胡雅楠，李 苗，李寶新,2，方新梅,2，常文龍,2，趙聰聰,2，王 翯,2，張?jiān)屏?2

1 保定市第一中心醫(yī)院 內(nèi)分泌科，河北保定 071000；2 河北省光學(xué)感知技術(shù)創(chuàng)新中心，河北保定 071000

糖尿病前期是介于正常糖耐量和2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus，T2DM)之間的一種中間狀態(tài)[1]，此類(lèi)人群患T2DM的風(fēng)險(xiǎn)明顯增加，是預(yù)防T2DM的間歇性治療的重要目標(biāo)群體。脂肪組織激素分泌異常、炎癥通路激活和氧化應(yīng)激增高是導(dǎo)致胰島素抵抗(insulin resistance，IR)的重要病理生理機(jī)制。研究表明慢性炎癥和氧化應(yīng)激在糖尿病前期時(shí)期就已經(jīng)存在[2]。硫氧還蛋白(thioredoxin，TRX)是生物體內(nèi)重要的氧化還原酶，具有抗氧化、氧化還原調(diào)節(jié)和抗炎作用[3]。白脂素(asprosin，Asp)是一種新型分泌型脂肪細(xì)胞因子，能導(dǎo)致胰島β細(xì)胞炎癥，抑制胰島素分泌，升高血糖。研究表明，血清TRX及Asp蛋白參與血糖代謝過(guò)程[4-5]，具體機(jī)制尚不清楚，兩者在參與T2DM發(fā)生發(fā)展的過(guò)程中，其可能機(jī)制涉及氧化應(yīng)激的發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致慢性炎癥及IR。這些發(fā)現(xiàn)使TRX與Asp成為延緩T2DM發(fā)展的潛在治療靶點(diǎn)。然而，TRX和Asp在糖尿病前期患者中的變化尚無(wú)研究。本課題以糖尿病前期和糖尿病患者為研究對(duì)象，探討血清TRX和Asp的水平變化，分析兩者與血清相關(guān)參數(shù)的關(guān)系，以期發(fā)現(xiàn)糖尿病前期患者與正常人群的異同，進(jìn)而有效研究逆轉(zhuǎn)或延緩T2DM進(jìn)展的客觀性指標(biāo)，為延緩糖尿病前期向T2DM發(fā)展和臨床診治提供依據(jù)。

對(duì)象與方法

1 研究對(duì)象 選擇2018年12月- 2020年1月于保定市第一中心醫(yī)院內(nèi)分泌科門(mén)診就診的T2DM患者50例，糖尿病前期患者105例。根據(jù)2017年中國(guó)2型糖尿病防治指南糖代謝狀態(tài)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)[6]，行75 g口服葡萄糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test，OGTT)。根據(jù)血糖水平分為空腹血糖受損組[IFG組；51例；6.1 mmol/L ≤ 空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG) ＜ 7.0 mmol/L，葡萄糖耐量120 min血糖(postprandial blood glucose，PBG) ＜ 7.8 mmol/L]和糖耐量減低組(IGT組；54例；FBG ＜ 7.0 mmol/L，7.8 mmol/L ≤ PBG ＜11.1 mmol/L)。另取同期體檢糖耐量正常者42例作為對(duì)照組(NGT組；3.9 mmol/L ＜ FBG ＜6.1 mmol/L且PBG ＜ 7.8 mmol/L)。本研究獲得醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，受試者均簽署知情同意書(shū)。納入標(biāo)準(zhǔn)：1)根據(jù)糖尿病診斷和糖代謝狀態(tài)分類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)，行OGTT試驗(yàn)診斷為糖調(diào)節(jié)受損和T2DM；2)年齡18～70歲。排除標(biāo)準(zhǔn)：1)因既往存在的疾病而服用影響糖代謝的藥物；2)目前服用 ≥ 3種降壓藥；3)3個(gè)月內(nèi)發(fā)生急性心腦血管疾??；4)嚴(yán)重肝、腎功能不全；5)惡性腫瘤史。

2 OGTT試驗(yàn) 所有受試者隔夜空腹8～10 h，由專(zhuān)人采集空腹靜脈血2 mL，將75 g無(wú)水葡萄糖粉溶于250～300 mL溫水中，在3～5 min內(nèi)飲完，120 min后再次采集受試者靜脈血。葡萄糖氧化酶法測(cè)定FBG和PBG并記錄。

