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針刺激活軸抑制蛋白1、腺苷酸活化蛋白激酶、絲/蘇氨酸蛋白激酶信號通路對失神經骨骼肌萎縮大鼠的保護作用

2022-04-29 08:00劉祥華羅湘筠李文倩
安徽醫(yī)藥 2022年5期
關鍵詞:腓腸肌骨骼肌電針

劉祥華,羅湘筠,李文倩

失神經骨骼肌萎縮是周圍神經損傷后,骨骼肌失去神經支配與營養(yǎng),發(fā)生的一系列形態(tài)學和功能變化,臨床常發(fā)生于工傷事故傷、車禍傷等[1]。目前,失神經骨骼肌萎縮主要采用電刺激、藥物、外科手術等來治療,可以在一定程度上修復損傷神經,但仍有部分病人的療效有待提高[2]。建立大鼠的失神經骨骼肌萎縮模型,探討更有效的治療手段,對失神經骨骼肌萎縮的防治具有重要意義。針灸是傳統(tǒng)中醫(yī)的重要組成部分,主要通過捻轉與提插等針刺手法刺激特定部位來治療疾病,近年來受到了研究者們的廣泛關注[3]。已有研究顯示[4],針灸可以促進周圍神經損傷后的修復,對于失神經肌肉萎縮具有良好的臨床療效,可以改善大鼠的肌肉萎縮狀態(tài),但其作用機制尚有待進一步探討?;诖?,本研究于2019 年5—6 月建立了大鼠失神經骨骼肌萎縮模型,旨在分析針刺治療失神經骨骼肌萎縮的作用機制,為臨床針刺在失神經骨骼肌萎縮中的治療提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與動物熒光顯微鏡購自日本Olympus 公司;戊巴比妥鈉購自美國Sigma-Aldrich公司;TUNEL 檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司;兔抗鼠絲/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、軸蛋白1(Axin1)、磷酸化的絲/蘇氨酸蛋白激酶(p-AKT)、磷酸化的腺苷酸活化蛋白激酶(p-AMPK)、B 細胞淋巴瘤2(Bcl-2)、Bcl 相關X 蛋白(Bax)、活化胱天蛋白酶(cleaved caspase-3)和增殖細胞核抗原(PCNA)單克隆抗體均購于美國Santa Cruz 公司;辣根過氧化酶標記的羊抗兔免疫球蛋白(IgG),購于上海信裕生物科技有限公司。

SD 雄性大鼠48 只,SPF 級,體質量范圍200~220 g,購自北京維通利華實驗動物技術有限公司,動物許可證號:SCXK(京)2015-0001。所有大鼠均飼養(yǎng)于本院動物中心實驗室,維持室內溫度在25 ℃左右,模擬晝夜光照環(huán)境,大鼠可自由攝食和飲水。

1.2 動物造模及干預 48 只大鼠經過預飼養(yǎng)7 d后,采用簡單隨機分組將其分為空白對照組(n=12)、假手術組(n=12)、模型組(n=12)和針刺組(n=12)。模型組和針刺組采用手術切斷坐骨神經法制備失神經骨骼肌萎縮大鼠模型[5],首先常規(guī)麻醉大鼠,局部消毒,在大鼠的右后肢股后外側行一切口,鈍性分離、暴露坐骨神經,于中段切斷,造成1.0 mm神經缺損;假手術組只暴露坐骨神經,不切斷;空白對照組不做任何處理,造模過程中共死亡1只大鼠。造模后第2 天,針刺組大鼠采用針刺干預,參考《實驗針灸學》[6]給予電針治療,取術側“足三里”和“承山”穴,以0.5 寸的毫針垂直刺入,針刺深度為5~7 mm,接入韓氏電針穴位刺激儀,頻率為5 Hz,電流強度為1.5 mA,每天1 次,持續(xù)電針刺激10 min,連續(xù)治療3周。術后觀察大鼠的行為狀態(tài)。

