潘彬惠，施江敏，季夏薇，陳華森，徐昌隆

1.溫州醫(yī)科大學(xué) 第二臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；2.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 消化內(nèi)科，浙江 溫州 325027

人類口腔中存在許多微生物，成年人口腔中有500～1 000億細(xì)菌，其中占主要部分的有200多種[1]。多種口腔微生物的協(xié)同和相互作用，可以幫助人體抵御外界不良刺激的入侵[2]。當(dāng)口腔微生態(tài)平衡被打破時(shí)，致病菌特別是兼性厭氧菌大量繁殖，通過(guò)直接入侵或引起免疫-炎癥反應(yīng)擴(kuò)散至全身循環(huán)中，導(dǎo)致疾病的發(fā)生。研究表明，失衡的口腔菌群不僅與齲齒[3-4]、牙周炎[5]、口腔癌癥[6]等多種口腔疾病相關(guān)，還在全身系統(tǒng)性疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用[7-10]。作為全身微生態(tài)系統(tǒng)的一份子，與身體其他部位相比，口腔中的菌群獨(dú)特且易于獲得。因此，以口腔微生態(tài)為切入點(diǎn)研究口腔及全身系統(tǒng)性疾病，是一種無(wú)創(chuàng)、簡(jiǎn)單且有效的手段。

口腔前庭溝為位于唇、頰與牙列、牙齦及牙槽骨、牙弓之間的蹄鐵形的潛在腔隙，見(jiàn)圖1。此處溫暖潮濕，密閉性好，是口腔微生物特別是厭氧致病菌易于聚集性生長(zhǎng)之處。利用此間隙容納異物的能力，可構(gòu)建一種吸水性強(qiáng)、異物感弱的載體模型，該載體不僅可以對(duì)口腔原生態(tài)菌液進(jìn)行提取，研究口腔微生態(tài)及相關(guān)代謝產(chǎn)物的構(gòu)成，并且可以通過(guò)該載體人工干預(yù)口腔原生態(tài)環(huán)境。目前臨床上通過(guò)干預(yù)口腔原生態(tài)環(huán)境影響口腔健康及系統(tǒng)相關(guān)性疾病的研究尚不完善，通過(guò)口腔前庭溝干預(yù)口腔菌群的工作鮮見(jiàn)報(bào)道。本研究以口腔前庭溝的利用為切入點(diǎn)，探討干預(yù)口腔微生態(tài)的方法，以期為口腔保健及全身系統(tǒng)相關(guān)疾病研究提供一種新的思路。

圖1 口腔前庭溝示意圖

1 對(duì)象和方法

1.1 材料 無(wú)菌棉條購(gòu)自南昌恩惠醫(yī)用衛(wèi)生材料有限公司，無(wú)菌凍存管購(gòu)自美國(guó)Corning公司，唾液采集器購(gòu)自杭州新景生物試劑開發(fā)有限公司，凍干菌粉購(gòu)自上海奕農(nóng)生物科技有限公司。

1.2 受試者和分組 選取溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科的研究生10名，根據(jù)是否齲齒將受試者分為2組（每組n=5）：齲齒組、正常對(duì)照組。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①成年志愿者，身體健康狀況良好；②日?？谇恍l(wèi)生習(xí)慣良好，每日早晚各刷牙一次；③研究期間能接受并嚴(yán)格遵守試驗(yàn)規(guī)則，不使用除本干預(yù)措施之外的任何口腔護(hù)理產(chǎn)品（包括含抗生素的漱口液、抑菌牙膏、木糖醇口香糖等），保證受試期間飲食平衡與平常一致。排除標(biāo)準(zhǔn)：①體質(zhì)量指數(shù)（bady mass index, BMI）＞30 kg/m2；②任何可能干擾研究結(jié)果的家族遺傳性疾病或者嚴(yán)重系統(tǒng)性疾??；③近1個(gè)月內(nèi)服用抗生素，6個(gè)月內(nèi)服用激素或者免疫抑制劑，6個(gè)月內(nèi)接受過(guò)防齲治療；④日常食用益生菌習(xí)慣者，日常咀嚼木糖醇口香糖習(xí)慣者；⑤口腔黏膜發(fā)生有臨床意義的病變：如鵝口瘡、感染性口炎、地圖舌、口角炎、慢性唇炎等。本研究獲得溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有受試者均簽署知情同意書。

