張堯，Nyasha Makaza，呂城枝，孫娟，宋新杰，Sabir Z Nishanbaev，吳元鋒*，毛建衛(wèi)

（1.浙江科技學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，浙江 杭州 310023；2.浙江省農(nóng)業(yè)生物資源生化制造協(xié)同創(chuàng)新中心（2011協(xié)同創(chuàng)新中心），浙江 杭州 310023；3.烏茲別克斯坦科學(xué)院植物化學(xué)研究所，烏茲別克斯坦 塔什干 100170）

現(xiàn)代流行病學(xué)研究表明，經(jīng)常食用西蘭花、甘藍(lán)、花菜、羽衣甘藍(lán)、蘿卜等十字花科蔬菜可有效降低癌癥、心血管疾病、糖尿病、阿茲海默癥等疾病的發(fā)生率。這是由于這些蔬菜含有豐富的抗壞血酸、膳食纖維、黃酮、類胡蘿卜素、硫代葡萄糖苷等活性成分[1-2]。硫代葡萄糖苷是一類含硫的次生代謝產(chǎn)物，基于衍生氨基酸的差異可將其分為脂肪族、芳香族和吲哚族硫苷三類[3]。當(dāng)十字花科蔬菜被切割或啃食時(shí)，細(xì)胞中儲(chǔ)存的內(nèi)源性黑芥子酶將硫代葡萄糖苷水解為異硫氰酸酯（isothiocyanate，ITC）。但在 Fe2+或上皮硫特異蛋白（epithiospecifier protein，ESP）催化作用下，會(huì)轉(zhuǎn)化為腈類物質(zhì)[4]（圖1）。

圖1 黑芥子酶對(duì)硫代葡萄糖苷的水解作用Fig.1 The hydrolysis effects of myrosinase on glucosinolate

研究表明，ITC具有抑制I型酶、激活I(lǐng)I型酶、激活Keap1-Nrf2-ARE通路等多種活性，可顯著降低肝癌、胃癌、肺癌、乳腺癌、宮頸癌等癌癥的發(fā)生率。同時(shí)其還具有抗氧化、提高免疫力、抗氧化等多種功能[1，5-6]。常見的脂肪族ITC包括蘿卜硫素（又名萊菔硫烷，sulforaphane，SF）、萊菔素（sulforaphene，SFE）、芝麻菜素（erucin，ER）、庭薺素（alyssin）、3-甲基亞磺酰丙基異硫氰酸酯（iberin）、3-（甲硫基）丙基異硫氰酸酯（iberverin）等，芳香族ITC主要有異硫氰酸苯甲酯（phenyl benzyl isothiocyanate，BITC）、異硫氰酸苯乙酯（phenyl ethyl isothiocyanate，PEITC）等[1，3，7]。在這些 ITC 中，SF 活性最強(qiáng)[8]，SFE、ER、PEITC 等也具有較強(qiáng)的活性[9-12]。

目前對(duì)ITC已有一定研究，主要集中于提取工藝的優(yōu)化[13-17]。程立等[18]使用純化并固定化后的黑芥子酶生產(chǎn)SFE，使底物轉(zhuǎn)化率提高2.7～8.0倍。但關(guān)于提取劑添加方式的研究尚未見報(bào)道。提取ITC的傳統(tǒng)方法是先酶解后提取（hydrolysis followed by extraction，HFE），即先加入緩沖液，使硫代葡萄糖苷酶解為ITC，再用有機(jī)溶劑提取[19]。本文采用同時(shí)加入緩沖液和有機(jī)溶劑，即酶解和提取同時(shí)進(jìn)行（simultaneous hydrolysis and extraction，SHE）的方式提取ITC，縮短了提取工藝。進(jìn)而比較不同提取方式（SHE和HFE）對(duì)6種常見的十字花科蔬菜（蘿卜、芥菜、榨菜、甘藍(lán)、花菜和西蘭花）種子中ITC種類和含量的影響，以期從蔬菜中獲得高含量和高活性的ITC。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

