程澤華，王召軍，單玉靜，劉心瑤，閆筱筱，張洪映，崔紅

基因?qū)煵菝缙谧宵S質(zhì)和脫落酸生物合成及煙株耐旱性的影響研究

程澤華，王召軍，單玉靜，劉心瑤，閆筱筱，張洪映，崔紅*

河南農(nóng)業(yè)大學(xué)煙草學(xué)院，鄭州市文化路95號 450002

【】為探究煙草基因在類胡蘿卜素和脫落酸合成生物合成中的作用及其對煙株抗旱性的影響。從烤煙品種K326中同源克隆基因，采用生物信息學(xué)分析基因序列特征，利用RT-PCR分析其在煙草不同組織的表達(dá)模式。利用基因編輯手段創(chuàng)制敲除材料，并分析基因敲除后對煙株類胡蘿卜素合成及抗旱性的影響?；蛴?個拷貝，和。在煙草根、莖、葉、花中均有表達(dá)，的表達(dá)水平顯著高于。敲除材料與對照相比，紫黃質(zhì)合成基因顯著上調(diào)，紫黃質(zhì)含量顯著增加，脫落酸（ABA）合成基因表達(dá)量達(dá)到對照植株的4倍。干旱脅迫下，敲除材料幼苗與對照相比，葉片萎蔫程度更輕，長勢更優(yōu)，復(fù)水處理后生長狀態(tài)恢復(fù)的更好。干旱處理前后，敲除植株中ABA的含量均顯著提高。NtMYB68轉(zhuǎn)錄因子能抑制和基因表達(dá)，敲除該基因可以提高煙葉中紫黃質(zhì)的積累，促進(jìn)脫落酸的合成，從而提高煙株抗旱性。

煙草；基因；類胡蘿卜素；脫落酸；耐旱性。

類胡蘿卜素與煙葉外觀質(zhì)量尤其是顏色密切相關(guān)[1-2]，是煙葉內(nèi)在品質(zhì)的外在體現(xiàn)。類胡蘿卜素是煙葉中性致香物質(zhì)的重要前體，其降解生成的多種重要致香物質(zhì)閾值相對較低，刺激性小，香氣質(zhì)較好，對煙葉香氣貢獻(xiàn)率大，是影響煙葉香氣質(zhì)和香氣量的重要組分[3]，鄧小華等[4]發(fā)現(xiàn)煙葉質(zhì)量與類胡蘿卜素類降解產(chǎn)物的含量關(guān)系密切。類胡蘿卜素可高效清除體內(nèi)的自由基，提高植物的抗氧化能力，趙銘欽等[5]認(rèn)為類胡蘿卜素對降低煙氣中的自由基損害具有重要意義。此外，類胡蘿卜素是合成調(diào)控植物耐旱性激素脫落酸（ABA）的前體物質(zhì)（圖1）[6]，可以提高植物的耐旱能力[7]，已有研究表明類胡蘿卜素和煙草耐旱性密切關(guān)聯(lián)，王春菲[8]發(fā)現(xiàn)番茄紅素ε-環(huán)化酶可調(diào)節(jié)煙草抗旱性，王世菊[9]發(fā)現(xiàn)在煙草中過表達(dá)番茄黃體素合成酶LUT1可提高煙草的抗旱性。因此煙草類胡蘿卜素是國內(nèi)外的研究熱點(diǎn)。

MYB轉(zhuǎn)錄因子家族是植物中最大的基因家族之一，在植物各種生理活動中，MYB家族成員發(fā)揮的功能各不相同。龍葵能夠誘導(dǎo)花青素的合成[10]，擬南芥積極響應(yīng)干旱脅迫[11]。前人研究發(fā)現(xiàn)MYB68轉(zhuǎn)錄因子參與了柑橘中類胡蘿卜素及脫落酸的生物合成[12]，由此推測栽培煙草中的同源基因也可能參與類胡蘿卜素及脫落酸的積累。為此本研究從烤煙品種K326中克隆了基因，通過構(gòu)建基因編輯株系，探究了NtMYB68轉(zhuǎn)錄因子在煙草在類胡蘿卜素合成途徑及逆境脅迫中的作用，為改良煙草品質(zhì)及抗逆性提供理論基礎(chǔ)。