3 生化指標(biāo)檢測(cè) 空腹8～10 h后收集研究對(duì)象的外周靜脈血10 mL，以4 000 r/min離心5 min，采用日立7600生化儀器檢驗(yàn)血清FBG、PBG、總膽固醇(total cholesterol，TC)、三酰甘油(triglyceride，TG)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol，LDL-C)、血 肌 酐(serum creatinine，Scr)、血 尿 素 氮(blood urea nitrogen，BUN)、谷 丙 轉(zhuǎn) 氨 酶(alanine aminotransferase，ALT)、谷 草 轉(zhuǎn) 氨 酶(aspartate aminotransferase，AST)、血清白蛋白(albumin，ALB)，糖化血紅蛋白(glycosylated hemoglobin，HbA1c)由上海觀合中心實(shí)驗(yàn)室采用TOSSOH HLC-723 G8全自動(dòng)糖化血紅蛋白分析儀檢測(cè)；空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)采用電化學(xué)發(fā)光法(德國(guó)Cobas 6000-E601)測(cè)定，計(jì)算穩(wěn)態(tài)模型胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)，公式：HOMA-IR = FBG × FINS/22.5。

4 血清TRX及Asp測(cè)定 空腹血樣2 mL，2 h內(nèi)用離心機(jī)以4 000 r/min離心5 min，分離血清，-80℃保存待檢，測(cè)定時(shí)用ELISA進(jìn)行檢測(cè)，試劑盒購(gòu)自欣博盛生物科技有限公司，均嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行。根據(jù)試劑盒說(shuō)明書(shū)的說(shuō)明，TRX有效檢測(cè)范圍是0.0625～8 ng/mL，批內(nèi)、批間變異系數(shù)均 ＜ 10%；Asp有效檢測(cè)范圍是0.25～8 ng/mL，批內(nèi)變異系數(shù) ＜ 10%，批間變異系數(shù) ＜ 13%。

5 分析指標(biāo)將受試人群分為NGT、IFG、IGT和DM四組，分別統(tǒng)計(jì)血清各指標(biāo)、TRX和Asp濃度，P＜ 0.05為存在組間差異，表示該指標(biāo)隨糖代謝狀態(tài)的改變而改變；分別對(duì)TRX、Asp水平和各影響因素進(jìn)行Spearman相關(guān)分析，以r值為正、P＜ 0.01的指標(biāo)為T(mén)RX和Asp的正相關(guān)指標(biāo)，以r值為負(fù)、P＜ 0.01的指標(biāo)為T(mén)RX和Asp的負(fù)相關(guān)指標(biāo)；分別以血清TRX及Asp為因變量，血清相關(guān)指標(biāo)為自變量，行多元線(xiàn)性回歸分析，以P＜ 0.01的指標(biāo)為T(mén)RX或Asp的獨(dú)立影響指標(biāo)。

6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。正態(tài)分布計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用單因素方差分析+兩兩組間比較HSD-q檢驗(yàn)；非正態(tài)分布資料以Md(IQR)表示，采用Kruskal-Wallis秩和檢驗(yàn)+兩兩比較Wilcoxon秩和檢驗(yàn)；此外，應(yīng)用Spearman相關(guān)分析血清TRX和Asp與各指標(biāo)間的相關(guān)性，多元線(xiàn)性回歸分析血清TRX和Asp的關(guān)聯(lián)因素，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 各組一般資料比較 各組性別、年齡和舒張壓比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞ 0.05)。NGT組的體質(zhì)量指數(shù)明顯低于其他三組(P＜ 0.05)；收縮壓 (systolic blood pressure，SBP)在IGT 組和DM組明顯升高，相對(duì)于其他組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜ 0.05)。見(jiàn)表1。

表1 各組間一般資料比較Tab. 1 Comparison of baseline data between each group

2 血清相關(guān)指標(biāo)比 較 四組間TC、LDL-C、HDL-C、ALT、AST、Scr、BUN比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞ 0.05)。DM組的TG和FBG明顯高于其他組(P＜ 0.05)。IGT組和DM組的PBG高于其他兩組(P＜ 0.05)。四組的FBG、PBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR整體差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜ 0.05)，均以DM組為最高。見(jiàn)表2。