石油醚、乙酸乙酯、甲醇、氯化鈉、無水硫酸鈉、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、磷酸鉀、1，2-苯二硫醇乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）（均為分析純）：上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；NAD（P）H:醌氧化還原酶 1[NAD（P）H:quinone oxidoreductase 1，NQO1]酶活性檢測(cè)試劑盒：美國Sigma公司；小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16、1640培養(yǎng)液、胎牛血清：杭州諾揚(yáng)生物有限公司；胰蛋白酶、青霉素-鏈霉素溶液：上海生工生物有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

RE-200型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海亞榮生化儀器廠；高速冷凍離心機(jī)：美國Beckman公司；SCIENTZ-II D超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：寧波新芝生物科技股份有限公司；Spectra Max酶標(biāo)儀：美國Molecular Devices公司；高效液相色譜儀、7890A氣質(zhì)聯(lián)用高效色譜儀：美國Agilent Technologies公司；WondaCractODS-2柱：日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 ITC提取方式

根據(jù)Wu等[20]的方法，分別破碎并稱取100 g蘿卜、芥菜、榨菜、甘藍(lán)、花菜、西蘭花種子的粉末，加入700 mL石油醚，振蕩搖勻2 h，過濾除去石油醚，濾渣用相同體積的石油醚繼續(xù)脫脂2次。濾渣置于通風(fēng)干燥櫥中過夜，得到脫脂種子。

先提取后酶解方式（HFE）[19]：30 g脫脂種子加入15 mL 磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH7.0），振蕩搖勻 2 h，再加入35 mL乙酸乙酯，振蕩搖勻4 h，隨后繼續(xù)加入2 g氯化鈉，充分混勻15 min后過濾，濾渣用乙酸乙酯再洗滌2次。在乙酸乙酯相中加入10.0 g無水硫酸鈉并過濾，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（45℃）將濾液濃縮并加入5 mL甲醇用于殘留物的溶解定容，儲(chǔ)存于-20℃冰箱中。

同時(shí)酶解和提取方式（SHE）[19]：30 g脫脂種子同時(shí)加入15 mL磷酸鹽緩沖液（0.1 mol/L，pH7.0）和35 mL乙酸乙酯，振蕩搖勻4 h，后續(xù)步驟與HFE相同。

1.3.2 ITC含量測(cè)定

根據(jù)Liu等[21]的方法，運(yùn)用環(huán)縮合法測(cè)定ITC含量。將200μL樣品與300μL磷酸鉀緩沖液（50mmol/L，pH8.5）和 400 μL 1，2-苯二硫醇（10 mmol/L）混勻，于65℃孵育2 h，隨后冷卻至25℃。將反應(yīng)液于12 000×g離心10 min，取上清液過0.22 μm微濾膜并檢測(cè)ITC含量。液相檢測(cè)條件為流動(dòng)相：甲醇和水分別為80%和 20%；流速：1.0 mL/min；進(jìn)樣量：10 μL；檢測(cè)波長：365 nm。色譜柱為 4.6 mm×250 mm，5 μm WondaCract ODS-2柱。

1.3.3 氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析

各種子中ITC種類和含量按照吳元鋒等[22]的方法測(cè)定，通過GC-MS進(jìn)行檢測(cè)。色譜柱為HP-5MS的UI毛細(xì)管柱（0.25 μm，30 m×0.25 mm）。1 μL 的上樣量，300℃的氣化室溫度。柱升溫程序?yàn)?0℃（2 min），升溫至190℃（10℃/min），再升溫至300℃（20℃/min），保持5 min。超高純氦氣作為載氣（分流比為10∶1）。質(zhì)譜的接口溫度為220℃，電離方式為電子離子化（electronic ionization，EI），電離能量為70 eV，質(zhì)量范圍為35 amu～500 amu[19]。內(nèi)標(biāo)物為環(huán)己酮。

