王歡歡，劉媚娜，謝海嘯，賈愷琦，曾蔓霖，王明山

溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)中心 浙江省檢驗(yàn)診斷及轉(zhuǎn)化研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 溫州325015

遺傳性凝血因子XI（coagulation factor XI,FXI）缺陷癥是一種由FXI基因變異導(dǎo)致的罕見遺傳性出血性疾病[1]，由ROSENTHAL等[2]在1953年首次報(bào)道。患者臨床出血表現(xiàn)輕重不一，主要表現(xiàn)為創(chuàng)傷或手術(shù)后出血增多，女性可見月經(jīng)過多，少有明顯的自發(fā)性出血癥狀[3]。由于FXI活性水平高低與出血程度并無明顯相關(guān)性，因此當(dāng)前的實(shí)驗(yàn)室方法難以評(píng)估FXI缺陷患者的出血風(fēng)險(xiǎn)[4]。下消化道出血（lower gastrointestinal bleeding, LGIB）的定義為屈氏韌帶以遠(yuǎn)的腸道出血[5]，包括小腸出血和結(jié)直腸出血。LGIB臨床常見，占全部消化道出血的20%～30%[6]。本研究對(duì)一個(gè)由FXI基因無義變異導(dǎo)致的遺傳性凝血因子XI缺陷癥患者行內(nèi)鏡下直腸息肉摘除術(shù)后出現(xiàn)下消化道異常出血進(jìn)行臨床資料和基因變異分析，探討FXI基因變異與治療后下消化道異常出血的關(guān)系。

1 對(duì)象和方法

1.1 研究對(duì)象 選擇2021年8月于溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院消化內(nèi)科收治的1例內(nèi)鏡下直腸息肉摘除術(shù)后出現(xiàn)下消化道異常出血患者作為研究對(duì)象。調(diào)查患者及家系其他成員共3代5人，均無自發(fā)性出血傾向，家系遺傳圖譜見圖1。選取100名20～58歲的體檢健康者建立實(shí)驗(yàn)室凝血指標(biāo)參考范圍，其中男55例，女45例，無肝腎功能障礙及其他基礎(chǔ)疾病。本研究通過本院臨床研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（2021年倫審第17號(hào)），所有受試者均簽署知情同意書。

圖1 遺傳性FXI缺陷癥家系圖

1.2 儀器與材料

1.2.1 儀器：自動(dòng)血液凝固分析儀（法國Stago公司，型號(hào)：STA-R Max）、LifePro熱循環(huán)儀[賽默飛世爾科技（中國）有限公司，型號(hào)：TC-96/G/H（b）A]、基因測(cè)序儀（美國ABI公司，型號(hào)：3730XL）、酶標(biāo)儀（上海美谷分子儀器有限公司，型號(hào)：SpectraMax iD3）。

1.2.2 試劑：FXI活性（FXI activity, FXI:C）試劑由法國Stago公司配套提供（批號(hào)：255645），DNA提取試劑盒購自北京天根生化科技有限公司（批號(hào)：S7425），人凝血因子XI酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定試劑盒購自上海江萊生物科技有限公司（批號(hào)：JL42275）。

1.2.3 引物：根據(jù)FXI 基因序列（GenBank AY193837），采用Primer 5.0軟件設(shè)計(jì)覆蓋FXI基因所有外顯子區(qū)域及側(cè)翼序列的13對(duì)引物，由上海桑尼生物科技有限公司合成，見表1。

表1 FXI基因的引物序列及擴(kuò)增片段長(zhǎng)度

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集與處理：采集研究對(duì)象外周靜脈血2.7 mL，以0.109 mol/L枸櫞酸鈉1:9 抗凝，3 000 r/min離心10 min，上層乏血小板血漿用于凝血指標(biāo)的檢測(cè)，下層血細(xì)胞用于提取基因組DNA。

