張鈞棟，智 鵬，王紫寧，李泓毅，陳浩然，盧學(xué)春

1 解放軍醫(yī)學(xué)院，北京 100853；2 解放軍總醫(yī)院第二醫(yī)學(xué)中心 血液病科，國家老年疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心，北京 100853

陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥(paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH)是一種罕見的以血管內(nèi)溶血、血栓形成和骨髓衰竭為特征的造血干細胞疾病，其中血栓形成是PNH患者死亡的主要原因之一[1]。全球每百萬人中僅1～1.5例PNH，亞洲國家發(fā)生率遠高于西方國家[2]。PNH發(fā)生的原因是糖基磷脂酰肌醇(glycophosphatidylinositol，GPI)缺乏。PNH的溶血是由于GPI錨定的補體調(diào)節(jié)蛋白衰變加速因子(decay accelerating factor，CD55)和膜攻擊復(fù)合物抑制因子(membrane inhibitor of reactive lysis，CD59)嚴重缺乏引起，通過阻斷末端補體的人源化C5單克隆抗體即可阻止溶血的發(fā)生[3]。但由于人源化C5單克隆抗體依庫珠單抗(Eculizumab)價格昂貴，且必須終身應(yīng)用，所以只有嚴重貧血、血栓形成、頻繁疼痛發(fā)作、衰弱性疲勞、腎功能不全或呼吸困難等情況下才考慮Eculizumab治療。當(dāng)前，針對PNH治療手段單一，藥物費用昂貴，亟需尋找可顯著改善患者病情和生活質(zhì)量的新型治療藥物或方案。本研究團隊前期使用基于“邏輯組學(xué)”原理開發(fā)的表觀精準治療平臺(EpiMed)分析發(fā)現(xiàn)全反式維甲酸(all-trans retinoic acid，ATRA)具有治療PNH的潛在作用?，F(xiàn)對含ATRA聯(lián)合方案治療PNH的短期療效和安全性進行評估。

對象與方法

1 研究設(shè)計 本研究符合《赫爾辛基宣言》要求，經(jīng)解放軍總醫(yī)院倫理委員會審查批準(倫審第S2019-363-01)并登記注冊臨床試驗(ChiCTR20000 39675)，是一項單中心、開放、單臂的短期療效觀察研究。

2 研 究 對象 以解 放 軍總 醫(yī) 院第 一 醫(yī)學(xué) 中心2019年12月- 2021年8月收治的PNH患者為研究對象。納入標準：符合《陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿癥診斷與治療中國專家共識》中的診斷標準[4]；年齡為14周歲及以上，性別不限；既往接受過正規(guī)治療，包括腎上腺糖皮質(zhì)激素治療1年等治療無效或減量后復(fù)發(fā)的PNH患者。排除標準：患有其他類型的貧血，如鐵粒幼細胞性貧血、地中海貧血等；處于妊娠或哺乳期，或試驗期間/試驗前3個月/服藥后1年內(nèi)不能采取避孕措施者；不同意簽署知情同意書以及已知對可能使用的藥物過敏等。

3 治療方案 入組患者在原有糖皮質(zhì)激素和雄激素治療基礎(chǔ)上加用ATRA(山東良福集團制藥有限公司，國藥準字H10970054) 10 mg/d。連續(xù)治療12周。研究過程中根據(jù)實際情況與反應(yīng)評價標準評估是否劑量延遲或劑量調(diào)整，任何患者如減少劑量，將在其后的治療周期中繼續(xù)接受減量的劑量治療。如果患者自上一次給藥之日起第35天仍不能恢復(fù)治療，除非獲得研究者的特別許可，否則該患者必須終止研究治療。其他允許的治療包括支持治療(如疼痛的對癥支持治療)，缺乏維生素或鐵蛋白偏低者，按醫(yī)囑補充相應(yīng)造血原料。不允許的治療包括研究期間患者接受其他臨床試驗藥物，以及任何形式的研究者認為對本試驗有影響的治療。