3 血清TRX和Asp濃度比較 NGT組、IFG組、IGT組、DM組血清TRX濃度依次降低，以DM組最低(P＜ 0.05)；血清Asp濃度依次升高，以DM組最高(P＜ 0.05)。見(jiàn)表2。

表2 各組間血清相關(guān)生化指標(biāo)的比較Tab. 2 Comparison of related biochemical indexes in each group

4 血清TRX和Asp水平與其他臨床指標(biāo)的相關(guān)性分析 Spearman相關(guān)分析顯示，血清TRX濃度與SBP、TC、TG、LDL-C、FBG、PBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、Asp呈線(xiàn)性負(fù)相關(guān)，與HDL-C呈正相關(guān)(P＜ 0.01)；血清Asp與SBP、TC、TG、FBG、PBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR呈線(xiàn)性正相關(guān)，與血清TRX呈線(xiàn)性負(fù)相關(guān)(P＜ 0.01)。見(jiàn)表3。

表3 血清TRX和Asp水平與各指標(biāo)間的Spearman相關(guān)分析Tab. 3 Spearman correlation analysis of TRX, Asp with general characteristics and laboratory indicators

5 多元逐步回歸分析血清TRX和Asp的影響因素 分別以血清TRX和Asp為因變量，以Spearman相關(guān)分析得出的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的指標(biāo)為自變量，行多元線(xiàn)性回歸分析，結(jié)果顯示FBG、FINS、HOMA-IR和Asp為血清TRX的影響因素(P＜ 0.01)；FBG、TC、FINS、HOMA-IR和TRX為血清Asp的影響因素(P＜ 0.01)。見(jiàn)表4。

表4 血清TRX和Asp水平影響因素的多元線(xiàn)性回歸分析Tab. 4 Multiple linear regression analysis of factors associated with serum TRX and Asp levels

討 論

T2DM的糖代謝缺陷在糖尿病確診前就存在，氧化應(yīng)激的發(fā)生和IR的發(fā)展，即胰島素對(duì)葡萄糖代謝作用的減弱，發(fā)生在血糖失調(diào)的早期[7]。細(xì)胞功能失調(diào)和IR是T2DM發(fā)病的兩個(gè)中心環(huán)節(jié)[8]。

TRX是一種廣泛存在于原核和真核生物細(xì)胞中的小分子蛋白，它參與了細(xì)胞的氧化增殖、凋亡、基因表達(dá)以及最終的氧化還原敏感性信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，它通過(guò)轉(zhuǎn)錄因子的氧化還原調(diào)節(jié)，平衡糖脂代謝，保護(hù)細(xì)胞免受凋亡，控制多種炎癥基因[9-10]。氧化應(yīng)激是由于活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生和細(xì)胞抗氧化能力不平衡造成的，可進(jìn)一步導(dǎo)致IR[11]。氧化應(yīng)激發(fā)生時(shí)，β細(xì)胞中的抗過(guò)氧化酶和氧化還原調(diào)節(jié)酶在高糖狀態(tài)可使葡萄糖過(guò)量氧化，產(chǎn)生過(guò)多的ROS，從而對(duì)β細(xì)胞造成一系列損傷[12]。研究表明，TRX能直接接觸并清除ROS，降低氧自由基對(duì)細(xì)胞的損害，減少蛋白質(zhì)和酶的變性失活、DNA的損害、脂質(zhì)的過(guò)氧化等不利情況[13]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已明確小鼠的高脂飲食和肥胖會(huì)使肝中ROS顯著增加，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生炎癥，尤其是在脂肪組織中[14]。Salmon等[15]通過(guò)高脂喂養(yǎng)TRX+的小鼠，發(fā)現(xiàn)TRX的過(guò)表達(dá)在不影響脂肪積累和分布的情況下，可防止葡萄糖耐受不良和促炎癥狀態(tài)的發(fā)生。有可能是TRX+小鼠的TRX表達(dá)水平高到足以抵消高血糖抑制其活性的作用，從而使高脂肪造成的氧化應(yīng)激最小化。因此，TRX作為重要的體內(nèi)抗氧化因子，可能對(duì)糖尿病的進(jìn)程起延緩作用，進(jìn)而成為一個(gè)有吸引力的治療靶點(diǎn)。本研究中，血清TRX水平在NGT組、IFG組、IGT組、DM組逐漸降低。參考Spearman相關(guān)分析，血清TRX濃度與SBP、TC、TG、LDL-C、FBG、PBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR、Asp呈負(fù)相關(guān)，與HDL-C呈正相關(guān)，提示TRX與血糖異常波動(dòng)及血脂代謝紊亂相關(guān)，進(jìn)一步行回歸分析顯示FBG、FINS、HOMA-IR、Asp為血清TRX的影響因素?？紤]TRX早在糖尿病前期時(shí)期可能就已參與血糖及胰島素的代謝，慢性炎癥和氧化應(yīng)激已啟動(dòng)，在糖尿病前期向T2DM的發(fā)展過(guò)程中有潛在意義。