圖 1 類胡蘿卜素及脫落酸合成途徑

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)材料為煙草品種K326。培養(yǎng)于光照培養(yǎng)箱，培養(yǎng)條件為14 h光，（28 ± 1）℃/10 h暗，（24 ± 1）℃，濕度為60% ± 2%。

1.2 基因克隆

1.2.1 煙草葉片 RNA 的提取及 cDNA的合成

依照天根公司RNA提取試劑盒的說明書提取煙草葉、莖、葉、花中的總RNA，并按照Invitrogen公司反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明書將所提取的RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.2 煙草的基因克隆

以柑橘中基因的編碼區(qū)序列(GeneBank ID：XM_006475305.3)為問詢序列，在茄科基因組網(wǎng)站(https://solgenomics.net/)煙草基因組數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，獲得的同源性最高的基因作為候選基因。采用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)兩個基因的全長克隆引物（引物序列見表1），以K326葉片cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。PCR體系為50 μL體系：模板（cDNA）2 μL；正向引物1 μL；反向引物1 μL；Taq酶Mix 25 μL；用水補(bǔ)齊至50 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃ 5 min；94℃ 15 s，55℃ 5 s，72℃ 60 s，40個循環(huán)，72℃ 10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物采用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢驗(yàn)，產(chǎn)物切膠回收后連接至PMD19-T單克隆載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌，在篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)12 h后挑選陽性菌落提取質(zhì)粒進(jìn)行測序。

表1 引物序列

Tab.1 Primer sequences

1.3 生物信息學(xué)分析

利用ExPASy ProtParam網(wǎng)站（https://web.expasy. org/compute_pi/）預(yù)測蛋白質(zhì)理化性質(zhì)，利用NCBI Conserved Domains在線工具（https://www.ncbi.nlm. nih.gov/cdd）分析MYB68蛋白結(jié)構(gòu)域。利用DNAMAN軟件進(jìn)行多序列比對分析。通過MEGA5軟件構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.4 基因表達(dá)模式分析

使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)熒光定量引物（引物序列見表1），在煙株盛花期時(shí)，檢測目標(biāo)基因根、莖、葉和花中的水平。qRT-PCR反應(yīng)體系為20 μL，包括SYBR Mix 10 μL；正向引物 1 μL；反向引物 1 μL；cDNA模板2 μL；ddH2O添至20 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5℃，2 min；95℃，15 s，60℃，15 s，72℃，20 s，40個循環(huán)；溶解曲線為：95℃，15 s，60℃，15 s，20 min內(nèi)升至95℃，95℃，15 s。每個反應(yīng)設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)。以煙草核糖體蛋白基因?yàn)閮?nèi)參，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用2－△△CT法計(jì)算相對表達(dá)量。

1.5 基因敲除載體的構(gòu)建

采用CRISPR/Cas 9技術(shù)對K326中基因進(jìn)行敲除，利用在線網(wǎng)站（https://zlab.bio/guide- design-resources）在基因第1個外顯子上的保守區(qū)域設(shè)計(jì)sgRNA靶點(diǎn)序列（TTAACACTCTATG- GTCAAAT），化學(xué)合成靶位點(diǎn)序列及其反向互補(bǔ)序列，退火后形成Oligo二聚體?；蚯贸捎妹嫌萚13]使用的CRISPR/Cas9載體BGK01，Oligo二聚體與經(jīng)I酶切后的空載體進(jìn)行連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中培養(yǎng)，挑選陽性菌斑，提取質(zhì)粒進(jìn)行測序，獲得基因敲除載體。

1.6 遺傳轉(zhuǎn)化

通過凍融法將敲除載體轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌EHA105菌株感受態(tài)細(xì)胞中，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的葉盤轉(zhuǎn)化法侵染K326的葉片。在MS培養(yǎng)基上暗培養(yǎng)2 d后轉(zhuǎn)移到含有6.0 mg·L-1潮霉素的篩選分化培養(yǎng)基上（MS培養(yǎng)基+0.15 mg·L-1NAA+1 mg·L-16BA+500 mg·L-1噻孢霉素）。將分化芽移至含6.0 mg·L-1潮霉素的生根瓶中進(jìn)行培養(yǎng)（MS培養(yǎng)基+0.1 mg·L-1NAA+500 mg·L-1噻孢霉素），等到成苗時(shí)將抗性植株移栽至土中并提取DNA，在靶位點(diǎn)上下游設(shè)計(jì)引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，對PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序篩選靶位點(diǎn)發(fā)生堿基突變的株系（引物序列見表1）。

