染色和活性均顯著低于對(duì)照組，說明PsWRKY33 可能參與油柰對(duì)過量SA 脅迫的響應(yīng)，進(jìn)而通過調(diào)節(jié)SA 去響應(yīng)逆境脅迫。而在極端溫度（4 ℃低溫）脅迫下，GUS 染色和活性均高于對(duì)照，說明該基因可能是受低溫誘導(dǎo)的。雖然在本研究沒有預(yù)測(cè)到應(yīng)答JA 的順式作用元件，但是在JA 的處理下，PsWRKY33 啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的GUS 報(bào)告基因可以被激活，說明可能存在其他的未知的調(diào)控機(jī)制。

PsWRKY33 基因啟動(dòng)子能被外源ABA、SA 抑制轉(zhuǎn)錄表達(dá)活性，而受到低溫誘導(dǎo)表達(dá)，可能與其含有的ABRE、LTR 和TCA 元件有關(guān)。在ETH 處理后，pPsWRKY33 和pPsWRKY33-P1 的GUS 活性受到抑制，而pPsWRKY33-P2/P3 的GUS 活性被誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，推測(cè)?1 871 ～ ?852 bp 區(qū)域可能含有對(duì)ETH 應(yīng)答起著負(fù)調(diào)控的順式元件，而?357 bp ～ ?1 (ATG)區(qū)域里可能存在應(yīng)答ETH 的核心元件。

本研究檢測(cè)不同脅迫處理下PsWRKY33 基因啟動(dòng)子及其缺失片段的GUS 活性，但還未確定具體發(fā)揮作用的順式作用元件，以及對(duì)下游基因表達(dá)起促進(jìn)或抑制作用的是由于單個(gè)順式作用元件調(diào)控引起的，還是由多個(gè)順式元件協(xié)同作用引起的結(jié)果[22]，已有文獻(xiàn)表明，通過對(duì)啟動(dòng)子上的元件進(jìn)行缺失處理分析的方法，是作為鑒定啟動(dòng)子順式作用元件功能的重要手段之一[23]。Rushton 等[24]通過對(duì)PR1 基因啟動(dòng)子進(jìn)行缺失及功能分析后發(fā)現(xiàn)，對(duì)啟動(dòng)子Wbox 元件核心序列進(jìn)行突變后啟動(dòng)子會(huì)喪失響應(yīng)病原菌誘導(dǎo)的能力，故日后可通過對(duì)PsWRKY33 基因啟動(dòng)子上的順式元件堿基進(jìn)行點(diǎn)突變或其他方法來確定其啟動(dòng)子應(yīng)答各逆境脅迫的核心元件位置，為后續(xù)對(duì)PsWRKY33 基因及其啟動(dòng)子的功能和表達(dá)調(diào)控的分子機(jī)制研究奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。