Asp是一種由白色脂肪組織分泌的細(xì)胞因子，通過(guò)G蛋白-環(huán)磷酸腺苷-蛋白激酶A途徑促進(jìn)肝葡萄糖釋放，使血糖升高[16]。Wiecek等[17]研究發(fā)現(xiàn)，在高脂血癥狀態(tài)下，胰腺細(xì)胞是Asp的來(lái)源，Asp通過(guò)引起炎癥、細(xì)胞功能障礙和凋亡，導(dǎo)致胰島素分泌受損。此外，研究表明Asp在血液循環(huán)中穿過(guò)血腦屏障，通過(guò)營(yíng)養(yǎng)依賴(lài)的途徑直接激活產(chǎn)生食欲的AGRP+神經(jīng)元，這種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致下游產(chǎn)生厭食的神經(jīng)元受到抑制，從而導(dǎo)致食欲刺激、脂肪積累和體質(zhì)量增加[18]。肥胖的發(fā)展與葡萄糖穩(wěn)態(tài)和IR有密切聯(lián)系。Duerrschmid等[19]發(fā)現(xiàn)肥胖人群和小鼠血液循環(huán)中的Asp濃度出現(xiàn)病理性升高，研究者通過(guò)免疫和遺傳途徑使肥胖小鼠體內(nèi)Asp喪失功能，降低了肥胖小鼠的食欲和體質(zhì)量，進(jìn)而明顯降低血清葡萄糖和胰島素水平，改善IR。Li等[20]發(fā)現(xiàn)單次注射Asp會(huì)導(dǎo)致小鼠血糖和血清胰島素迅速升高，而 Asp 的減少會(huì)提高小鼠對(duì)胰島素的敏感度，降低小鼠的食欲和體質(zhì)量。本研究檢測(cè)了糖調(diào)節(jié)受損患者的血清Asp水平，結(jié)果顯示IGT組患者血清Asp水平明顯升高。Spearman相關(guān)分析和多元線(xiàn)性回歸分析結(jié)果顯示，血清Asp與SBP、TC、TG、FBG、PBG、HbA1c、FINS、HOMA-IR呈線(xiàn)性正相關(guān)，與血清TRX呈線(xiàn)性負(fù)相關(guān)，F(xiàn)BG、TC、FINS、HOMA-IR、TRX為血清Asp的獨(dú)立影響因素。提示其可能參與血糖及血脂代謝，即Asp可能通過(guò)促進(jìn)血糖升高和IR的發(fā)生，進(jìn)而參與T2DM的發(fā)展，間接提示該指標(biāo)可能對(duì)T2DM的早期篩查和診斷有一定幫助。

綜上所述，本研究證實(shí)了糖尿病前期患者血清TRX水平明顯降低，而Asp水平升高。這兩個(gè)因子是反映血糖穩(wěn)態(tài)和IR的相關(guān)指標(biāo)，且在糖尿病前期患者中已出現(xiàn)水平變化，推測(cè)二者可能是預(yù)測(cè)糖尿病前期的有效生物標(biāo)志物。繼續(xù)深入探討TRX和Asp參與糖尿病前期向T2DM發(fā)展過(guò)程的機(jī)制，可為糖尿病前期的預(yù)測(cè)和早期診治提供新方向。然而，本研究樣本量較少，且為橫斷面研究設(shè)計(jì)，存在一定的局限性，還需進(jìn)行大樣本的臨床研究和進(jìn)一步的前瞻性人群縱向跟蹤研究以明確二者對(duì)糖尿病前期和T2DM進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)效果。我們將繼續(xù)增加樣本量，積極開(kāi)展動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，進(jìn)行基礎(chǔ)研究，為糖尿病前期和T2DM的風(fēng)險(xiǎn)預(yù)測(cè)、早期篩查和治療提供新的思路。