1.7 煙草色素含量的檢測

煙苗在漂浮育苗盤上長至七葉一心時(shí)，挑選狀態(tài)一致的煙苗，取大小一致的中部葉片，每10個單株為1組，設(shè)置3組作為生物學(xué)重復(fù)。于液氮速凍后，用冷凍干燥機(jī)進(jìn)行凍干處理，樣品質(zhì)體色素含量測定依照YC/T382—2010[14]。

1.8 類胡蘿卜素合成通路基因表達(dá)水平的檢測

使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)相關(guān)基因的熒光定量引物（引物序列見表1）。其中，八氫番茄紅素脫氫酶基因（）、ζ-胡蘿卜素異構(gòu)酶基因（）、ζ-胡蘿卜素脫氫酶基因（）、類胡蘿卜素異構(gòu)酶基因（）、番茄紅素ε-環(huán)化酶基因（）、番茄紅素β-環(huán)化酶基因（）、ε-環(huán)羥化酶基因（）、β-環(huán)羥化酶基因（）和玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶基因（）為類胡蘿卜素合成通路基因，9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素雙氧合酶5（）為ABA合成關(guān)鍵基因。以煙苗在七葉一心時(shí)中部葉片的cDNA為模板，以煙草核糖體蛋白基因?yàn)閮?nèi)參，檢測敲除株系類胡蘿卜素合成通路基因表達(dá)量變化?？俁NA的提取和cDNA的合成與1.2.1相同，qRT-PCR反應(yīng)體系和程序與1.4相同。

1.9 煙草干旱處理

煙苗在漂浮育苗盤上長至七葉一心時(shí)，將漂浮育苗盤控水后懸空置于高架上，在自然條件下干旱7 d，觀察其表型變化，并取干旱第0 d和第7 d時(shí)大小一致的中部葉片作為脫落酸檢測用，每3個單株為1組，設(shè)置3組作為生物學(xué)重復(fù)。樣品去掉主脈后于液氮中速凍，保存于-80℃?zhèn)溆谩?/p>

1.10 煙草脫落酸的檢測

依照劉中明等的方法[15]測定超低溫保存樣本的脫落酸含量。

1.11 數(shù)據(jù)分析

使用Excel軟件對試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理和繪制圖表，使用SPSS17.0軟件進(jìn)行方差分析（單因素ANOVA），利用最小顯著差數(shù)法（LSD 檢驗(yàn)，<0.05）進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 NtMYB68基因克隆及生物信息學(xué)分析

在煙草數(shù)據(jù)庫中獲得2個與柑橘基因同源性最高的基因（Nitab4.5_0000540g0020.1和Nitab4.5_0003781g0060.1），分別命名為和。經(jīng)克隆、測序發(fā)現(xiàn)，和編碼區(qū)全長分別為816 bp和813 bp。NtMYB68-1編碼271個氨基酸，NtMYB68-2編碼270個氨基酸，NtMYB68-2與NtMYB68-1相比在第123位缺失了1個天冬酰胺殘基，二者核苷酸相似性為92.77%（圖2）。

