徐羽，謝奇朋，陳少敏，葉涵濤，李飛達，水小龍

溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院，浙江 溫州 325027，1.骨科；2.檢驗科；3.康復科

膝骨關節(jié)炎（knee osteoarthritis, KOA）作為一種常見的慢性退行性疾病，其主要特點為關節(jié)軟骨損傷、軟骨下骨破壞、滑膜炎癥、骨贅增生。KOA患者臨床上常表現(xiàn)為關節(jié)疼痛、僵硬、彈響和功能障礙，患者的日常生活、工作和活動深受影響。OA的進展取決于由于機械負荷和炎癥增加導致的軟骨破壞[1]。軟骨內(nèi)軟骨細胞的損傷能夠釋放與損傷相關的分子模式（damage associated molecular patterns, DAMPs）[2]。一般認為原發(fā)性骨關節(jié)炎是多種致病因素包括機械性和生物性因素的相互作用所致。由于發(fā)病機制與病因太過復雜和不明確，目前為止影像學改變是KOA早期發(fā)現(xiàn)和診斷的主要方法，但只有當患者局部軟骨組織出現(xiàn)不可逆轉的損傷時經(jīng)X線檢查才會發(fā)現(xiàn)，因此影像學診斷缺乏特異性及敏感性[3]。目前尚缺乏有效逆轉和阻斷KOA進展的方法，探尋出一種可以用于早期診斷KOA的方法并采取有效的治療措施是我們應該努力的方向。本研究主要探討損傷相關的分子模式在KOA的診斷、進展及預后判斷中的作用。

1 資料和方法

1.1 一般資料 從2020年10月1日至2021年1月1日在溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院住院的患者中選取經(jīng)全膝關節(jié)置換或膝關節(jié)鏡手術治療的KOA患者56例（試驗組），所有試驗組患者均符合由中華醫(yī)學會各科學分會制定的KOA的診斷標準，同時至少有一側膝關節(jié)符合KOA的放射性診斷標準，見表1。納入標準：①確診為KOA并在本院行膝關節(jié)置換或膝關節(jié)鏡清理者；②根據(jù)Kellgren-Lawrence（K-L）分級為2～4級者；③受試者簽署知情同意書。

表1 KOA的診斷標準

排除標準：①嚴重的糖尿?。虎陬愶L濕關節(jié)炎；③創(chuàng)傷性關節(jié)炎；④近90 d內(nèi)有關節(jié)藥物注射史；⑤近90 d內(nèi)有止痛藥物服用史；⑥其他類型的骨關節(jié)病；⑦有糖皮質激素藥物服用史；⑧系統(tǒng)性感染性疾??；⑨自體免疫紊亂性疾?。虎鈵盒?、慢性疾病。隨機選取25例于2020年10月1日至2021年1月1日期間在溫州醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院住院的體質量指數(shù)（body mass index, BMI）與試驗組匹配的非KOA患者為對照組。研究經(jīng)本院醫(yī)學倫理委員會審核（編號：LCKY2019-34）。

1.2 K-L分級方法 K-L分級標準見表2。

表2 K-L分級標準

1.3 樣本采集和測量方法 常規(guī)靜脈采血約5 mL，置含分離膠的橙色蓋真空采血管內(nèi)，2 h內(nèi)轉運至實驗室，接收標本后在30 min內(nèi)將標本離心（3 500 r/min，10 min）分離為血清和細胞組分，將血清分裝至潔凈EP管，全過程嚴格控制，避免溶血。

采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法（enzyme linked immunosorbent assay, ELISA）測定血清β-Amyloid（美國CUSBIO公司）濃度[4]。

1.4 統(tǒng)計學處理方法 采用SPSS26.0 統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理與分析。計量資料符合正態(tài)分布用±s表示，2 組間比較用t檢驗；非正態(tài)分布用M（P25，P75）表示，2組間比較用Mann-WhitneyU檢驗。計數(shù)資料用百分比表示，用χ2檢驗。用非條件Logistic逐步回歸模型分析危險因素。相關性分析用Pearson相關或Spearman相關分析。繪制受試者工作特征（receiver operator characteristic curve, ROC）曲線評價血清β-Amyloid對KOA的預測價值。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般情況 本研究納入試驗組56 例，對照組25 例。兩組性別、年齡、BMI等基本情況差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表3。KOA患者的β-Amyloid、C-反應蛋白（C-reactionprotein, CRP）、血尿素氮（blood urea nitrogen, BUN）和尿酸顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），而高遷移率族蛋白B1（high mobility group protein B1, HMGB1）、谷丙轉氨酶（glutamic pyruvic transaminase, ALT）、谷草轉氨酶（glutamic oxaloacetic transaminase, AST）、總膽紅素（total bilirubin, TBIL）和血肌酐（creatinine, CREA）差異無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），見表4。

表3 兩組患者一般情況

表4 兩組患者實驗室指標的比較

2.2 非條件Logistic逐步回歸模型分析KOA危險因素 為進一步確定KOA的獨立危險因素，以KOA為因變量，單因素分析有統(tǒng)計學意義的指標為自變量，擬合非條件Logistic回歸模型。結果顯示，β-Amyloid是KOA發(fā)生的獨立危險因素（OR=15.122，P=0.028），見表5。

表5 KOA危險因素的單因素和多因素Logistic回歸分析

2.3 血清β-Amyloid診斷KOA的ROC曲線 血清β-Amyloid診斷KOA的ROC曲線提示，其曲線下面積（area under curve, AUC）為0.752（0.636～0.867），β-Amyloid臨界值為0.770 ng/mL，特異度為60.0%，敏感度為85.5%，見圖1。