1.3.2 凝血指標(biāo)檢測(cè)：凝血酶原時(shí)間（prothrombin time, PT）、活化部分凝血活酶時(shí)間（activated partial thromboplastin time, APTT）、纖維蛋白原（fibrinogen, FIB）、凝血因子VIII活性（factor VIII activity, FVIII:C）、凝血因子IX活性（FIX:C）、凝血因子XI活性（FXI:C）、凝血因子XII活性（FXII:C）和狼瘡抗凝物（lupus anticoagulant, LA）等凝血指標(biāo)均在自動(dòng)血液凝固分析儀上進(jìn)行測(cè)定；FXI:Ag（FXI antigen, FXI:Ag）采用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法。所有操作步驟均嚴(yán)格按照試劑說明書進(jìn)行。

1.3.3 DNA提取及PCR擴(kuò)增：采用DNA提取試劑盒提取患者及其家系成員的外周血基因組DNA。PCR反應(yīng)體系包括2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，雙蒸水8.0 μL，DNA模塊2.0 μL，10 μmol/L上下游引物各1.0 μL。用LifePro熱循環(huán)儀擴(kuò)增，反應(yīng)條件如下：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共30個(gè)循環(huán)，再72 ℃延伸10 min，4 ℃保存[7]。PCR產(chǎn)物送上海桑尼生物科技有限公司進(jìn)行電泳和純化，然后使用基因測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序。

1.3.4 測(cè)序分析：通過Chromas軟件與美國NCBI基因庫所公布的FXI基因序列進(jìn)行比對(duì)，分析測(cè)序峰圖，發(fā)現(xiàn)變異位點(diǎn)后檢測(cè)家系成員相應(yīng)的變異位點(diǎn)區(qū)域。

1.3.5 致病性及蛋白模型分析：根據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(huì)（American College of Medical Genetics and Genomics, ACMG）遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)和指南，判斷所發(fā)現(xiàn)的變異位點(diǎn)致病等級(jí)。用PyMol軟件分析FXI基因變異前后FXI蛋白結(jié)構(gòu)的改變。

2 結(jié)果

2.1 臨床資料 患者，女，33歲，漢族，因“直腸息肉摘除術(shù)后3 d，血便2 d”入院。既往無肝腎疾病病史，也無明顯自發(fā)性出血傾向，自述月經(jīng)規(guī)律，經(jīng)量正常。入院當(dāng)日實(shí)驗(yàn)室檢查：白細(xì)胞4.63×109/L、血紅蛋白109g/L、血小板264×109/L；糞隱血試驗(yàn)（+）；PT：14.7 s、APTT：50.9 s；肝功能、腎功能及腫瘤標(biāo)志物均正常。全腹CT提示：直腸致密影。入院后予禁食，同時(shí)予止血、補(bǔ)充血容量等對(duì)癥治療。次日直腸核磁共振（平掃+增強(qiáng)）顯示：直腸中段局部結(jié)節(jié)伴強(qiáng)化，提示出血可能；腸鏡顯示：直腸距肛門約5 cm可見一息肉樣隆起，表面充血、糜爛，見鈦夾；超聲顯示：病灶切面約34 mm×7 mm，內(nèi)部似有低回聲細(xì)腔，位于黏膜及黏膜下層，見圖2。實(shí)驗(yàn)室進(jìn)一步檢查發(fā)現(xiàn)FXI:C為53%（參考范圍：82%～118%），其他內(nèi)源性途徑凝血因子活性均在參考范圍內(nèi)，考慮出血可能與FXI:C降低相關(guān)。后予輸注新鮮冰凍血漿4 U，患者出血癥狀好轉(zhuǎn)，病情平穩(wěn)后出院。

圖2 患者腸鏡（A）和超聲（B）檢查結(jié)果

2.2 患者及其家系成員實(shí)驗(yàn)室表型檢測(cè)結(jié)果 患者及其父親APTT延長(zhǎng)，F(xiàn)XI:C和FXI:Ag降低至正常對(duì)照的一半左右；其母親、丈夫、兒子APTT正常，家系成員的其他凝血指標(biāo)均無明顯異常（見表2）。

2.3 患者及其家系成員基因分析結(jié)果 患者及其父親的FXI基因第8號(hào)外顯子均存在c.841C＞T雜合無義變異（p.Gln281*），其余家庭成員該位點(diǎn)為野生型（見表2和圖3）。

