李 英， 鄧 超， 計(jì) 超?？谑腥嗣襻t(yī)院 重癥醫(yī)學(xué)科，海南 ?？?570208

膿毒癥是一種由于宿主對(duì)感染的反應(yīng)失調(diào)而引起的危及生命的器官功能障礙[1]。膿毒癥的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及感染、炎癥反應(yīng)、免疫等多方面因素。目前，可用的生物標(biāo)志物尚不能實(shí)現(xiàn)膿毒癥(特別是膿毒性休克)的早期診斷和個(gè)體化治療[2]。因此，急需能夠反映膿毒癥早期發(fā)生、進(jìn)展及預(yù)測(cè)其預(yù)后的生物標(biāo)志物。血清微小RNA(miRNAs)是一組非編碼RNA，作為一種遺傳物質(zhì)，其在細(xì)胞間的通訊中起著至關(guān)重要的作用[3]。既往有研究探討膿毒癥患者miRNAs差異化表達(dá)譜，并對(duì)其潛在作用進(jìn)行研究[4-5]。然而，miRNAs參與膿毒癥發(fā)病機(jī)制的研究還有待進(jìn)一步深入。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)膿毒癥患者的血清miRNAs進(jìn)行分析，篩選得到差異性表達(dá)miRNAs，以期為膿毒癥嚴(yán)重程度及預(yù)后的早期評(píng)估尋找新的生物標(biāo)志物，為膿毒癥的定制治療提供幫助?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取自2018年9月至2021年1月?？谑腥嗣襻t(yī)院收治的63例膿毒癥、30例膿毒性休克住院患者為研究對(duì)象。膿毒癥或膿毒性休克的診斷依據(jù)為《中國(guó)膿毒癥/膿毒性休克急診治療指南(2018)》[6]。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)序貫器官功能衰竭評(píng)估(sequential organ failure assessment，SOFA)評(píng)分(膿毒癥相關(guān))≥2分；(2)確診膿毒癥后進(jìn)行充分的容量復(fù)蘇和血管收縮藥物持續(xù)升壓，動(dòng)脈血壓≥65 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)；(3)血清乳酸水平>2 mmol/L。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)年齡<18周歲；(2)因其他非感染性因素引致多器官功能障礙；(3)因激素類或免疫抑制劑治療而出現(xiàn)自體免疫性疾??；(4)合并其他影響凝血功能的疾病或惡性腫瘤；(5)合并其他可能影響本研究結(jié)果的疾病。另外，從我院健康體檢中心隨機(jī)抽取30例健康志愿者作為健康組。健康組男性18例，女性12例；年齡(69.50±13.91)歲。膿毒癥組男性62例，女性31例；年齡(70.80±15.71)歲。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，受試者或家屬均簽署知情同意書(shū)。

1.2 研究方法

1.2.1 血液樣本采集 使用EDTAK采血管采集3.0 ml外周靜脈血樣本。全血4℃下儲(chǔ)存。樣品在3 000 r/min、4 ℃下離心10 min，取上清液置于1.5 ml無(wú)酶離心管中，然后進(jìn)一步在13 000 r/min離心2 min，取上清液置于1.5 ml底部錐形離心管中，去除沉淀物，樣品保存在-80℃中進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 應(yīng)用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)血清miRNAs差異表達(dá) 用Trizol試劑隨機(jī)從3例膿毒癥患者和3例健康人的血清上清樣本中提取總RNA，用凝膠電泳分離DNA片段，將5′端和3′端的RNAadaptor連接到純化小RNA的上，用于反轉(zhuǎn)錄和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)擴(kuò)增，用瓊脂糖凝膠電泳回收純化片段(約140 bp)，在Agilent 2100生物分析儀上進(jìn)行核酸樣品質(zhì)量控制。采用高通量測(cè)序確定表達(dá)變化超過(guò)2倍的miRNAs作為預(yù)測(cè)miRNA靶基因和功能富集分析的候選基因。