利用NCBI Conserved Domains在線工具（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）分析NtMYB68蛋白結(jié)構(gòu)域，發(fā)現(xiàn)MYB68具有2個典型的MYB結(jié)構(gòu)域，是一個R2R3-MYB蛋白。蛋白系統(tǒng)進(jìn)化樹分析結(jié)果表明，NtMYB68-1和絨毛狀煙草NtomMYB68的相似性為99.26%，NtMYB68-2和林煙草NsylMYB68的相似性達(dá)100%（圖3）。在白肋煙TN90、香料煙巴斯瑪基因組中均發(fā)現(xiàn)了與-1和-2序列分別相同的2個拷貝。本氏煙中也存在2個拷貝，NtMYB68-1與本氏煙NbMYB68-1、NbMYB68-2的相似性分別為86.81%、87.50%；NtMYB68-2和本氏煙NbMYB68-1、NbMYB68-2的相似性分別為86.81%、87.13%。與其它物種比對發(fā)現(xiàn)，NtMYB68-1、NtMYB68-2和番茄SlMYB68的相似性分別為60.74%、53.55%，與擬南芥AtMYB68的相似性分別為38.39%、34.52%，同柑橘CrMYB68的相似性則分別為43.96%、42.65%。以上結(jié)果表明NtMYB68在不同類型、不同品種的栽培煙草中高度保守，且與本氏煙中NbMYB68親緣關(guān)系較近，但與番茄SlMYB68、擬南芥AtMYB68和柑橘CrMYB68之間差異較大，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

注：NtMYB68：普通煙草；NsylMYB68：林煙草；NtomMYB68：絨毛狀煙草；NbMYB68：本氏煙。

圖3 不同物種MYB68的系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

2.2 NtMYB68基因表達(dá)模式分析

為研究的組織表達(dá)特性，采用qRT-PCR分別對K326的根、莖、葉、花中表達(dá)水平進(jìn)行檢測分析，結(jié)果顯示，和在根、莖、葉、花中均有表達(dá)，但基因在各個組織的表達(dá)量遠(yuǎn)高于基因表達(dá)量（圖4），由此推測發(fā)揮著更主要的功能。

圖4 NtMYB68基因組織表達(dá)特異性分析

2.3 NtMYB68基因編輯材料的創(chuàng)制

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將敲除載體轉(zhuǎn)化K326，獲得了10株潮霉素抗性苗，經(jīng)PCR擴(kuò)增和測序后有4株在gRNA區(qū)域發(fā)生突變，基因編輯率為40%，測序發(fā)現(xiàn)M106號單株（圖5B、C）為純合突變，其基因缺失了2個A堿基，基因插入了1個A堿基，導(dǎo)致的開放閱讀框發(fā)生移碼突變并造成翻譯提前終止。

注：A. 野生型NtMYB68 sgRNA序列B. M106單株NtMYB68-1 sgRNA序列C. M106單株NtMYB68-2 sgRNA序列。

2.4 NtMYB68基因敲除對類胡蘿卜素含量的影響

對M106株系及對照K326幼苗的類胡蘿卜素含量進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖6所示，敲除株系中葉黃素、β-胡蘿卜素、新黃質(zhì)和紫黃質(zhì)含量分別為1921.7 μg/g、1484.87 μg/g、556.34 μg/g、208.65 μg/g，對照株系葉黃素、β-胡蘿卜素、新黃質(zhì)和紫黃質(zhì)含量分別為1908.68 μg/g、1468.60 μg/g、518.16 μg/g、68.51 μg/g。與對照相比，敲除株系的葉黃素、β-胡蘿卜素、新黃質(zhì)含量無顯著差異，而紫黃質(zhì)含量極顯著高于對照株系，是對照株系的3倍。該結(jié)果表明基因敲除可以提高煙葉中紫黃質(zhì)的積累。

注: 圖中*表示不同材料間差異在P < 0.05具有顯著性; **表示不同材料間差異在P < 0.01水平具有顯著性。

2.5 NtMYB68基因敲除對類胡蘿卜素合成通路基因表達(dá)水平的影響

對M106株系及對照K326幼苗的類胡蘿卜素合成通路基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測，結(jié)果如圖7所示，與對照株系相比，敲除株系中類胡蘿卜素合成通路上游的、、、、、和基因表達(dá)量不存在顯著差異，而基因表達(dá)量顯著上調(diào)，表達(dá)量接近對照的2倍，表達(dá)量接近對照株系的4倍。是植物調(diào)控紫黃質(zhì)積累的關(guān)鍵基因，敲除基因后，的表達(dá)量極顯著上升，意味著紫黃質(zhì)積累速度加快，這與敲除株系中色素含量的積累規(guī)律基本一致，證明基因敲除提高了煙葉紫黃質(zhì)合成的能力，促進(jìn)了紫黃質(zhì)的積累。而基因是ABA合成的關(guān)鍵基因，該基因表達(dá)量極顯著提高。