1.3 各組大鼠緋腸肌的濕重比術后3 周迅速處死大鼠,取大鼠雙側緋腸肌,生理鹽水沖洗,置于-80 ℃超低溫冰箱暫存。取術側緋腸肌觀察肌肉萎縮情況,對雙側緋腸肌稱重,計算緋腸肌組織的濕重比,隨后將其分成兩份,一份置于質量分數為4%的多聚甲醛溶液中固定,用于病理檢測,另一份直接凍存于-80 ℃冰箱,用于蛋白檢測。

1.4 HE 染色和TUNEL 染色檢測大鼠的緋腸肌組織病理變化取在4%多聚甲醛溶液中固定的緋腸肌組織,進行常規(guī)制作切片,隨后將其分成兩份,分別進行HE 染色和TUNEL 染色,在光學顯微鏡下觀察緋腸肌組織的病理變化和凋亡情況。HE 染色切片使用Olympus Cell Sens Standard 1.6圖像采集系統(tǒng)隨機測量在分析肌纖維直徑和橫截面積,計算患側肌纖維橫截面積比和肌纖維直徑比。TUNEL 染色切片采用Image J分析圖像,每張采用隨機數字表法選取10 個視野,計算陽性細胞數與總細胞數,計算細胞的凋亡率。

1.5 蛋白質印跡法(Western blotting)檢測各組大鼠緋腸肌細胞AKT、AMPK、Axin1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3和PCNA的表達取凍存于-80 ℃冰箱的大鼠緋腸肌組織,勻漿,嚴格按照蛋白裂解步驟提取勻漿組織中的總蛋白,經采用二喹啉甲酸蛋白定量分析試劑盒確定蛋白濃度。取50μg總蛋白依次經過電泳、轉PVDF 膜,加入質量分數為5%的脫脂牛奶,在室溫環(huán)境下封閉2 h,隨后洗膜,加一抗AKT、AMPK、Axin1、Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3 和PCNA,在溫度為4 ℃環(huán)境下孵育過夜,洗膜,加入二抗,在室溫下環(huán)境下孵育2 h。再用電化學發(fā)光顯示圖像,以β-actin 為內參,經凝膠成像分析系統(tǒng)分析各蛋白的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0 軟件分析所得實驗數據,以±s形式表示,多組間差異采用單因素方差分析,兩兩組間的差異采用SNK 法分析,以P<0.05表示組間差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠一般行為學空白對照組和假手術組大鼠行為無明顯異常,針刺術側皮膚有反應;模型組大鼠術側肢拖地,針刺術側皮膚無反應,大部分大鼠足部皮膚出現潰爛;針刺組大鼠術側肢拖地,針刺術側皮膚有輕微反應,少部分大鼠足部皮膚出現潰爛。

2.2 各組大鼠的腓腸肌組織病理損傷 HE 染色結果顯示,空白對照組和假手術組大鼠的腓腸肌肌肉組織排列規(guī)則,未見異常;模型組大鼠的腓腸肌細胞排列松散,細胞間隙變寬,肌纖維橫截面積縮小;針刺組大鼠腓腸肌細胞排列較整齊,肌纖維橫截面積明顯改善。見圖1。

2.3 針刺對失神經骨骼肌萎縮大鼠腓腸肌組織形態(tài)的影響模型組大鼠腓腸肌濕重比、肌纖維截面積比和肌纖維直徑比均明顯低于空白對照組和假手術組(P<0.05);針刺組大鼠腓腸肌濕重比、肌纖維截面積比和肌纖維直徑比均明顯高于模型組(P<0.05)。見表1。

表1 針刺對失神經骨骼肌萎縮大鼠腓腸肌組織形態(tài)的影響/±s

注:①與空白對照組比,P<0.05。②與假手術組比,P<0.05。③與模型組比,P<0.05。

組別空白對照組假手術組模型組針刺組F值P值鼠數12 12 11 12濕重比1.00±0.03 0.99±0.04 0.38±0.06①②0.52±0.07①②③434.97<0.001肌纖維截面積比1.00±0.05 0.98±0.14 0.52±0.12①②0.64±0.11①②③56.05<0.001肌纖維直徑比1.00±0.07 0.97±0.13 0.53±0.16①②0.66±0.15①②③35.92<0.001