1.3 棉條菌液采集有效性觀察 隨機(jī)選取正常對(duì)照組中的2名受試者（受試者A和B），分別通過(guò)無(wú)菌棉條（受試者A：Cott 1；受試者B：Cott 2）及唾液采集器（受試者A：Sali 1；受試者B：Sali 2）采集口腔唾液，對(duì)比分析其唾液中的菌群組成及短鏈脂肪酸含量。具體操作過(guò)程：①無(wú)菌棉條留取棉條唾液：a.由同一工作人員于受試者入睡前將無(wú)菌棉條用無(wú)菌鑷子置于口腔內(nèi)過(guò)夜，位置為雙側(cè)下頜第一磨牙與正對(duì)頰黏膜之間的空隙；b.囑受試者入睡至次晨勿飲水、漱口、飲食、刷牙；c.次晨5點(diǎn)由同一工作人員用無(wú)菌鑷將無(wú)菌棉條取出，置于2 mL凍存管中，記錄濕重，并記錄取出棉條的位置，保存于-80 ℃冰箱中。②唾液采集器采集液體唾液：a.在采集唾液樣本前30 min，囑受試者用飲用水將口腔內(nèi)的雜物洗漱干凈；b.用舌尖抵住上顎或下顎齒根以富集唾液，向采集漏斗中輕輕吐入唾液至刻度線高度；c.使唾液與唾液保存液充分混勻后保存于-80 ℃冰箱中。③檢測(cè)樣本中菌群組成及短鏈脂肪酸含量：利用16S rDNA擴(kuò)增測(cè)序及靶向代謝組學(xué)技術(shù)檢測(cè)并比較棉條唾液及唾液采集器采集的唾液中的菌群組成及短鏈脂肪酸含量。

1.4 益生菌棉條干預(yù)口腔微生態(tài) 將浸潤(rùn)凍干菌粉的益生菌棉條，分別置于齲齒組及正常對(duì)照組的口腔中過(guò)夜，次晨取出。重復(fù)7 d后，檢測(cè)受試者口腔中的細(xì)菌，觀察分析組成變化。具體步驟：受試者分為兩組（每組n=5，齲齒組和正常對(duì)照組）。①利用無(wú)菌棉條分別留取兩組受試者的口腔菌液，將益生菌棉條未干預(yù)之前的一天認(rèn)定為第0天；②用1 mL 0.9%氯化鈉溶液將1 g凍干菌粉融化后浸潤(rùn)無(wú)菌棉條，使棉條充分吸收富含益生菌的液體，制備益生菌棉條；③將益生菌棉條置于兩組受試者的口腔中過(guò)夜，位置為雙側(cè)下頜第一磨牙與正對(duì)頰黏膜之間的空隙，次晨取出丟棄，重復(fù)7 d；④第8天，再次利用無(wú)菌棉條留取兩組受試者的口腔菌液；⑤利用16S rDNA擴(kuò)增測(cè)序技術(shù)檢測(cè)兩組受試者益生菌棉條干預(yù)對(duì)口腔菌液中菌群的影響。C0：正常對(duì)照組第0天，即益生菌棉條干預(yù)前口腔菌液的物種信息；C8：正常對(duì)照組第8天，即益生菌棉條干預(yù)后口腔菌液的物種信息；T0：齲齒組第0天，即益生菌棉條干預(yù)前口腔菌液的物種信息；T8：齲齒組第8天，即益生菌棉條干預(yù)后口腔菌液的物種信息。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 使用Qiime軟件（Version 1.9.1）計(jì)算Observed-otus、Chao1、Shannon、Simpson、ace、Goods-coverage、PD_whole_tree指數(shù)，使用R軟件（Version 2.15.3）繪制稀釋曲線、等級(jí)聚類（Rank Abundance）曲線、物種累積曲線，并使用R軟件進(jìn)行α多樣性指數(shù)組間差異分析；使用R軟件繪制PCA、PCoA和NMDS圖。PCA分析使用R軟件的ade4包和ggplot2軟件包，PCoA分析使用R軟件的WGCNA，stats和ggplot2軟件包，NMDS分析使用R軟件的vegan軟件包。同時(shí)使用R軟件進(jìn)行α和β多樣性指數(shù)組間差異分析，分別進(jìn)行參數(shù)檢驗(yàn)和非參數(shù)檢驗(yàn)，2組間比較采用t檢驗(yàn)或Wilcox檢驗(yàn)，多于2組選用Tukey檢驗(yàn)或agricolae包的Wilcox檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 通過(guò)棉條采集的菌液可以有效反映口腔菌群組成與功能 將正常對(duì)照組受試者A/B分別通過(guò)唾液采集器及無(wú)菌棉條采集的唾液，根據(jù)聚類得到操作分類單位（operational taxonomic units, OTUs）結(jié)果和研究需求，對(duì)棉條唾液及液體唾液進(jìn)行均一化處理，分析液體唾液與棉條唾液之間共有、特有的OTUs。通過(guò)韋恩圖發(fā)現(xiàn)，棉條唾液與液體唾液之間存在大量重疊的功能單位，即通過(guò)棉條采集的唾液中檢測(cè)到的菌群和通過(guò)常規(guī)方式獲取的唾液中檢測(cè)到的菌群之間在很大一部分上是相同的，而通過(guò)棉條這一口腔菌液載體可檢測(cè)到的微生物更豐富，見(jiàn)圖2A、圖2B。將樣本中的功能單位按相對(duì)豐度由大到小排序得到對(duì)應(yīng)的排序編號(hào)，再以O(shè)TUs的排序編號(hào)為橫坐標(biāo)，OTUs中的相對(duì)豐度為縱坐標(biāo)，將這些點(diǎn)用折線連接，繪制得到Rank Abundance曲線。從曲線可以看出，通過(guò)棉條獲取的口腔菌液相比于通過(guò)常規(guī)方式獲得的口腔菌液有更好的物種豐度和均勻度。見(jiàn)圖2C和圖2D。