4 療效及安全性評價 所有實驗對象分別在治療前1 d以及治療第4、8、12周清晨空腹狀態(tài)下使用EDTA抗凝真空采血管采外周血進行檢查。實驗對象在采血前1 d清淡飲食，避免飲酒及勞累，女性患者避開月經(jīng)期進行采血。療效評估主要觀察血紅蛋白濃度、溶血情況(以乳酸脫氫酶及膽紅素進行衡量)、血栓發(fā)生率、PNH Ⅲ型紅細胞比例、CD59/FLAER表達缺失粒細胞比例、網(wǎng)織紅細胞計數(shù)等。安全性評估通過記錄不良事件和常規(guī)實驗室檢查進行。

5 統(tǒng)計學(xué)分析 所有統(tǒng)計分析用GraphPad Prism 8軟件進行。正態(tài)分布的計量資料以±s表示，非正態(tài)分布的計量資料以Md(IQR)表示。分類變量用例數(shù)(百分比)表示。組間連續(xù)變量采用獨立t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 納入患者一般情況 納入符合研究標準且完成12周治療的患者共計6例，男性3例，女性3例，年齡31～55歲。入組患者Ⅲ型紅細胞比例中位數(shù)為50.31%(9.733%，55.38%)；CD59/FLAER表達缺失粒細胞比例為43.23% ± 29.75%。4例患者合并再生障礙性貧血(aplastic anaemia，AA)，2例既往存在明確血栓形成病史，4例既往存在輸血依賴(表1)。

表1 6例PNH患者一般情況Tab. 1 Clinical characteristics of the 6 patients with PNH

2 療效評價 在連續(xù)治療12周期間，4例既往存在輸血依賴的患者均擺脫輸血，治療前患者血紅蛋白濃度為(81.00 ± 28.01) g/L，治療后為(97.33 ± 33.18) g/L，與治療前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.38)。治療期間患者乳酸脫氫酶可以維持在一定水平，但與治療前比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.33)。網(wǎng)織紅細胞比例，除患者4與患者6治療后呈上升趨勢外，其余4例均較治療前顯著下降(表2)。5例患者完成了12周治療后克隆細胞數(shù)量的評估，其中4例外周血白細胞與紅細胞中CD55、CD59表達缺失細胞含量上升，療效顯著?；颊? Ⅲ型紅細胞比例略有下降，但CD59/FLAER表達缺失粒細胞比例有所上升；該患者的血紅蛋白在治療期間一直維持在正常水平的下限，治療后網(wǎng)織紅細胞水平也有所下降(表3)。12周治療期間患者均未出現(xiàn)新發(fā)血栓。

表2 6例PNH患者治療期間實驗室指標Tab. 2 Laboratory indicators of the 6 patients with PNH

表3 6例PNH患者治療期間外周血白細胞與紅細胞中CD55、CD59表達陰性細胞情況Tab. 3 Negative expression of CD55 and CD59 on white blood cells and red blood cells of the 6 patients with PNH during treatment

3 安全性評價 患者5治療4周后發(fā)生肺炎，治療后痊愈，期間未停止本研究實施的治療。圖1為6例患者治療期間的肝、腎功能指標。1例患者出現(xiàn)ALT一過性升高，1例AST呈持續(xù)性升高，所有患者的外周血肌酐與尿素氮水平均維持在正常范圍內(nèi)，除1例肺炎、2例肝功能損害外，未見其他明顯不良反應(yīng)。

圖1 6例PNH患者治療期間肝、腎功能Fig.1 Liver and kidney function of the 6 patients with PNH during treatment

討 論

PNH是一種克隆性造血干細胞疾病，可導(dǎo)致紅細胞、白細胞、血小板指標異常，也可影響某些內(nèi)皮細胞[5]。研究顯示，PNH發(fā)生溶血的患者5年死亡率為15%～35%，中位生存期為確診后10～22年，并發(fā)癥中血栓形成占PNH相關(guān)死亡的40%～67%，腎衰竭占PNH相關(guān)死亡的8%～18%[6]。