表2 患者及其家系成員主要實(shí)驗(yàn)表型及基因檢測(cè)結(jié)果

圖3 FXI基因第8外顯子測(cè)序結(jié)果

2.4 致病性及蛋白模型分析結(jié)果 根據(jù)ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)和指南可知，無義變異導(dǎo)致基因產(chǎn)物缺失而破壞基因功能為極強(qiáng)的致病性證據(jù)，且查閱國內(nèi)外文獻(xiàn)，已有該變異位點(diǎn)致病的相關(guān)報(bào)道[8-9]。蛋白模型分析顯示，發(fā)生p.Gln281*變異導(dǎo)致蘋果樣結(jié)構(gòu)域（apple domains, AP）3結(jié)構(gòu)不完整且AP4和絲氨酸蛋白酶域（serine protease, SP）均缺失，產(chǎn)生只有280個(gè)氨基酸的截短蛋白（見圖4）。

圖4 FXI蛋白質(zhì)模型圖

3 討論

遺傳性FXI缺陷癥是一種由FXI基因變異導(dǎo)致血漿中FXI水平降低或功能缺陷而引起的罕見出血性疾病（rare bleeding disorders, RBD），通常以常染色體隱性方式遺傳，也有部分表現(xiàn)為常染色體顯性遺傳[10]。FXI基因變異雜合子FXI:C水平通常為20%～60%，純合子或復(fù)合雜合子FXI:C水平常低于20%也被定義為嚴(yán)重FXI缺乏[11]。遺傳性FXI缺陷癥患者很少發(fā)生嚴(yán)重出血[12]，即使是嚴(yán)重FXI缺乏患者自發(fā)性出血也并不常見，但在創(chuàng)傷、手術(shù)或產(chǎn)后等這些因素的共同作用下可能導(dǎo)致異常出血。與骨科手術(shù)或胃腸道手術(shù)相比，牙科、口咽或泌尿生殖器手術(shù)后出血的可能性更大[13]。據(jù)報(bào)道[14]，部分FXI基因變異雜合子也可能有出血過多的風(fēng)險(xiǎn)。由于個(gè)體出血風(fēng)險(xiǎn)與FXI:C水平之間缺乏相關(guān)性，這對(duì)遺傳性FXI缺陷癥患者的治療也提出了重大的挑戰(zhàn)。

本研究中的患者為一名33歲女性，平素?zé)o月經(jīng)過多，也無自發(fā)性出血傾向。因在當(dāng)?shù)蒯t(yī)院行無痛胃腸鏡檢查時(shí)發(fā)現(xiàn)直腸息肉，立即予內(nèi)鏡下直腸息肉摘除，術(shù)前未行凝血功能篩查。術(shù)后1 d患者出現(xiàn)腹痛伴血便，至本院急診就診，查腹部CT示：直腸致密影，APTT：50.9 s，結(jié)合患者病史及CT結(jié)果考慮LGIB，予止血、補(bǔ)液等對(duì)癥治療后出血仍未控制。進(jìn)一步檢查發(fā)現(xiàn)該患者的FXI:C為53%，排除繼發(fā)性因素及家系調(diào)查后[15]，考慮為遺傳性FXI缺陷癥，予輸新鮮冰凍血漿4 U后出血情況好轉(zhuǎn)。本研究提取了患者及其家系成員的外周血DNA，進(jìn)行PCR擴(kuò)增及測(cè)序，發(fā)現(xiàn)患者及其父親的FXI基因第8號(hào)外顯子均存在c.841C＞T雜合無義變異（p.Gln281*），測(cè)序結(jié)果與實(shí)驗(yàn)室表型相符。