圖2 基于OTUs的韋恩圖（A、B）和Rank Abundance曲線（C、D）

為進(jìn)一步分析兩種方式獲取的口腔菌液之間的菌群構(gòu)成差異，我們比較了兩標(biāo)本中基于屬水平物種豐度排名前10 的菌類。通過(guò)對(duì)比發(fā)現(xiàn)，通過(guò)棉條獲得的口腔菌液與通過(guò)唾液采集器采集的唾液之間菌群構(gòu)成相似，如受試者A都是以鏈球菌屬（Streptococcus）為主要占比菌屬，而受試者B則都是以嗜血桿菌屬（Haemophilus）為主要占比菌屬，但是棉條唾液中相對(duì)可測(cè)的微生物較液體唾液更完整，表明通過(guò)棉條收集的唾液可以更直觀地反映口腔菌群的組成。見(jiàn)圖3A和圖3B。

圖3 基于屬水平的最大豐度排名物種柱狀圖

除此之外，我們檢測(cè)了兩種方式獲得的口腔菌液的短鏈脂肪酸濃度，包括乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸、異戊酸、己酸，見(jiàn)表1。作為細(xì)菌最為豐富且常見(jiàn)的代謝產(chǎn)物，短鏈脂肪酸濃度可以直接反映菌群的代謝活躍程度，從而從另一方面提示了菌群的功能。通過(guò)棉條獲取的口腔菌液，相比于通過(guò)唾液采集器收集的菌液，擁有更為豐富的短鏈脂肪酸豐度，尤其體現(xiàn)在乙酸和丙酸這兩種特殊的短鏈脂肪酸上。

表1 不同采集方式下唾液中短鏈脂肪酸含量（μg/mL）

2.2 通過(guò)棉條采集的菌液可以體現(xiàn)齲齒患者與正常受試者之間的口腔菌群差異 根據(jù)韋恩圖所示，齲齒組患者與正常對(duì)照組患者之間在OTUs上存在差異。在干預(yù)之前，兩組患者享有539個(gè)共同的功能單位，齲齒組患者的功能單位總數(shù)（OTUs=742）略多于正常對(duì)照組（OTUs=722），見(jiàn)圖4A。而在干預(yù)之后，兩組之間共同的功能單位減少為503個(gè)，并且正常對(duì)照組的菌群功能單位數(shù)目（OTUs=812）明顯多于齲齒組中的功能單位總數(shù)（OTUs=616），見(jiàn)圖4B。由此可見(jiàn)，齲齒患者與正常受試者之間的口腔菌群在數(shù)量上是不同的。