20世紀80年代，人們發(fā)現(xiàn)PNH細胞兩個缺失的GPI錨定蛋白CD55和CD59具有調(diào)節(jié)補體的作用。PNH紅細胞CD59的缺失導(dǎo)致攻膜復(fù)合物(membrane attack complex，MAC)的形成失控，從而導(dǎo)致補體介導(dǎo)的血管內(nèi)溶血。PNH的血管外溶血始于補體片段(主要是C3d)對PNH紅細胞的調(diào)節(jié)作用增加。由于缺乏CD55，網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)的細胞清除、破壞了上述被補體片段調(diào)節(jié)的紅細胞[7]。未經(jīng)治療的PNH患者以血管內(nèi)溶血的癥狀和體征為主，血管外溶血通常不明顯，但患者如果接受了終末補體抑制劑治療則可能顯現(xiàn)出血管外溶血的癥狀[8]。

有研究發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致GPI錨定蛋白功能喪失的主要原因為PIG-A基因的突變[6]。幾乎所有PNH患者GPI錨定缺陷都是由于PIG-A基因的體細胞突變所致。PIG-A是一種X連鎖基因，其產(chǎn)物是GPI錨定生物合成的限速酶。PIG-A基因突變不僅導(dǎo)致補體抑制蛋白CD55和CD59的缺乏，同時會引起血小板、單核細胞和粒細胞的激活[9]。

PNH發(fā)病始于缺乏GPI的造血干細胞的擴張，但研究發(fā)現(xiàn)突變的造血細胞系的克隆擴增為非惡性克隆擴增。因此研究者提出了“兩步假說”解釋這種現(xiàn)象[10]：第一步是PIG-A突變的發(fā)生，此時無克隆擴增，患者無癥狀；第二步是正常骨髓造血細胞的損傷，這將導(dǎo)致T細胞和NK細胞的激活，此時無PIG-A基因突變，但損傷的骨髓造血細胞受到免疫攻擊破壞，而PIG-A突變的細胞卻發(fā)生了免疫逃逸。這可能是由于缺乏T細胞攻擊PIG-A突變細胞所需的GPI錨定靶向多肽或輔助分子，最終造成了骨髓衰竭和PIG-A突變細胞的克隆擴張[11]。

國際PNH研究小組提出，PNH患者應(yīng)根據(jù)不同類型分型施治，亞臨床型無需治療，合并其他骨髓衰竭疾病者可以使用免疫抑制劑，重型患者可以進行異基因造血干細胞移植(allogeneichematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT)，經(jīng)典型以對癥支持治療為主，可以獲得補體抑制劑Eculizumab的地區(qū)則以Eculizumab為主[12]。

Eculizumab是一種人源化的單克隆抗體，專門針對末端補體蛋白C5，從而抑制末端補體介導(dǎo)的溶血[13]。Eculizumab的有效性和安全性已經(jīng)在多中心臨床試驗中進行了評估[3,14-15]。上述研究表明，Eculizumab可顯著減少溶血、血栓、腎損害和肺動脈高壓，改善患者的疲勞、貧血和生活質(zhì)量，同時減少輸血需求。但作為補體抑制劑，使用Eculizumab可顯著增加嚴重感染發(fā)生的機會，尤其是腦膜炎奈瑟菌，因此患者在使用Eculizumab前均應(yīng)進行針對性疫苗接種[16]。之后研究者開發(fā)的C5抑制劑在臨床試驗中也表現(xiàn)出了不劣于Eculizumab的治療效果[17]。除此之外，一種小干擾RNA藥物可以阻礙C5在肝的合成，另一種重組的蜱蛋白衍生物藥物可以阻止C5活化[18-19]。C5抑制劑最大的缺陷在于對C3介導(dǎo)的血管外溶血無效。目前正在研究的幾種C3抑制劑基本都是Compstatin的衍生物，均表現(xiàn)出了良好的臨床療效[20-21]。理論上，allo-HSCT是唯一能夠根治PNH的手段，但考慮到植入失敗、移植后感染、移植物抗宿主病等相關(guān)并發(fā)癥風(fēng)險，一般不推薦allo-HSCT作為PNH的首選治療方式。研究顯示，PNH患者年齡、輸血史、是否合并血栓是決定移植后能否長期生存的三大主要因素[22-23]。