圖1 血清β-Amyloid診斷KOA的ROC曲線

2.4 不同嚴重程度KOA患者β-Amyloid水平比較

56例試驗組按照K-L分級分為K-L 2級8例、K-L 3/4級48例患者。β-Amyloid的表達在K-L 2級與K-L 3/4級間差異有統(tǒng)計學意義（t=-2.093，P=0.041），見圖2。且β-Amyloid的表達與KOA嚴重程度分級呈顯著正相關（r=0.332，P=0.013），提示患者血清β-Amyloid越高，KOA越嚴重。

圖2 β-Amyloid在不同K-L分級KOA患者中的表達

2.5 血清β-Amyloid在KOA手術前后變化值與康復恢復時間分析 比較K-L 4級患者中有8例患者術前術后血清β-Amyloid的表達變化以及患者的住院時間，β-Amyloid在K-L 4級KOA患者術后較手術前顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義（t=3.749，P=0.002），見圖3。且KOA患者手術前后血清β-Amyloid變化值與患者住院時間呈顯著負相關（r=-0.949，P＜0.001），提示KOA患者手術前后血清β-Amyloid下降越多的患者住院時間越短，康復恢復越快，見圖4。以疼痛、活動受限、關節(jié)畸形等為主要臨床表現(xiàn)，病理學變化表現(xiàn)為關節(jié)軟骨損傷、骨贅形成、軟骨下骨及半月板等組織的改變。據(jù)調(diào)查中國癥狀性KOA（診斷明確，存在臨床癥狀且需要就診）的患病率為8.1%，且女性患病率明顯高于男性[5]。其中，大于55歲的人群中約60%具有KOA的影像學表現(xiàn)，65歲以上的老年人KOA的發(fā)病率可達85%[6]。KOA發(fā)病受多種因素影響，包括遺傳、性別、種族、年齡、肥胖、關節(jié)過度活動和損傷等[7]。其致病機制復雜，原發(fā)性損傷常涉及機械應力、炎癥、代謝、免疫、遺傳等因素，繼發(fā)性多由創(chuàng)傷、關節(jié)先天發(fā)育不良或醫(yī)源性損傷引起[8]。隨著社會的發(fā)展、人口老齡化的加快、肥胖人群比例的上升，膝骨關節(jié)創(chuàng)傷的增加，KOA發(fā)病率顯著增高。不僅對個人的生理功能、生活質量造成嚴重損害，還導致了個人、家庭和社會的經(jīng)濟成本顯著增加。

圖3 β-Amyloid在KOA術前和術后中的表達比較

圖4 術前后血清β-Amyloid變化值與患者住院時間的相關性

本研究發(fā)現(xiàn)β-Amyloid分子在KOA患者中顯著升高，而在術后顯著下降。細胞膜上的淀粉樣蛋白前體（amyloid protein precursor, APP）經(jīng)β和γ蛋白酶的水解形成Mr 4 000左右的蛋白，稱為β-Amyloid（β-淀粉樣蛋白）。GLENNER等[9]1980年首先分離和測序了β-Amyloid，發(fā)現(xiàn)其通常兩種形式存在，分別

3 討論

KOA多發(fā)于中老年人，是一種退行性關節(jié)病變，為β-淀粉樣蛋白40（amyloid-β protein 40, Aβ40）和β-淀粉樣蛋白42（amyloid-β protein 42, Aβ42）。自從它被發(fā)現(xiàn)以來就與阿爾茲海默?。ˋlzheimer’s disease, AD）密切相關。β-Amyloid通過氧化應激和Ca2+超載導致細胞內(nèi)凋亡因子激活，同時破壞線粒體使細胞的供能系統(tǒng)障礙，最終造成凋亡[10]。此外，β-Amyloid還可以激活神經(jīng)膠質細胞，釋放細胞因子和炎癥介質，產(chǎn)生炎癥反應，從而間接損傷神經(jīng)細胞[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)β-Amyloid在KOA中明顯升高，術后的β-Amyloid水平較術前明顯降低，表明其不僅能夠提示KOA的發(fā)生，還對KOA的預后有著一定的提示作用。根據(jù)此前在AD中的研究，機體APP和β-Amyloid的代謝受機體老化、毒素、感染、炎癥等外界因素的影響，發(fā)生紊亂引起β-Amyloid的異常釋放和沉積[13]。而從KOA發(fā)病機制上來看，在機械力學作用、炎癥、免疫代謝、遺傳等多因素作用下會誘發(fā)KOA[14]。推測在KOA患者中，可能正是因為炎癥反應等因素作用，導致β-Amyloid代謝紊亂增加，進而引發(fā)線粒體損傷和神經(jīng)元細胞凋亡。線粒體的損傷進一步導致β-Amyloid代謝障礙和堆積，發(fā)展為β-Amyloid不斷堆積的惡性循環(huán)；β-Amyloid的堆積又損傷神經(jīng)細胞，釋放細胞因子和炎癥介質，加強了炎癥反應，進一步導致β-Amyloid累積。而手術清除了炎癥反應灶，中斷了惡性循環(huán)，使得β-Amyloid降低。

非條件Logistic逐步回歸模型分析KOA的危險因素，結果顯示β-Amyloid是KOA患病的危險因素（OR=15.122），表明β-Amyloid與KOA的發(fā)生發(fā)展密切相關。Spearman秩相關分析，提示β-Amyloid的表達量和KOA嚴重程度呈正相關；Pearson相關分析，提示患者手術前后β-Amyloid的表達變化和康復恢復時間呈負相關。綜上所述，β-Amyloid是KOA患病的危險因素，血清β-Amyloid水平可能成為一種評估KOA發(fā)生及預后的生物標志物。

本研究樣本比較少，時間跨度短，下一步計劃納入更多患者進行進一步驗證。康復恢復指標近患者住院時間，指標單一，下一步需增加功能活動康復指標，做進一步的深入研究。