胡海玥，石可歆，李海嶺，李子來，袁哲，周彩瑩，楊晨，3*，汪建明*

（1.天津科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，天津 300457；2.山東天驕生物技術(shù)有限公司，山東 菏澤 274108；3.優(yōu)滋福（天津）食品科技有限公司，天津 300457）

隨著現(xiàn)代食品工業(yè)科學(xué)技術(shù)的不斷更新與發(fā)展，可食用膜作為一種具有可降解性能的環(huán)保新型食品包裝出現(xiàn)在人們的視野中。同時，為了增加其柔韌性并降低脆性，常使用甘油、山梨糖醇等作為增塑劑，降低聚合物分子間的內(nèi)聚力，增加聚合物鏈的流動性[1]。將各類可食用的材料應(yīng)用于食物保鮮方面具有非常悠久的歷史，比如將食用蠟涂抹在食品表面用于保鮮，但保鮮效果不佳[2]。

大豆分離蛋白（soybean protein isolate，SPI）是一種常見的食品添加劑，多數(shù)以低溫脫溶大豆粕為原料生產(chǎn)，其蛋白質(zhì)含量在90%以上，蛋白質(zhì)內(nèi)部存在氫鍵、肽鍵、疏水鍵、二硫鍵、離子鍵等化學(xué)結(jié)構(gòu)，具有一定的穩(wěn)定性，并含有人體必需氨基酸[3-4]。SPI來源廣泛，具有良好的成膜能力[5-6]。但是單一的SPI膜存在機(jī)械強(qiáng)度不足、功能性較差[7]等缺點，從而導(dǎo)致其應(yīng)用范圍受到限制。Yan等[8]研究SPI與多酚結(jié)合物的形成對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和乳化性能的影響，結(jié)果表明表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）的加入改變了SPI多肽鏈的二級結(jié)構(gòu)和三級構(gòu)象，可見β-鏈含量減少，α-螺旋和無規(guī)則卷曲含量增加。SPI與EGCG以質(zhì)量比3∶200共價結(jié)合后，復(fù)合物表現(xiàn)出最佳的溶解性和乳化性能。陽暉[7]通過探究仙草膠對可食性蛋白膜功能特性的影響及作用機(jī)理，發(fā)現(xiàn)仙草膠和蛋白質(zhì)分子之間存在著相互作用，如共價交聯(lián)和分子間氫鍵作用，添加適量仙草膠會使蛋白膜中無序結(jié)構(gòu)減少，而有序結(jié)構(gòu)增加；而添加過量仙草膠會破壞膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致無序結(jié)構(gòu)增加。因此，以SPI為成膜基質(zhì)，添加其他具有功能性的物質(zhì)，能夠提高膜的物理-機(jī)械強(qiáng)度和增加功能性。亞麻籽膠（faxseed gum，F(xiàn)G）是一種綠色安全的食品添加劑，由國家綠色食品發(fā)展中心認(rèn)定[9-10]，在食品工業(yè)中，因其具有良好的增稠性、乳化性和乳化穩(wěn)定性[11]，被廣泛用作增稠劑、乳化劑和穩(wěn)定劑[12-13]。一般來說，在食品配方中添加增稠劑會改變其流變特性，通過增加增稠劑的濃度，不僅會增加流體的剪切黏度，還會增加流體的拉伸黏度[14]。Jiang等[15]利用FG和魔芋葡甘聚糖制備新型復(fù)合凝膠的水膠體，研究結(jié)果表明，復(fù)合凝膠的微觀結(jié)構(gòu)變得致密，孔徑變小；FG和魔芋葡甘聚糖分子鏈之間表現(xiàn)出強(qiáng)烈的相互作用和協(xié)同效應(yīng)。

本研究以SPI作為成膜基質(zhì)，探究不同F(xiàn)G添加量對SPI膜的作用機(jī)理，將SPI與FG以不同質(zhì)量比復(fù)配，以甘油為增塑劑制備復(fù)合膜，對復(fù)合膜的橫截面微觀結(jié)構(gòu)、二級結(jié)構(gòu)、熱穩(wěn)定性進(jìn)行分析，并對成膜液的流變特性、粒徑進(jìn)行測定。本研究旨在為今后研究多糖與SPI的作用機(jī)制提供一定的參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