1.3.4 提取液對(duì)B16細(xì)胞的抑制作用

提取液對(duì)小鼠B16細(xì)胞的抑制作用根據(jù)Chiang等[23]的方法，采用噻唑藍(lán)（methyl thiazolyl tetrazolium，MTT）比色法檢測(cè)。取對(duì)數(shù)生長期的B16細(xì)胞，用含EDTA的胰蛋白酶溶液進(jìn)行消化，制備成單細(xì)胞懸液，接種于 96 孔板中，每孔 100 μL，2×104個(gè)細(xì)胞/孔，置于37℃和5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁，加入含有純SF或提取液的培養(yǎng)液，使純SF和HFE組提取液最終濃度為30 μmol/L，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔；SHE組提取液與HFE組稀釋倍數(shù)相同，僅含有培養(yǎng)液的作為空白組。隨后將細(xì)胞置于培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)24 h，條件為37℃并含有5% CO2。分別加入20 μL無菌MTT溶液（5 mg/mL），反應(yīng)4 h。除去培養(yǎng)液，分別加入150 μL二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）。反應(yīng)10 min后在570 nm條件下檢測(cè)其OD值，計(jì)算24 h后B16細(xì)胞的存活率。

1.3.5 提取液對(duì)B16細(xì)胞NQO1的影響

在24孔板中，分別加入1 mL（含有約2×105個(gè)B16細(xì)胞）細(xì)胞懸液并傳代培養(yǎng)至細(xì)胞穩(wěn)定后加入含有純SF或提取液的培養(yǎng)液（濃度為5 μmol/L），培養(yǎng)24 h。用無菌磷酸緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）清洗去除培養(yǎng)液的B16細(xì)胞3次，隨后進(jìn)行胰蛋白酶消化。1 000×g離心細(xì)胞懸液5 min后去除上清液，在沉淀中加入細(xì)胞裂解液、1 mol/L二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT）和蛋白酶抑制劑（體積比為200∶1∶2），冰上裂解 30 min，每隔 10 min 用旋渦混勻器混勻，重復(fù)3次，再于12 000×g下離心30 min，取上清液，分裝于-80℃保存?zhèn)溆肹19]。

根據(jù)Liu等[21]的方法對(duì)NQO1活性進(jìn)行測(cè)定。工作液：25 mmol/L Tris-HCl緩沖液、0.67 mg/mL牛血清白蛋白（bovine albumin，BSA）、0.72 mmol/L MTT、0.01%（體積分?jǐn)?shù)）吐溫-20和0.03mmol/L煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（oxidized form of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate，NADP+）（體積比為 827∶13∶133∶7∶20）；混合液：50 μmol/L甲萘醌、2 U/mL葡萄糖-6-磷酸脫氫酶和工作液（體積比為 1∶20∶1 000）；現(xiàn)用現(xiàn)配，避光。按體積比1∶4混勻樣品溶液與混合液，每隔1 min檢測(cè)OD610，檢測(cè)7 min后加入25 μL濃度為0.3 mmol/L的雙香豆素以停止反應(yīng)，每隔1 min檢測(cè)610 nm處的吸光度（OD610），檢測(cè)7 min。MTT的還原量通過斜率計(jì)算。通過蛋白質(zhì)檢測(cè)試劑盒測(cè)定蛋白質(zhì)含量，以BSA為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)。NQO1活性以還原MTT的量表示，單位為nmol/（min·mg）。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

每項(xiàng)試驗(yàn)進(jìn)行3次以上，試驗(yàn)結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差來表示，數(shù)據(jù)用SPSS 22.0進(jìn)行單因素方差分析。統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性為P＜0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取方式對(duì)ITC含量的影響

通過環(huán)縮合法測(cè)定了SHE和HFE對(duì)ITC含量的影響，結(jié)果如表1所示。

表1 兩種提取方式對(duì)不同種子中ITC含量的影響Table 1 Effects of two extraction methods on ITC content in different seeds