1.2.3 檢測(cè)miR-98表達(dá)水平 使用QIAamp RNA血液試劑盒(德國(guó)Qiagen公司)從血清樣本中提取總RNA。用蛋白質(zhì)/核酸定量器測(cè)定RNA原液濃度，保存在-80℃中進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)?；パa(bǔ)DNA(complementary DNA，cDNA)是由Taqman?MicroRNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國(guó)Applied Biosystems公司)合成的。采用ABI7500熒光定量PCR系統(tǒng)進(jìn)行cDNA擴(kuò)增的實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)。所有的樣本一式三份。以miRNA cel-miR-39(5′-UCACCGGGUGUAAAUCAGCUUG)作為合成的內(nèi)參對(duì)照，將血清miR-98表達(dá)水平歸一化為cel miR-39表達(dá)，并用2-ΔΔCt法測(cè)定。miR-98正向引物:5′-ATCCAGTGCGTGTCGTG-3′；miR-98反向引物：5′-TGCTTGAGGTAGTAAGTTG-3′。

1.2.4 酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)血清可溶性自殺相關(guān)因子及其配體水平 采用商用酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(中國(guó)武漢Cusabio Biotech公司，CSB-E04542h，CSB-E04544h)測(cè)定人血清中可溶性自殺相關(guān)因子(soluble factor associated suicide,sFas)及其配體(soluble Fas ligand，sFasL)濃度。

2 結(jié)果

2.1 高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)血清中miRNAs的差異性表達(dá)譜 采用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)膿毒癥患者和健康人的血清miRNA表達(dá)，共有73個(gè)差異性表達(dá)miRNAs(圖1)。與健康組相比，膿毒癥組有35個(gè)miRNA顯著上調(diào)，38個(gè)miRNA顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其中，miR-98在膿毒癥患者血清樣本中的表達(dá)至少比健康組降低2.3倍。因此，miR-98被篩選為候選基因。

2.2 檢測(cè)各組臨床血清樣本中miR-98相對(duì)表達(dá)量 選擇高通量測(cè)序中篩選差異表達(dá)2倍以上的miR-98作為候選因子，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增，健康組、膿毒癥組患者血清樣本中miR-98相對(duì)表達(dá)量分別為1.009(0.843，1.130)和0.526(0.426，0.722)，兩組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，膿毒性休克者血清miR-98相對(duì)表達(dá)量為0.406(0.356，0.458)，低于膿毒癥患者的0.647(0.493，0.912)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.3 血清樣本中miR-98相對(duì)表達(dá)量與膿毒癥患者臨床特征的關(guān)系 以血清miR-98相對(duì)表達(dá)量中位值0.526為分界線，將膿毒癥患者分為miR-98低表達(dá)亞組(n=47)和高表達(dá)亞組(n=46)。miR-98低表達(dá)亞組的血小板(blood platelet，PLT)計(jì)數(shù)、血清白蛋白(albumin，ALB)、膽堿酯酶(cholinesterase，CHE)水平顯著低于miR-98高表達(dá)亞組；與miR-98高表達(dá)亞組比較，天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartic transaminase，AST)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT)、總膽紅素(total bilirubin，TBIL)、尿素氮(urea nitrogen，BUN)、血肌酐(serum creatinine，Scr)、心肌肌鈣蛋白Ⅰ(Cardiac troponin，cTnⅠ)、氨基末端腦鈉肽前體(Amino-terminal pro-brain natriuretic peptide，NT-proBNP)、D-二聚體、C反應(yīng)蛋白(C-reactive protein,CRP)和降鈣素原(procalcitonin，PCT)水平明顯升高，且凝血酶原時(shí)間(prothrombin time，PT)和活化部分凝血活酶時(shí)間(activated partial thromboplastin time，APTT)延長(zhǎng)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表1。

圖1 高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)膿毒癥患者和健康者血清miRNAs差異性表達(dá)火山圖

表1 血清樣本中miR-98相對(duì)表達(dá)量與膿毒癥患者臨床特征的關(guān)系

2.4 膿毒癥患者血清樣本中miR-98相對(duì)表達(dá)量與sFas、sFasL水平的關(guān)系 miR-98低表達(dá)亞組患者血清sFas 為(1 462.82±367.36)pg/ml，高于miR-98高表達(dá)亞組的(922.39±365.99)pg/ml；sFasL為(94.02±33.06)pg/ml，高于miR-98高表達(dá)亞組的(59.88±30.04)pg/ml，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)Pearson相關(guān)系數(shù)分析，血清miR-98相對(duì)表達(dá)量與血清sFas、sFasL水平均呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.722，r=-0.553，P<0.001)。見(jiàn)圖2。