SPI（98%，食品級）：山東萬得福生物科技有限公司；FG（99%，食品級）：浙江一諾生物科技有限公司；甘油（食品級）：天津津東天正精細(xì)化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉（分析純）：天津市津科精細(xì)化工研究所；溴化鈉（分析純）：天津市華東試劑廠。

1.2 儀器與設(shè)備

HJ-6A恒溫磁力攪拌器：上海易友儀器有限公司；GZX-9030MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱：上海博旭醫(yī)療生物儀器股份有限公司；D-500高剪切分散均質(zhì)機(jī)：德國維根技術(shù)（北京）有限公司；FGG1800通風(fēng)櫥：武漢貝科科技股份有限公司；NICOLET IS50傅里葉變換紅外光譜儀：德國Thermo Scientific公司；SU1510掃描電子顯微鏡：日本Hitachi公司；Q50熱重分析儀：美國TA Instruments有限公司；Bettersize2600激光粒度分析儀：黑龍江丹東百特儀器有限公司；MARS60動態(tài)流變儀：德國HAAKE有限公司。

1.3 FG/SPI成膜液及復(fù)合膜的制備

準(zhǔn)確稱取SPI粉末5 g，溶于100 mL蒸餾水中，磁力攪拌10 min至SPI完全溶解，調(diào)節(jié)pH值至10，加入2 mL甘油，放入80℃水浴鍋攪拌加熱30 min，將FG按照 0%、1%、2%、3%、4%、5%的添加量與 SPI充分混合（分別用 FG-0、FG-1、FG-2、FG-3、FG-4、FG-5 表示），繼續(xù)加熱30 min，然后均質(zhì)5 min，冷卻至室溫（25℃），靜置30 min，獲得成膜液，備用。

將70 mL成膜液倒入20 cm×20 cm的亞克力平板上，鋪勻，放入通風(fēng)櫥內(nèi)干燥24 h后取出揭膜。將膜放入裝有飽和NaBr溶液的干燥器中，平衡2 d后進(jìn)行測定。

1.4 成膜液流變特性測定

參考 Murillo-Martínez等[16]的方法，并稍作修改。取一定量的成膜液滴于動態(tài)流變儀測試臺平行板上，選用CP50錐板，將平行板的間距設(shè)定為1 mm，在25℃下進(jìn)行試驗。在靜態(tài)流變性能測定中，設(shè)定模式為控制速率，將剪切速率設(shè)置為0.01 s-1～100 s-1。測定動態(tài)流變性能時，先對成膜液進(jìn)行應(yīng)變掃描，確定成膜液的線性黏彈性區(qū)，頻率為10 Hz～0.1 Hz。設(shè)定模式為控制應(yīng)變，測定成膜液的儲能模量（G′）和損耗模量（G″）。

1.5 成膜液粒徑測定

參考Zuo等[17]的方法，用激光粒度分析儀測定分析成膜液的粒徑分布。分散相和水的折射率分別為1.570和1.333，測試溫度為25℃。在分析前用蒸餾水將樣品稀釋至1/1 000。

1.6 膜橫截面的微觀結(jié)構(gòu)觀察

應(yīng)用掃描電子顯微鏡觀察膜的橫截斷面，將樣品用液氮進(jìn)行淬斷，用導(dǎo)電膠將膜垂直固定于載物臺上，噴金，將斷面放大1 000倍觀察。

1.7 膜的紅外光譜檢測

應(yīng)用傅里葉變換紅外光譜儀采集蛋白膜在4 000 cm-1～400 cm-1的紅外吸收光譜，應(yīng)用衰減全反射附件，分辨率為4 cm-1，掃描次數(shù)為32[18]。

1.8 膜的熱失重分析

參考雷會寧[19]的方法，應(yīng)用熱重分析儀測定膜的熱失重曲線，稱取5 mg～8 mg膜樣品，以氮?dú)鉃檩d氣，測定溫度為0℃～600℃，升溫速率為20℃/min。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析方法

采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行方差分析和差異顯著性分析。試驗所得數(shù)據(jù)利用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)整理，通過Origin 2018軟件對試驗數(shù)據(jù)進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 FG添加量對成膜液靜態(tài)流變特性的影響