由表1可知，采用SHE提取時(shí)，蘿卜種子的ITC含量最高，其次是西蘭花、甘藍(lán)和花菜種子，芥菜和榨菜種子的ITC含量較低。提取方式對(duì)蘿卜種子和西蘭花種子中ITC含量有顯著影響（P＜0.05），SHE組比HFE組分別提高了2.98倍和0.40倍。而對(duì)于芥菜、榨菜、甘藍(lán)和花菜種子，SHE組ITC含量略高于HFE組，但是無顯著差異（P＞0.05）。

2.2 提取方式對(duì)ITC種類和含量的影響

通過GC-MS分析了不同種子提取液中ITC的種類和含量，結(jié)果如表2所示。

表2 兩種提取方式對(duì)不同種子中ITC的種類和含量Table 2 Effects of two extraction methods on the kinds and content of ITC in different seeds

續(xù)表2 兩種提取方式對(duì)不同種子中ITC的種類和含量Continue table 2 Effects of two extraction methods on the kinds and content of ITC in different seeds

在不同種子中，西蘭花種子中ITC的種類最豐富，共13種。其次為花菜、甘藍(lán)、蘿卜、芥菜和榨菜種子。作為一種抗癌活性較高的活性物，SF的含量和提取方式一直受到人們的關(guān)注。SF在西蘭花種子中的含量最高，采用SHE時(shí)可達(dá)（134±35）mg/100 g?；ú撕透仕{(lán)種子中也含有SF，但西蘭花種子中SF的含量顯著高于這些種子。從表2可看出，alyssin和raphasatin分別只存在于西蘭花和蘿卜種子中。ER、iberverin和iberin在甘藍(lán)、花菜和西蘭花種子中均存在，但這3種ITC在不同蔬菜種子中含量有差異。甘藍(lán)和花菜種子中iberverin和iberin的含量均高于西蘭花，其中采用SHE時(shí)，甘藍(lán)和花菜種子中iberverin的含量分別是西蘭花種子的1.47倍和1.76倍。除蘿卜種子外，PEITC存在于其他各種所測(cè)蔬菜種子中，但是含量均不高。

與HFE相比，SHE使蘿卜種子中SFE含量提高了3.26倍并使西蘭花種子中ER含量增加了1.63倍。采用SHE時(shí)，蘿卜種子中的ER、raphasatin、B，4-I-1和SFE，以及芥菜、甘藍(lán)、花菜和西蘭花種子中的iberverin含量有顯著提高（P＜0.05）。但SHE對(duì)BUITC、BT、3-MI、iberin nitrile、PEITC、alyssin 和 ERN 的影響較小。在西蘭花種子中，ER可以在雙氧水作用下轉(zhuǎn)化為其結(jié)構(gòu)類似物SF[24]，SF也可以被腸道微生物或酶類代謝為ER[25-26]。但有機(jī)溶劑對(duì)黑介子酶的影響尚未研究，也沒有關(guān)于SF被有機(jī)溶劑催化為ER的報(bào)道。試驗(yàn)表明西蘭花中SF含量不受SHE和HFE影響。因此，采用SHE可以提高ER含量的原因還需進(jìn)一步探究。除ITC外，研究分析了各種腈類物質(zhì)，如iberin nitrile、iberverin nitrile、ERN、SFN 等，但含量均較低。與ITC不同，腈類物質(zhì)沒有生物學(xué)活性[27]。腈類物質(zhì)含量不受SHE和HFE影響（P＞0.05），這說明ESP活性不受有機(jī)溶劑影響。

2.3 不同種子提取液對(duì)B16細(xì)胞活性的影響

蘿卜、甘藍(lán)、花菜和西蘭花種子提取液對(duì)B16細(xì)胞活性的影響如圖2所示，通過SHE和HFE獲得的種子提取液稀釋至其ITC濃度等于SF標(biāo)準(zhǔn)品濃度。由于芥菜和榨菜種子提取液中ITC含量較低，未進(jìn)行分析比較。