另外，我們選取并分析了齲齒組和正常對(duì)照組受試者基于屬水平最大豐度排名前10的物種發(fā)現(xiàn)，兩組在口腔菌群的菌屬組成類別相似，但是在組成豐度方面存在一定的差異。在未進(jìn)行干預(yù)之前，兩組受試者都是以鏈球菌屬（Streptococcus）為主要組成菌屬，其次為嗜血桿菌屬（Haemophilus）、變形菌屬（Prevotella），但是鏈球菌屬在齲齒患者中的占比明顯高于對(duì)照組中，而變形菌屬在齲齒組的占比則明顯低于對(duì)照組，見(jiàn)圖4C。對(duì)樣本的菌群同樣進(jìn)行了物種差異性顯著分析。通過(guò)α多樣性分析中的LEfSe分析發(fā)現(xiàn)，在齲齒組和正常對(duì)照組之間，普氏菌（Prevotellaceae）差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖4D。

圖4 齲齒組與正常對(duì)照組之間物種差異

2.3 益生菌棉條可以干預(yù)口腔菌群組成 通過(guò)韋恩圖對(duì)所有樣本進(jìn)行均一化，發(fā)現(xiàn)益生菌棉條干預(yù)前后的口腔菌群存在功能單位的差異。正常對(duì)照組干預(yù)之后的菌群OTUs較干預(yù)之前上升，而齲齒組干預(yù)后的口腔菌群OTUs相較于干預(yù)之前有所減少，見(jiàn)圖5A和圖5B?；讦炼鄻有缘奈锓N分析提示對(duì)照組及齲齒組在干預(yù)之前樣本中的物種總數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但通過(guò)益生菌棉條干預(yù)之后，發(fā)現(xiàn)正常對(duì)照組與齲齒組之間的物種總數(shù)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖5C。Shannon指數(shù)提示益生菌棉條干預(yù)前后的正常對(duì)照組（C0-C8）與齲齒組（T0-T8）均存在顯著的物種差異（P＜0.05），見(jiàn)圖5D。

我們進(jìn)一步通過(guò)t檢驗(yàn)對(duì)樣本中的物種進(jìn)行了基于屬水平的統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。益生菌棉條干預(yù)之后，正常對(duì)照組馬賽菌屬（Massilia）及節(jié)桿菌屬（Arthrobacter）顯著升高（P＜0.05），毛螺旋菌屬（Lachnospiraceae_NK4A136_group）顯著降低（P＜0.05）；而在齲齒組中，泛菌屬（Pantoea）及嗜二氧化碳噬細(xì)胞菌屬（Capnocytophaga）在益生菌棉條干預(yù)之后顯著升高（P＜0.05）。利用LEfSe分析對(duì)組間的物種豐度數(shù)據(jù)通過(guò)秩和檢驗(yàn)的方法來(lái)檢測(cè)不同分組間的差異物種并通過(guò)線性判別分析（linear discriminant anlysis, LDA）實(shí)現(xiàn)降維從而評(píng)估差異物種的影響大小，得到LDA值，繪制差異物種的LDA值分布柱狀圖。我們分析了LDA值大于設(shè)定值（默認(rèn)設(shè)置為4）的物種，即組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)志物。通過(guò)益生菌棉條干預(yù)，正常對(duì)照組中變形桿菌和丙型變形桿菌顯著升高，反之，厚壁菌（Firmicutes）顯著降低，見(jiàn)圖5E；而在齲齒組中，干預(yù)之后的菌群相較于尚未干預(yù)的菌群，黃桿菌（Flavobacteriales）顯著升高，見(jiàn)圖5F。

圖5 益生菌棉條干預(yù)之后的齲齒組和正常對(duì)照組物種差異

3 討論

目前，臨床上研究口腔微生態(tài)系統(tǒng)的方式包括牙菌斑、漱口水、唾液采集器等多種方法，但都存在一定的局限性。如唾液采集器或者使用漱口水采集唾液，由于受試者口腔暴露容易影響口腔微生態(tài)環(huán)境，且最終研究結(jié)果極易受唾液供者的口腔唾液分泌條件影響，因此無(wú)法客觀、準(zhǔn)確地反映真實(shí)的口腔微生態(tài)情況；牙菌斑的局部?jī)?nèi)環(huán)境及菌群的構(gòu)成較為穩(wěn)定，能更好地反映口腔的微生態(tài)情況，因此被廣泛應(yīng)用于臨床試驗(yàn)，但是牙菌斑的供給量較少，對(duì)提取技術(shù)的要求較高，大大局限了后續(xù)的進(jìn)一步研究。因此，目前亟需一種簡(jiǎn)易、穩(wěn)定且精確的提取并干預(yù)口腔微生態(tài)的方式。