成膜液的流變學(xué)行為與其性質(zhì)和結(jié)構(gòu)有著很強(qiáng)的關(guān)聯(lián)性[7]。如果成膜液的黏度過高，可能會導(dǎo)致成膜時膜內(nèi)氣泡難以消除，但如果黏度過低，成膜時膜的厚度會較薄，導(dǎo)致性能的降低。不同F(xiàn)G添加量對成膜液表觀黏度的影響如圖1所示。

圖1 不同F(xiàn)G添加量對成膜液表觀黏度的影響Fig.1 The effect of different FG addition amount on the apparent viscosity of film-forming liquid

所有樣品在剪切速率為0.1 s-1～100 s-1時均表現(xiàn)出剪切稀化現(xiàn)象，屬于假塑性流體（非牛頓流體）。這種現(xiàn)象主要是由于成膜液內(nèi)部結(jié)構(gòu)隨著剪切速率增加而被破壞，導(dǎo)致黏度降低[20]。由圖1可知，與FG-0成膜液相比，F(xiàn)G-1、FG-2和FG-3成膜液的表觀黏度略有下降，可能是由于FG-0成膜液表現(xiàn)出了弱凝膠狀態(tài)[15]，而FG的添加，阻礙了SPI自身的作用，使空間位阻效應(yīng)發(fā)生，導(dǎo)致這種弱凝膠狀態(tài)被破壞，從而造成成膜液表觀黏度的下降[21]。陽暉[7]在仙草膠/SPI成膜液中也發(fā)現(xiàn)添加少量的仙草膠會使蛋白質(zhì)與仙草膠成膜液表觀黏度降低，推測是仙草膠會引起蛋白質(zhì)交聯(lián)，使有效分子體積增大。在制備成膜液的過程中，添加FG后繼續(xù)加熱30 min，這時，F(xiàn)G和SPI易發(fā)生美拉德反應(yīng)[20]，使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)，增大其分子的有效體積[22]，也會使成膜液的表觀黏度降低。而FG-4和FG-5成膜液的表觀黏度與FG-0成膜液相比有了提升，原因可能是過量的FG未能與SPI作用。根據(jù)Liu等[14]的研究結(jié)果，F(xiàn)G是一種陰離子雜多糖，D-木糖、L-阿拉伯糖、D-葡萄糖、L-半乳糖、D-半乳糖醛酸和L-鼠李糖是FG的主要成分。FG作為一種水膠體，具有明顯的保水能力和流變特性，以及弱凝膠性能，可以與水反應(yīng)，使更多的水分子被固定，從而導(dǎo)致表觀黏度的增加。

2.2 FG添加量對成膜液動態(tài)流變特性的影響

動態(tài)流變學(xué)可以反映各種組分之間的相互作用和結(jié)構(gòu)特征[23]。因此，應(yīng)用小幅度振蕩剪切，研究FG添加量對成膜液動態(tài)流變特性的影響。圖2為FG添加量對成膜液G′和G″的影響。

圖2 不同F(xiàn)G添加量對成膜液G′和G″的影響Fig.2 The effect of different FG addition amount on the G′and G″of film-forming liquid

由圖2可知，所有成膜液的儲能模量（G′）和損耗模量（G″）均隨著頻率升高而逐漸增大，因此所有的成膜液都可以被認(rèn)為是彈性弱凝膠。在0.1 Hz～10 Hz頻率范圍內(nèi)，所有成膜液的G′都大于其相應(yīng)的G″，表示成膜液的不可逆變性程度小于可逆變性程度，即彈性行為大于黏性行為。這種現(xiàn)象可能是由于分子鏈有足夠的時間在低頻下解開和重新排列[15]，表明成膜液是黏性流體。因為纏結(jié)點在臨時交聯(lián)連接區(qū)中發(fā)揮作用，所以分子鏈在高頻下解開的時間較短[24]。但是由于在膠體懸浮液中不存在糾纏效應(yīng)，這意味著FG和SPI具有良好的相容性，這兩個組分之間具有緊密的交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)[25]。當(dāng)FG添加量為1%～3%時，F(xiàn)G中的親水基團(tuán)[13]減弱了SPI分子自身之間的相互作用，減少凝集。Guerrero等[26]研究發(fā)現(xiàn)，添加少量的多糖會導(dǎo)致蛋白質(zhì)分子之間的作用被減弱。而FG-4和FG-5成膜液的G′和G″高于FG-0，F(xiàn)G有很強(qiáng)的吸水性，其水溶液具有較高的黏度，該現(xiàn)象可能與過量的未與SPI反應(yīng)的FG有關(guān)，即過量的FG抑制了SPI分子之間的相互作用[27]，影響SPI的凝膠結(jié)構(gòu)，從而增大成膜液的G′和G″值。