圖2 不同提取方式和種子提取液對(duì)B16細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effects of different extraction methods and seed extracts on the survival rate of B16 cells

由圖2可以看出，SHE組種子提取液細(xì)胞抑制率均顯著高于HFE組（P＜0.05），特別是蘿卜種子，這與表1中SHE組ITC含量較高的結(jié)果一致。作為陽性對(duì)照，30 μmol/L的SF標(biāo)準(zhǔn)品可以使B16細(xì)胞的存活率降低至67%，說明SF對(duì)B16細(xì)胞有很強(qiáng)的抑制作用，與文獻(xiàn)[28]研究結(jié)果一致。采用HFE獲得的蘿卜種子提取液對(duì)B16細(xì)胞的抑制作用不同于陽性對(duì)照（P＜0.05），而其他種子提取液對(duì)B16細(xì)胞的影響與陽性對(duì)照相似（P＞0.05）。

2.4 不同種子提取液對(duì)B16細(xì)胞NQO1活性影響

NQO1是一種黃素蛋白酶，它以NADP（H）為受體，催化醌類及其衍生物失去兩個(gè)電子，從而保護(hù)細(xì)胞免受醌類物質(zhì)代謝過程中產(chǎn)生的活性氧及親電物質(zhì)的損傷[29]。因此，檢測(cè)NQO1活性，是評(píng)價(jià)提取液抗氧化活性的重要手段，。不同提取方式和種子提取液對(duì)B16細(xì)胞NQO1活性的影響見圖3。

圖3 不同提取方式和種子提取液對(duì)B16細(xì)胞NQO1活性的影響Fig.3 Effects of different extraction methods and seed extracts on the NQO1 activity of B16 cells

由圖3可知，各種子提取液對(duì)B16細(xì)胞的NQO1活性有不同的影響。HFE組的西蘭花種子提取液對(duì)NQO1誘導(dǎo)活性與純SF無顯著差異（P＞0.05），而SHE組則顯著高于SF（P＜0.05），這是由于SHE組產(chǎn)生了更多的ER，從而提高了總ITC的含量。兩組花菜種子提取液對(duì)NQO1的誘導(dǎo)活性均高于純SF，而甘藍(lán)種子提取液誘導(dǎo)活性則低于純SF。SHE組甘藍(lán)種子提取液對(duì)NQO1活性誘導(dǎo)作用高于HFE組提取液，但是無顯著差異（P＞0.05）。HFE組蘿卜種子提取液誘導(dǎo)作用低于純SF，但是無顯著差異（P＞0.05），但是SHE組蘿卜種子提取液的誘導(dǎo)作用則顯著低于HFE組（P＜0.05），這有可能是因?yàn)镾HE組中ITC的含量過高導(dǎo)致細(xì)胞大量死亡，從而導(dǎo)致酶活性反而下降。

3 結(jié)論

不同提取方式對(duì)十字花科蔬菜中ITC種類和含量有不同的影響。SHE提取的ITC含量要高于HFE，特別是蘿卜和西蘭花種子，分別提高了2.98倍和0.40倍。與HFE相比，SHE使蘿卜種子中SFE含量提高了3.26倍并使西蘭花種子中ER含量增加了1.63倍。對(duì)于蘿卜、甘藍(lán)、花菜和西蘭花種子，SHE提取液對(duì)B16細(xì)胞的抑制率高于HFE提取液。SHE組西蘭花種子提取液的NQO1誘導(dǎo)活性高于HFE組，但蘿卜種子的誘導(dǎo)活性卻相反。

本研究為從蔬菜中獲得高含量和高活性的ITC奠定基礎(chǔ)，也為蔬菜中天然活性成分的分析提供依據(jù)。