2018年Eculizumab在中國獲批，為中國PNH患者的治療提供了新的手段，但該藥價格昂貴，目前尚未在中國上市，因此為患者開發(fā)經(jīng)濟有效的治療方案是目前亟待解決的問題。通過基因表達譜特征研究血液疾病早在2002年就已經(jīng)開始，研究發(fā)現(xiàn)，彌漫大B細胞淋巴瘤(diffuse large Bcell lymphoma，DLBCL)患者腫瘤間的基因表達存在顯著差異，而且這種差異與腫瘤增殖率、宿主反應(yīng)和腫瘤分化狀態(tài)相關(guān)，并據(jù)此將DLBCL分為生發(fā)中心B-樣DLBCL和活化B-樣DLBCL[24]。本研究團隊曾建立了AA的人類全基因組表達譜并發(fā)現(xiàn)二甲雙胍可能是治療AA的有效藥物。納入43例難治性AA患者，采用包含鹽酸二甲雙胍的聯(lián)合方案進行治療，結(jié)果顯示27例輸血依賴患者在治療6個月后全部停止輸血，40例貧血患者中37例血紅蛋白完全恢復(fù)正常，初步表明含鹽酸二甲雙胍的聯(lián)合方案治療難治性AA有效[25]。

當(dāng)前，糖皮質(zhì)激素仍然是我國PNH患者控制溶血發(fā)作的一線治療方案。一項納入92例PNH患者的單中心研究顯示，使用糖皮質(zhì)激素治療的短期(12個月)緩解率僅為79.01%，診斷后10年的總生存率約為70.77%[26]。此外，有文獻報道使用達那唑治療5例難治性PNH患者，其中4例血細胞比容升高并脫離輸血，但LDH水平和PNH克隆細胞比例并無明顯改善[27]。本研究首次在糖皮質(zhì)激素與雄激素治療的基礎(chǔ)上加用ATRA 10 mg/d，治療3個月后，PNH患者的生活質(zhì)量與臨床癥狀明顯改善，所有患者均擺脫輸血。同時ATRA在PNH克隆細胞保護、控制溶血和預(yù)防血栓方面也顯示出一定療效。ATRA是維生素A的活性代謝物，通過核內(nèi)維甲酸受體以及絲裂原活化蛋白激酶、蛋白激酶A等信號通路介導(dǎo)細胞增殖、細胞分化、細胞凋亡和胚胎發(fā)育[28]。ATRA在急性早幼粒細胞白血病(acute promyelocytic leukemia，APL)分化治療中的巨大成功，不僅改善了APL患者的預(yù)后，還促進了ATRA治療其他腫瘤的研究。研究者發(fā)現(xiàn)ATRA增強了阿霉素在乳腺癌細胞中的化療效果[29]。此外，ATRA和紫杉醇在復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中的Ⅱ期臨床試驗顯示出適度的應(yīng)答率和良好的耐受性[30]。Arrieta等[31]發(fā)現(xiàn)紫杉醇和順鉑聯(lián)合ATRA可以提高晚期非小細胞肺癌患者的緩解率和無進展生存率。

本研究首次使用ATRA治療PNH并顯示出一定療效，不足之處在于樣本量較少，需進一步擴大樣本量，延長觀察時間，明確該方案治療PNH的療效和安全性。