2.3 FG添加量對成膜液粒徑的影響

動態(tài)光散射可以在一定程度上反映FG對成膜液中粒徑分布的影響。圖3是不同F(xiàn)G添加量對復(fù)合膜成膜液粒徑的影響。

圖3 FG添加量對成膜液粒徑的影響Fig.3 The effect of FG addition amount on the particle size of the film-forming liquid

由圖3可知，不同成膜液的粒徑分布均呈現(xiàn)雙峰狀態(tài)。FG-0成膜液的粒徑為14.86 μm，隨著FG添加量的增大，成膜液的平均體積也隨之發(fā)生變化，在添加量為0%～2%時，粒徑隨FG添加量增加而增大，F(xiàn)G-1粒徑為 33.47 μm，F(xiàn)G-2粒徑為 55.62 μm，F(xiàn)G-3粒徑為58.38 μm。這可能是因為FG與SPI相互作用并聚集[28]，致使粒徑增大。當(dāng)FG添加量大于3%時，成膜液的粒徑增加量變大，F(xiàn)G-4的粒徑為75.67 μm，F(xiàn)G-5的粒徑下降至68.44 μm，這種現(xiàn)象可能是由于大量的FG不能與蛋白質(zhì)分子交聯(lián)，從而導(dǎo)致FG自身聚集，使成膜液的粒徑增大，從而證明了流變學(xué)中當(dāng)FG添加量大于3%時的成膜液黏度增大這一推測。所有添加FG的成膜液的粒徑均大于單一SPI成膜液。

2.4 FG添加量對膜斷面微觀結(jié)構(gòu)的影響

膜斷面的微觀結(jié)構(gòu)可以在一定程度上反映膜是否具有均一性和致密性[29]。FG/SPI復(fù)合膜橫截斷面微觀結(jié)構(gòu)如圖4所示。

圖4 FG/SPI復(fù)合膜斷面掃描電鏡圖（1 000×）Fig.4 Scanning electron micrograph of cross-section of FG/SPI composite film（1 000×）

由圖4可知，所有膜的橫截斷面均表現(xiàn)出了較為緊密的狀態(tài)，不同的FG添加量對其膜斷面的紋理有一定的影響。FG-3的斷面最為平整，其余FG添加量的膜均存在一定程度上呈現(xiàn)鱗片狀或條紋的紋理，但均勻致密，沒有出現(xiàn)FG與SPI不融合的情況，說明成膜液中的各組分之間相容性較好。單一SPI膜（FG-0）、FG-1和FG-2的橫截面有一定的褶皺，原因可能是FG添加量不足，大多數(shù)蛋白質(zhì)分子未與FG發(fā)生交聯(lián)，蛋白質(zhì)分子之間形成了作用力，出現(xiàn)了聚集的趨勢。

FG-3的橫截斷面平整，無明顯紋理或突起，這可能是因為當(dāng)FG添加量為3%時，減弱了SPI分子之間的相互作用。當(dāng)FG添加量大于3%時，即FG-4和FG-5的復(fù)合膜橫截面也出現(xiàn)了褶皺，根據(jù)對成膜液流變特性的測定，發(fā)現(xiàn)FG-4和FG-5的成膜液黏度較高，導(dǎo)致其成膜比FG添加量為0%～3%的成膜液要困難，不容易形成均一穩(wěn)定的體系，這個現(xiàn)象與張盼[30]的研究結(jié)論相似。也可能是FG之間的作用使其出現(xiàn)了團(tuán)聚的現(xiàn)象，從而使膜的橫截面變得不均勻，影響其宏觀性質(zhì)。

2.5 FG添加量對膜二級結(jié)構(gòu)的影響

采用傅里葉變換紅外光譜分析研究FG添加量對膜二級結(jié)構(gòu)的影響，結(jié)果見圖5。

圖5 FG添加量對復(fù)合膜二級結(jié)構(gòu)的影響Fig.5 The effect of FG addition amount on the secondary structure of the composite film