注: 圖中*表示不同材料間差異在P < 0.05具有顯著性; **表示不同材料間差異在P < 0.01水平具有顯著性。

2.6 NtMYB68基因敲除對ABA合成通路相關(guān)基因及抗旱性的影響

對M106株系及對照K326幼苗進(jìn)行干旱處理，結(jié)果如圖8所示，干旱處理4 d后，敲除株系與K326煙苗表現(xiàn)出明顯差異，K326煙苗葉片變黃，萎蔫嚴(yán)重，表現(xiàn)嚴(yán)重的缺水癥狀，而敲除株系只有下部葉片出現(xiàn)萎蔫，上部幼嫩葉片仍然保持挺立狀態(tài)（圖8B），而復(fù)水處理12 h后敲除株系已經(jīng)恢復(fù)到較好狀態(tài)，但對照煙苗仍然處于萎蔫狀態(tài)（圖8C），表明基因敲除提高了煙株抗旱性。

對干旱處理前后的M106和K326的脫落酸含量分別進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示（圖8D），未進(jìn)行干旱處理的煙苗中，M106的脫落酸明顯提高，為K326的1.5倍，干旱處理后M106和K326的脫落酸含量均提高，但M106中脫落酸的含量仍然極顯著高于K326。對干旱脅迫下M106和K326的脫落酸合成通路基因、和表達(dá)量變化的檢測結(jié)果顯示（圖8E），經(jīng)干旱處理，M106和K326的所有基因表達(dá)量均有不同程度的上調(diào)。與K326相比，M106的基因表達(dá)量無顯著差異，而和基因表達(dá)量在干旱處理前后均顯著高于K326，特別是，其基因表達(dá)量在干旱處理前后分別為K326的2.10、1.75倍。該結(jié)果表明，基因敲除提高了煙苗中脫落酸的含量，這與ABA合成關(guān)鍵基因的表達(dá)量變化趨勢一致，而脫落酸含量的增加提高了煙株的耐旱性。

注：A，干旱第0 d；B，干旱第4 d；C，復(fù)水后12 h；D，干旱脅迫下ABA含量變化；E，干旱脅迫下ABA合成通路NtBCH基因表達(dá)量變化；F，干旱脅迫下ABA合成通路NtZEP基因表達(dá)量變化；G，干旱脅迫下ABA合成通路NtNCED5基因表達(dá)量變化。

3 討論與結(jié)論

本研究中從煙草中克隆了基因，并進(jìn)行了功能研究。煙草中基因有2個拷貝，根據(jù)序列比對推測可能來源于絨毛煙草，可能來源于林煙草。組織表達(dá)模式分析顯示基因在煙草各個組織中都有表達(dá)，其中在葉中高表達(dá)而在根中高表達(dá)、莖中次之，且的表達(dá)水平遠(yuǎn)大于，據(jù)此推測二者可能出現(xiàn)了功能分化，還需要對和分別進(jìn)行功能研究來驗(yàn)證。

類胡蘿卜素的合成除了受結(jié)構(gòu)基因控制外，還受到轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，特別是MYB轉(zhuǎn)錄因子家族[16-17]。前人在柑橘中研究發(fā)現(xiàn)是類胡蘿卜素合成的重要調(diào)控基因[12]，與之相似，本研究發(fā)現(xiàn)敲除株系紫黃質(zhì)含量達(dá)到對照3倍，說明也參與調(diào)控?zé)煵蓊惡}卜素合成。但柑橘基因突變后，α-和β-胡蘿卜素及玉米黃質(zhì)的含量發(fā)生明顯變化，而本研究發(fā)現(xiàn)煙草中只有紫黃質(zhì)響應(yīng)基因的敲除。柑橘基因能夠調(diào)控基因表達(dá)，而在煙草中基因則調(diào)控紫黃質(zhì)合成基因表達(dá)。這可能是因?yàn)椴糠滞椿蛟诓煌锓N間存在功能差異，如柑橘和擬南芥基因在進(jìn)化分支上雖較為接近，但功能仍存在差異[18]。