口腔前庭溝過(guò)去常被作為口腔局麻常用的穿刺及手術(shù)切口部位[11]，目前鮮見(jiàn)研究報(bào)道其在口腔原生態(tài)提取及干預(yù)方面的應(yīng)用。本研究以棉條作為載體充分檢測(cè)并比較了樣本中的物種信息，確定了通過(guò)口腔前庭溝采取口腔菌液方法的優(yōu)勢(shì)。結(jié)果表明，棉條采集與常規(guī)方式采集的菌液中菌群組成相似，但前者的菌群豐度更高、均一度更好，并且具有更加豐富的短鏈脂肪酸含量。短鏈脂肪酸作為菌群發(fā)酵食物產(chǎn)生的最常見(jiàn)的代謝產(chǎn)物[12]，被廣泛應(yīng)用于微生物相關(guān)研究中。以乙酸和丙酸為代表的短鏈脂肪酸，不僅代表了菌群的生理活躍程度，而且在調(diào)節(jié)宿主代謝、免疫系統(tǒng)和細(xì)胞增殖等方面發(fā)揮了重要的作用[13-14]。研究結(jié)果中健康志愿者棉條提取唾液中的高濃度短鏈脂肪酸，不僅反映了該新型方法對(duì)口腔相關(guān)菌群的有效收集，更反映了宿主的健康口腔環(huán)境。

作為與口腔菌群最直接且密切相關(guān)的疾病，我們進(jìn)一步探索了該方法在提取齲齒患者口腔菌群特點(diǎn)信息的有效性。最近一項(xiàng)對(duì)齲齒兒童和健康兒童的口腔菌群進(jìn)行的宏基因組分析發(fā)現(xiàn)與健康兒童相比，齲齒兒童口腔菌群結(jié)構(gòu)明顯改變，其中普氏菌、衛(wèi)星沙特爾沃思氏菌、成雙厭氧球形菌等豐度顯著升高[15]。在此之前，格氏鏈球菌、血鏈球菌、變異鏈球菌等鏈球菌屬成員被廣泛認(rèn)為是致齲微生物，在齲齒患者中擁有較高的水平[16-17]，這與本研究利用棉條研究口腔菌群情況后得出的結(jié)論類似。本研究比較了棉條唾液提取條件下齲齒患者與正常對(duì)照組之間的口腔菌群組成情況，結(jié)果提示齲齒患者中普氏菌顯著升高，而鏈球菌屬在口腔中可測(cè)菌群中的占比也明顯升高。因此，本研究認(rèn)為，通過(guò)棉條提取的口腔菌液良好地傳遞了齲齒患者與健康者之間的口腔菌群差異信息。

益生菌作為目前常用的微生態(tài)制劑，可顯著調(diào)節(jié)口腔菌群的組成[18]。我們利用益生菌聯(lián)合棉條，制備益生菌棉條，延長(zhǎng)了益生菌在口腔中停留的時(shí)間，從而舉例說(shuō)明了口腔前庭溝這一特殊解剖部位在干預(yù)口腔原生態(tài)方面的應(yīng)用前景。相比于益生菌棉條干預(yù)之前，干預(yù)之后的口腔菌液在物種豐度、物種組成方面都發(fā)生了顯著的變化，而且齲齒患者和健康志愿者在變化趨勢(shì)方面也存在差異。但是，這種變化對(duì)宿主的影響是朝向怎樣的方向發(fā)展、這種變化的效應(yīng)大小以及這種影響的持續(xù)時(shí)間即長(zhǎng)期效應(yīng)尚需進(jìn)一步探討。

本研究表示，通過(guò)棉條獲取的菌液不僅可以有效反映口腔菌群的組成及功能，并且益生菌棉條可以顯著干預(yù)口腔微生態(tài)環(huán)境，從而說(shuō)明口腔前庭溝的利用是一種新穎的、可有效采集并顯著干預(yù)口腔原生態(tài)的方法，這對(duì)于發(fā)掘并推廣更簡(jiǎn)單且高效的口腔保健方式、進(jìn)一步探索口腔菌群在口腔乃至全身相關(guān)疾病中的機(jī)制具有現(xiàn)實(shí)意義。