所有膜樣品在1 031 cm-1～1 039 cm-1處都顯示出一個特征性吸收峰，這是在制作膜過程中所添加的甘油的特征峰[17]。所有膜樣品在酰胺I帶和酰胺Ⅱ帶處均顯示特征峰。3 270 cm-1～3 273 cm-1主要反映了分子間羥基的伸縮振動變化[31]。2 923 cm-1～2 924 cm-1代表的是-CH2拉伸。添加了FG后，3 273 cm-1處峰位置和強(qiáng)度的細(xì)微變化表明了氫鍵的產(chǎn)生[32]，證明了SPI和FG之間存在氫鍵的相互作用。1 630 cm-1～1 650 cm-1代表的是C=N伸縮振動峰，這里的形狀也發(fā)生了細(xì)微的改變，而這種改變在FG-2時最大，代表有一定的美拉德反應(yīng)在FG和SPI之間產(chǎn)生，從而導(dǎo)致結(jié)構(gòu)的改變。由此可得，F(xiàn)G對SPI膜的化學(xué)結(jié)構(gòu)有一定的影響?；瘜W(xué)結(jié)構(gòu)的變化，可以引起膜宏觀性質(zhì)的改變，在對膜的橫截面微觀結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察時發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)G-3的膜橫截面相較其他膜而言較為均一致密，也與氫鍵的產(chǎn)生有關(guān)[33]。

2.6 FG添加量對膜熱穩(wěn)定性的影響

測定材料的熱失重分解溫度可以判斷其熱穩(wěn)定性[18]。FG 添加量對復(fù)合膜熱重（thermal gravimetry，TG）和差熱重（differential thermal gravimetry，DTG）曲線的影響如圖6所示。

圖6 FG添加量對復(fù)合膜TG和DTG曲線的影響Fig.6 The effect of FG addition amount on the TG and DTG curves of composite film

由圖6可知，所有膜均經(jīng)歷了3個階段的熱損失。25℃至100℃為第一個熱降解階段，這個階段的質(zhì)量損失主要是因為膜中的水分蒸發(fā)。100℃至250℃為第二個熱降解階段，此階段主要為增塑劑甘油的蒸發(fā)；250℃以上為第三個熱降解階段，此階段為蛋白質(zhì)和FG的損失階段。

熱失重分解溫度的最高點，可以在一定程度上代表膜的耐高溫性能[34]。FG添加量為0%時，即FG-0，其熱失重分解溫度最高點為285.00℃；隨著FG添加量的增大，復(fù)合膜的最高熱失重分解溫度呈現(xiàn)先上升（FG-1為 310.36℃，F(xiàn)G-2為 312.65℃，F(xiàn)G-3為317.84℃）后下降（FG-4為 298.38℃，F(xiàn)G-5為297.87℃）的趨勢。但添加了FG的復(fù)合膜的耐高溫性能均優(yōu)于單一的SPI膜。當(dāng)FG添加量為4%和5%時，最高熱失重分解溫度周圍均有與之相近的峰，這可能代表的是未與SPI結(jié)合的FG的分解溫度峰。

3 結(jié)論

本文探究了不同F(xiàn)G添加量（0%～5%）對SPI膜的作用機(jī)理，通過對成膜液特性進(jìn)行探究，發(fā)現(xiàn)所有成膜液均屬于假塑性流體，彈性行為大于黏性行為，說明FG與SPI具有良好的相容性，具有較為緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，添加了FG的復(fù)合膜的熱穩(wěn)定性能均較單一的SPI膜有了提升，最高熱失重分解溫度從FG-0的285.00℃，提升至FG-3的317.84℃。粒徑結(jié)果顯示，F(xiàn)G與SPI可以產(chǎn)生聚集體。但是當(dāng)添加量為4%和5%時，未能與SPI分子發(fā)生反應(yīng)的FG阻礙SPI分子之間的相互作用，導(dǎo)致膜的斷面重新出現(xiàn)紋理，最高熱失重分解溫度下降，化學(xué)反應(yīng)減弱。掃描電鏡分析表明，所有膜的斷面均為緊密的狀態(tài)，當(dāng)FG添加量為3%時，復(fù)合膜的斷面無明顯紋理或突起。通過紅外光譜分析，F(xiàn)G可以與SPI產(chǎn)生一定的氫鍵相互作用，從而提升膜的各種性能。本研究探究了FG對SPI成膜液以及復(fù)合膜的影響，可為今后深入研究FG對蛋白質(zhì)成膜特性影響提供一定的參考。