紫黃質(zhì)可以消耗過剩光能，保護(hù)葉綠素及光反應(yīng)復(fù)合體，同時(shí)減輕活性氧的危害，保護(hù)細(xì)胞膜免受破壞[19]。本研究創(chuàng)制的敲除株系的紫黃質(zhì)含量達(dá)到對照3倍，由此推測敲除株系煙葉發(fā)育及物質(zhì)積累更加完善，從而有利于烤后煙葉的外觀質(zhì)量及內(nèi)在品質(zhì)。此外，包括紫黃質(zhì)在內(nèi)的葉黃素類物質(zhì)可以裂解生成多種香氣成分[9]，改善煙葉香吃味，增加煙氣舒適感，提高烤后煙葉品質(zhì)，預(yù)示著敲除可以提高煙葉香氣品質(zhì)，因此對敲除株系生長發(fā)育全過程的研究以及煙葉品質(zhì)的分析將是下一步研究重點(diǎn)。

MYB基因家族功能多樣與植物生長發(fā)育和逆境脅迫密切相關(guān)[20-21]。本研究發(fā)現(xiàn)敲除后，和基因表達(dá)量顯著上調(diào)，其中玉米黃質(zhì)環(huán)氧化是ABA的第一個關(guān)鍵步驟，則是ABA合成的關(guān)鍵基因[22]。研究發(fā)現(xiàn)基因在莖和葉中高表達(dá)[23]，基因則在根中表達(dá)量較高[24]，這與在根、莖中的表達(dá)豐度高度吻合，預(yù)示著比在類胡蘿卜素合成及煙株耐旱響應(yīng)中發(fā)揮更重要的作用。干旱脅迫下，敲除株系A(chǔ)BA合成通路基因和表達(dá)水平極顯著高于對照，敲除株系的脫落酸含量也極顯著增加，與之相應(yīng)的，干旱脅迫下敲除株系的耐受能力顯著高于對照株系。以上結(jié)果預(yù)示可以直接參與調(diào)控ABA的合成，進(jìn)而影響煙草耐旱性。因此該基因在培育煙草耐旱新品種上具有重要價(jià)值。

本研究中只在苗期對敲除株系的類胡蘿卜素含量及煙苗抗旱能力進(jìn)行了分析，下一步還需要對敲除株系的生長發(fā)育全過程進(jìn)行研究，以闡明敲除對煙株農(nóng)藝性狀、煙葉質(zhì)量及抗逆性的影響，從而更好評估該基因在煙草品質(zhì)及抗性育種中的應(yīng)用潛力，為煙草優(yōu)質(zhì)高抗的定向分子改良奠定基礎(chǔ)。

[1] 王瑞新. 煙草化學(xué)[M]. 北京: 中國農(nóng)業(yè)出版社，2003: 84-85.

WANG Ruixin. Tobacco Chemistry [M]. Beijing: China Agriculture Press, 2003: 84-85.

[2] 過偉民，魏春陽，張艷玲，等. 烤煙表面顏色的量化及其與胡蘿卜素類物質(zhì)的關(guān)系[J]. 煙草科技，2012, (01): 62-68.

GUO Weimin, WEI Chunyang, ZHANG Yanling, et al. Quantitation of surface color of flue-cured tobacco leaves and its relationship with carotenoid[J]. Tobacco Science & Technology, 2012, (01): 62-68.

[3] Enzell C R, Wahlberg I. Tobacco isoprenoids-precursors of important aroma constituents[J]. Pure and Applied Chemistry, 1990, 62(7): 1353-1356.

[4] 鄧小華. 湖南烤煙區(qū)域特征及質(zhì)量評價(jià)指標(biāo)間關(guān)系研究[D]. 長沙: 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)，2007.

DENG Xiaohua. The regional characteristic and correlation of evaluating quality indexes of flue-cured tobacco in hunan[D]. Hunan Agricultural University, 2007.

[5] 趙銘欽，劉金霞，黃永成，等. 煙草質(zhì)體色素與煙葉品質(zhì)的關(guān)系綜述[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)，2007, (07): 135-138.

ZHAO Mingqin, LIU Jinxia, HUANG Yongcheng, et al. Review of the relation between the plastid pigment and the quality of tobacco leaves[J]. Chinese Agricultural Science Bulletin, 2007, (07): 135-138.