FXI蛋白是由位于4號(hào)染色體（4q35）長(zhǎng)臂端的FXI基因編碼，主要在肝細(xì)胞中合成的一種絲氨酸蛋白酶原，血漿濃度約為30 nmol/L[16]。與其他的凝血因子不同，它是由兩個(gè)相同亞基通過分子間二硫鍵（p.Cys321-p.Cys321）連接而成的同源二聚體。每個(gè)亞基由607個(gè)氨基酸組成，包括4個(gè)重復(fù)序列（也稱為AP）構(gòu)成的重鏈及催化結(jié)構(gòu)域（也稱為SP）構(gòu)成的輕鏈。蘋果樣結(jié)構(gòu)域上有多種分子的結(jié)合位點(diǎn)：AP1上有凝血酶結(jié)合位點(diǎn)；AP1、AP2上有高分子量激肽原（high-molecular-weight kininogen,HMWK）結(jié)合位點(diǎn)；AP3上有肝素、FIX、血小板膜糖蛋白Ib結(jié)合位點(diǎn)；AP4上有活化FXII的結(jié)合位點(diǎn)[17]。另外，F(xiàn)XI通過凝血酶或活化FXII裂解自身p.Arg369-p.Ile370之間的肽鍵而被激活，從而發(fā)揮止血功能。截至2021年4月，人類基因變異數(shù)據(jù)庫（http://www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）已收錄FXI基因變異280余種，其中錯(cuò)義/無義變異約占76%，其他變異還包括插入、缺失及剪切變異，變異分布于FXI基因的各個(gè)區(qū)域，相對(duì)集中于編碼催化結(jié)構(gòu)域的區(qū)域[18]。

本研究中的c.8 4 1 C ＞T 雜合無義變異（p.Gln281*）位于AP3結(jié)構(gòu)域，SHAO等[19]的研究提出p.Gln281*可能為中國人群中遺傳性FXI缺陷癥的變異熱點(diǎn)。周劍品[20]對(duì)該變異位點(diǎn)分析表明p.Gln281在同源物種間中度保守，為有害變異。另外，ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)和指南也為p.Gln281*雜合無義變異為致病變異提供了依據(jù)。蛋白模型分析顯示，發(fā)生p.Gln281*變異，將導(dǎo)致AP3結(jié)構(gòu)不完整以及AP4和SP結(jié)構(gòu)消失，從而直接影響FXI與多種分子的結(jié)合并喪失本身的催化功能。此外，截短蛋白的產(chǎn)生使其在細(xì)胞內(nèi)非常容易被降解。另有報(bào)道[21]，無義變異產(chǎn)生的含有提前終止密碼子的mRNA可被一種稱之為無義介導(dǎo)衰變的mRNA監(jiān)視系統(tǒng)迅速降解，使得循環(huán)中FXI減少。因此，c.841C＞T雜合無義變異（p.Gln281*）是患者FXI:C水平降低的主要原因。機(jī)體內(nèi)凝血過程通常分為啟動(dòng)階段和維持階段，啟動(dòng)階段由血管內(nèi)皮損傷釋放組織因子（tissue factor,TF）激活FVII形成TF-活化FVII（activated FVII,FVIIa）-Ca2+復(fù)合物開始，然后激活FX、FIX。此時(shí)機(jī)體的組織因子途徑抑制物（tissue factor pathway inhibitor, TFPI）很快將該復(fù)合物滅活，之后的凝血維持階段主要靠活化FXI（activated FXI, FXIa）激活FIX。因此，該患者出現(xiàn)異常出血癥狀，可能與FXI缺陷導(dǎo)致維持階段凝血障礙有關(guān)，具體的致病機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

綜上所述，本研究通過對(duì)一例內(nèi)鏡下直腸息肉摘除術(shù)后異常出血患者進(jìn)行病因分析，發(fā)現(xiàn)了一個(gè)FXI基因c.841C＞T雜合無義變異，該變異不僅與患者及其家系成員FXI水平降低有關(guān)，而且可能也是該患者出現(xiàn)術(shù)后異常出血的主要原因。因此，建議臨床醫(yī)師在對(duì)患者行有創(chuàng)操作前，檢測(cè)患者的凝血功能，判斷是否存在凝血功能異常。如有異常，應(yīng)當(dāng)盡量明確異常原因以降低操作后患者異常出血的風(fēng)險(xiǎn)。對(duì)于排除獲得性因素后仍無法明確病因的患者，可進(jìn)一步檢測(cè)其血漿中各凝血因子活性水平，從而為明確病因提供線索。