2.4 針刺對失神經骨骼肌萎縮大鼠腓腸肌細胞凋亡的影響模型組大鼠腓腸肌細胞凋亡率(30.85±5.74)%明顯高于空白對照組(5.21±0.51)%和假手術組(5.37±0.53)%(P<0.05);針刺組大鼠細胞凋亡率(21.39±3.87)% 明顯低于模型組(P<0.05)。見圖2。

2.5 針刺對失神經骨骼肌萎縮大鼠腓腸肌增殖和凋亡相關蛋白的影響模型組大鼠腓腸肌組織Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3 和PCNA 的表達明顯高于空白對照組和假手術組(P<0.05);針刺組大鼠腓腸肌組織Bcl-2 和PCNA 的表達明顯高于模型組(P<0.05),Bax 和cleaved caspase-3 的表達明顯低于模型組(P<0.05)。見圖3、表2。

圖3 各組大鼠腓腸肌細胞增殖和凋亡相關蛋白的表達

表2 各組大鼠腓腸肌細胞增殖和凋亡相關蛋白的表達/±s

表2 各組大鼠腓腸肌細胞增殖和凋亡相關蛋白的表達/±s

注:Bcl-2為B細胞淋巴瘤2,Bax為Bcl相關X蛋白,cleaved caspase-3為活化胱天蛋白酶,PCNA為增殖細胞核抗原。①與空白對照組比,P<0.05。②與假手術組比,P<0.05。③與模型組比,P<0.05。

組別空白對照組假手術組模型組針刺組F值P值鼠數12 12 11 12 Bcl-2 0.27±0.02 0.29±0.02 0.40±0.03①②0.61±0.05①②③276.68<0.001 Bax 0.23±0.02 0.24±0.02 0.53±0.05①②0.33±0.04①②③183.23<0.001 cleaved caspase-3 0.25±0.03 0.26±0.03 0.58±0.06①②0.34±0.04①②③156.21<0.001 PCNA 0.25±0.03 0.25±0.03 0.44±0.05①②0.72±0.08①②③241.04<0.001

2.6 針刺對失神經骨骼肌萎縮大鼠腓腸肌AKT、AMPK、Axin1 蛋白表達的影響模型組大鼠腓腸肌組織p-AKT/AKT、p-AMPK/AMPK、Axin1 的表達明顯高于空白對照組和假手術組(P<0.05);針刺組大鼠腓腸肌組織p-AKT/AKT、Axin1 的表達明顯高于模型組(P<0.05),p-AMPK/ AMPK 的表達明顯低于模型組(P<0.05)。見圖4、表3。

圖4 各組大鼠腓腸肌細胞AKT、AMPK、Axin1 蛋白表達的影響

表3 各組大鼠腓腸肌細胞絲/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、軸蛋白1(Axin1)蛋白表達的影響/±s

表3 各組大鼠腓腸肌細胞絲/蘇氨酸蛋白激酶(AKT)、腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、軸蛋白1(Axin1)蛋白表達的影響/±s

注:①與空白對照組比,P<0.05。②與假手術組比,P<0.05。③與模型組比,P<0.05。

組別空白對照組假手術組模型組針刺組F值P值鼠數12 12 11 12 p-AKT/AKT 0.35±0.04 0.37±0.04 0.54±0.06①②0.82±0.09①②③152.11<0.001 p-AMPK/AMPK 0.34±0.03 0.35±0.02 0.73±0.04①②0.51±0.03①②③405.02<0.001 Axin1 0.26±0.03 0.27±0.03 0.41±0.05①②0.62±0.06①②③172.34<0.001

3 討論

失神經骨骼肌萎縮在中醫(yī)屬“痿癥”范疇,主要表現為筋骨痿軟、皮膚麻木等,主要病機為氣血虧虛、血脈瘀滯[7]。針灸是我國中醫(yī)的重要組成部分之一,《黃帝內經》指出“治痿獨取陽明”,“足三里”具有理氣和血、舒筋活絡的功能,和“承山”均為治療下肢瘓癥之要穴,兩穴配合可以改善下肢局部的微循環(huán),抑制肌肉萎縮[8]。因此,本研究取“足三里”和“承山”,分析電針對失神經骨骼肌萎縮大鼠的作用機制。本研究中,電針治療可以有效增加失坐骨神經大鼠腓腸肌的濕重、肌纖維的直徑和面積。腓腸肌是坐骨神經的靶器官,坐骨神經損傷后,腓腸肌會失去神經支配,從而出現肌纖維不可逆地萎縮、變形[9]。陳玄等[10]的研究顯示,電針治療可以增加失神經骨骼肌萎縮大鼠的濕重,與本研究結果基本一致,證實電針治療可以延緩失神經大鼠骨骼肌的萎縮。