[6] Sun T H, Yuan H, Cao H B, et al. Carotenoid metabolism in plants: the role of plastids[J]. Molecular Plant, 2018, 11(1): 58-74.

[7] 陸敏，陸貴清. 脫落酸與植物非生物逆境抗性研究進(jìn)展[J]. 北方園藝，2014, (08): 184-188.

LU Min, LU Guiqing. Research progress of abscisic acid and plant abiotic stress tolerance[J]. Northern Horticulture, 2014, (08): 184-188.

[8] 王春菲，賈倩云，賈真真，等. 番茄紅素ε-環(huán)化酶調(diào)節(jié)煙草抗旱性的研究[J]. 河南大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2019, 49(4): 444- 449.

WANG Chunfei, JIA Qianyun, JIA Zhenzhen, et al. The study of lycopene ε-cyclase in drought adaption in tobacco[J]. Journal of Henan University(Natural Science), 2019, (4):444-449.

[9] 王世菊. 番茄類胡蘿卜素ε-羥化酶基因（）提高植物抗旱性的機(jī)制[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2018.

WANG Shiju. The mechanism of improved drought resistance by tomato carotenoid ε-hydroxylase gene()in plants[D]. Shandong Agricultural University, 2018.

[10] 汪少麗. MYB、bHLH、WD40類轉(zhuǎn)錄因子對茄科植物苯丙烷物質(zhì)合成調(diào)控研究[D]. 泰安: 山東農(nóng)業(yè)大學(xué), 2017.

WANG Shaoli. Regulation of phenylpropanoids biosynthesis by MYB, bHLH and WD40 transcription factors in Solanaceae[D]. Shandong Agricultural University, 2017.

[11] Ding Z, Li S, An X, et al. Transgenic expression ofconfers enhanced sensitivity to abscisic acid and improved drought tolerance in[J]. Journal of Genetics and Genomics, 2009, 36(001): 17-29.

[12] Zhu F., Luo T., Liu C., et al. An R2R3‐MYB transcription factor represses the transformation of α‐and β‐branch carotenoids by negatively regulating expression ofandin flavedo of[J]. New Phytologist, 2017, 216(1): 178-192.

[13] 孟盈，閆筱筱，王召軍，等.基因表達(dá)對煙草腺毛發(fā)生的影響[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2019, 25(02): 85-92, 98.

MENG Ying, YAN Xiaoxiao, WANG Zhaojun, et al. Effect ofgene expression on tobacco trichomes [J]. Acta Tobacco Sinica, 2019, 25(02): 85-92, 98.

[14] YC/T382-2010，煙草及煙草制品，質(zhì)體色素的測定，高效液相色譜法[S].

YC/T382-2010, Tobacco and tobacco products, Determination of plastid pigments, High performance liquid chromatography method[S]. (in Chinese).

[15] 劉中明. 過表達(dá)通過水楊酸途徑降低轉(zhuǎn)基因煙草的高溫抗性[D]. 泰安：山東農(nóng)業(yè)大學(xué)，2017.

LIU Zhongming. Over-expression ofdecreases heat tolerance of transgenic tobacco plants via salicylic acid pathway[D]. Shandong Agricultural University, 2017.

[16] Sagawa J M, Stanley L E, Lafountain A M, et al. An R2R3-MYB transcription factor regulates carotenoid pigmentation in Mimulus lewisii flowers[J]. New Phytologist, 2015, 209(3): 1049-1057.

[17] Liu G, Thornburg R W. Knockdown ofdisrupts nectary starch metabolism and floral nectar production[J]. The Plant Journal, 2012, 70(3): 377-388.

[18] Feng C, Andreasson E, Maslak A, et al.in development and responses to environmental cues[J]. Plant Science, 2004, 167(5): 1099-1107.

[19] Frank H A, Cogdell R J. Carotenoids in photosynthesis[J]. Photochemistry and Photobiology, 1996, 63(3): 257-264.

[20] 周迪. 菠蘿水心病的轉(zhuǎn)錄組分析及關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)分析[D]. 黑龍江:黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué), 2021.

ZHOU Di. Transcriptome analysis of pineapple water core and expression analysis of key transcription factors[D]. Heilongjiang Bayi Agricultural University, 2021.

[21] Jun, Cui, Ning, et al. Tomatoenhances resistance toand tolerance to water deficit and salt stress [J]. Planta, 2018, 248(6): 1487-1503.

[22] 牛志強(qiáng)，劉國順，師婷婷，等. 煙草基因的克隆及其干旱脅迫表達(dá)分析[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2015, 21(03): 100-106.

NIU Zhiqiang, LIU Guoshun, SHI Tingting, et al. Cloning ofgene inand analysis of its drought stress-induced expression [J]. Acta Tobacco Sinica, 2015, 21(03): 100-106.

[23] Audran C, Borel C, Frey A, et al. Expression studies of the zeaxanthin epoxidase gene in[J]. Plant Physiology, 1998, 118(3): 1021.

[24] Bao-Cai Tan?, Josephy L M, Dengy W T, et al. Molecular characterization of the9-cis epoxycarotenoid dioxygenase gene family [J]. Plant Journal for Cell & Molecular Biology, 2003, 35(1): 44-56.

Effect ofGene on Tobacco Seedlings Violaxanthin and Abscisic Acid Biosynthesis, and Drought Tolerance Effects ofgene on biosynthesis of flaxanthin and abscisic acid and drought tolerance of tobacco plants at seedling stage

CHENG Zehua, WANG Zhaojun, SHAN Yujing, LIU Xinyao, YAN Xiaoxiao, ZHANG Hongying, CUI Hong*

Henan Agricultural University, College of Tobacco Science, No. 95 Wenhua Road, Zhengzhou 450002

This study aims to explore the effect ofgene on the biosynthesis of carotenoids and abscisic acid and the drought resistance of tobacco plants at seedling stage.Thegene was cloned from flue-cured tobacco variety K326. Thegene sequence characteristics were analyzed by bioinformatics, and its expression pattern in different tobacco tissues was analyzed by RT-PCR. Gene editing technology was used to create a homozygous mutant line of thegene, and the effects ofgene knock-out on tobacco carotenoid synthesis and drought resistance were analyzed.There are 2 copies ofgene, including-1 and-2.is expressed in tobacco roots, stems, leaves and flowers, and the expression level of-2 is significantly higher than that of-1. Compared with the control, the violaxanthin synthesis genewas significantly up-regulated in theknock-out material, and the violaxanthin content was significantly increased. The expression level of the abscisic acid (ABA) synthesis genewas 4 times that of the control material. Under drought stress, compared with the control, the knock-out material seedlings showed lower degree of leaf wilting, better growth, and better growth recovery after rewatering. Before and after drought treatment, the content of ABA in the knock-out material was significantly increased.NtMYB68 transcription factor can inhibit the expression ofandgenes, knocking out this gene can increase the accumulation of violaxanthin in tobacco leaves and promote the synthesis of abscisic acid, thereby improving the drought resistance of tobacco.

tobacco;gene; Carotenoid; abscisic acid; drought tolerance

. Email：cuihonger_13@163.com

程澤華，王召軍，單玉靜，等. NtMYB68基因?qū)煵菝缙谧宵S質(zhì)和脫落酸生物合成及煙株耐旱性的影響研究[J]. 中國煙草學(xué)報(bào)，2022，28（2）.CHENG Zehua, WANG Zhaojun, SHAN Yujing, et al. Effect of NtMYB68 Gene on Tobacco Seedlings Violaxanthin and Abscisic Acid Biosynthesis, and Drought Tolerance Effects of NtMYB68 gene on biosynthesis of flaxanthin and abscisic acid and drought tolerance of tobacco plants at seedling stage[J]. Acta Tabacaria Sinica, 2022, 28(2).doi:10.16472/j.chinatobacco. 2021.T0186

中國煙草總公司烤煙基因組計(jì)劃和生物育種重大專項(xiàng)項(xiàng)目“烤煙葉面化學(xué)成分的分子調(diào)控和定向改良”（110202101005（JY-05）

程澤華（1997—），碩士研究生，煙草生物技術(shù)，Tel：13598538622，Email：879447518@qq.com

崔紅（1966—），Tel：13526826768，Email：cuihonger_13@163.com

2021-10-15；

2022-03-07