臨床研究顯示,肌肉萎縮主要是由于細胞凋亡和增殖之間的平衡被打破后,引起的肌細胞數量減少和殘存的肌細胞體積減?。?1]。本研究中,電針治療可以抑制失坐骨神經大鼠腓腸肌的凋亡,促進組織細胞中Bcl-2 和PCNA 蛋白表達,降低Bax 和cleaved caspase-3 蛋白表達。Bcl-2/Bax 是一組調控組織細胞凋亡的蛋白,主要通過調節(jié)線粒體膜的通透性,釋放細胞色素C進入胞質,激活凋亡執(zhí)行蛋白Caspase-3,從而降解細胞內的重要蛋白,誘導組織細胞凋亡[12]。吳珍元等[13]的研究顯示,細胞凋亡在大鼠失神經骨骼肌萎縮的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用,抑制骨骼肌細胞的凋亡對于延緩骨骼肌萎縮具有重要意義,提示電針治療可能通過抑制失坐骨神經大鼠骨骼肌細胞的凋亡,延緩骨骼肌萎縮。PCNA 是一種細胞增殖核抗原,是真核細胞DNA 合成所必需的一種核蛋白,可以反映肌衛(wèi)星細胞的增殖活性[14]。吳夢佳等[15]的研究顯示,針刺治療可以調節(jié)肌衛(wèi)星細胞的增殖分化和凋亡,防治骨骼肌萎縮,本研究結果與其類似。結合本研究結果表明,電針治療可能通過促進肌衛(wèi)星細胞的增殖,抑制其凋亡,延緩失神經大鼠骨骼肌的萎縮。

本研究中,電針治療可以上調Axin1 和p-AKT的表達,下調AMPK 的磷酸化。AMPK 是AMP 依賴的蛋白激酶,也是骨骼肌細胞的能量感受器,是機體能量代謝調節(jié)的關鍵因子[16]。研究顯示,AMPK被激活后可以降低Akt 的磷酸化水平,降解骨骼肌蛋白質,參與能量代謝[17]。AKT 是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶,又稱蛋白激酶B,參與了而機體多條關鍵信號通路,在細胞的存活和凋亡中具有重要作用[18]。Axin蛋白在生物體內普遍表達,包括Axin l和Axin 2兩個亞型,參與了機體多種信號通路,是Wnt/βcatenin、p53 等信號通路的關鍵蛋白,可以參與調節(jié)肌衛(wèi)星細胞的增殖、分化、凋亡等過程[19]。Zhang等[20]的研究顯示,Axin 1 可能通過與AMPK 發(fā)生免疫共沉淀,形成復合物,抑制AMPK 的活化,從而激活肌管細胞中的AKT。AKT 的磷酸化可以參與機體多種信號通路,抑制肌蛋白降解,促進蛋白合成,促進生肌細胞分化,抑制肌肉萎縮[21-22]。高睿琦等[22]的研究顯示,電針可以上調失神經大鼠AKT 的磷酸化,改善骨骼肌萎縮,與研究結果基本相符,提示電針治療可能通過上調Axin1 的表達,與AMPK形成復合物,從而抑制AKT 的磷酸化,促進肌細胞的分化,抑制肌蛋白的降解。

綜上所述,電針治療可能通過上調Axin1 的表達,抑制AMPK 的磷酸化,激活AKT 的磷酸化,促進骨骼肌的增殖、分化,抑制其凋亡,延緩失神經大鼠骨骼肌的萎縮,為臨床治療提供了一定的理論依據。但Axin1/AMPK/AKT 參與了機體多種生物學過程,電針治療作用于失神經骨骼肌萎縮大鼠的關鍵靶位點尚需進一步探索驗證。

(本文圖1,2見插圖5-1)

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