2.5 膿毒癥患者血清樣本中miR-98相對(duì)表達(dá)量與急性生理與慢性健康評(píng)分Ⅱ、SOFA評(píng)分的關(guān)系 miR-98低表達(dá)亞組患者SOFA評(píng)分為(10.23±3.59)分，高于miR-98高表達(dá)亞組的(6.28±2.43)分；急性生理與慢性健康評(píng)分Ⅱ(acute physicology and chronic health evaluation Ⅱ,APACHE Ⅱ)評(píng)分為(24.17±5.56)分，高于miR-98高表達(dá)亞組的(15.63±3.52)分，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。經(jīng)Spearman相關(guān)系數(shù)分析，血清miR-98相對(duì)表達(dá)量與SOFA評(píng)分、APACHE Ⅱ評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)性(r=-0.631，r=-0.594，P<0.001)。見(jiàn)圖3。

圖2 膿毒癥患者血清樣本中miR-98相對(duì)表達(dá)量與血清sFas、sFasL水平的相關(guān)性

圖3 膿毒癥患者血清樣本中miR-98相對(duì)表達(dá)量與SOFA評(píng)分、APACHE Ⅱ評(píng)分的相關(guān)性

2.6 30 d內(nèi)病死組與存活組血清樣本中miR-98相對(duì)表達(dá)量、sFas、sFasL水平 miR-98低表達(dá)亞組患者30 d病死率為31.9%(15/47)，低于miR-98高表達(dá)亞組的10.9%(5/46)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。此外，病死組患者血清sFas、sFasL水平顯著高于存活組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見(jiàn)表3。

表3 30 d內(nèi)病死組與存活組患者血清miR-98相對(duì)表達(dá)量、sFas、sFasL水平

3 討論

膿毒癥患者的住院病死率約為10%，而膿毒性休克患者的住院病死率甚至可超過(guò)40%[7]。因此，準(zhǔn)確評(píng)估膿毒癥患者的嚴(yán)重程度和預(yù)后，對(duì)于個(gè)體化臨床治療十分重要。目前，血清學(xué)檢查、SOFA評(píng)分和 APACHE Ⅱ評(píng)分是評(píng)估膿毒癥發(fā)病原因和預(yù)后的常用臨床指標(biāo)，但由于膿毒癥的發(fā)病機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，上述指標(biāo)尚不能準(zhǔn)確、直觀地反映膿毒癥的臨床特征[8-9]。miRNAs作為重要的基因表達(dá)調(diào)控分子，可以在多種組織和體液中檢測(cè)到，在各種疾病的發(fā)病機(jī)制和病理生理過(guò)程中起著重要作用[4-5,10]。且循環(huán)miRNAs易獲得且結(jié)構(gòu)相對(duì)穩(wěn)定，這為從miRNAs水平研究多種疾病發(fā)病機(jī)制以及尋找可靠的生物學(xué)分子提供新的線索。

有研究表明，miRNAs參與膿毒癥炎癥反應(yīng)和細(xì)胞凋亡過(guò)程，并可針對(duì)性地調(diào)節(jié)炎癥相關(guān)信號(hào)通路[11]。本研究采用高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)膿毒癥患者和健康者血清miRNAs差異性表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-98在膿毒癥患者血清樣本中的表達(dá)至少比健康組降低2.3倍。隨后利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果證實(shí)，膿毒癥患者血清miR-98表達(dá)下調(diào)，且膿毒性休克患者血清miR-98表達(dá)下調(diào)更明顯。miR-98參與30%～90%的人類基因調(diào)控以及相關(guān)的病理過(guò)程[12]。有研究表明，miR-98與某些情況下的炎癥細(xì)胞因子有關(guān)。Zhang等[13]研究報(bào)道，miR-98在心肌炎患者外周血中表達(dá)下調(diào)，且心肌細(xì)胞miR-98表達(dá)的抑制/易化可調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞凋亡，進(jìn)而誘導(dǎo)心肌損傷。而在本研究中，膿毒癥患者血清miR-98相對(duì)表達(dá)量與血清sFas、sFasL水平均呈負(fù)相關(guān)性，說(shuō)明Fas是miR-98的潛在靶標(biāo)，miR-98表達(dá)升高可以降低Fas誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的敏感性，這與Wang等[14]研究結(jié)論一致。

細(xì)胞凋亡是敗血癥和多器官功能障礙的主要病理學(xué)基礎(chǔ)[15]。FasL是與其主要受體Fas結(jié)合時(shí)激活凋亡外源途徑的主要配體之一，通過(guò)激活caspase-8可產(chǎn)生死亡信號(hào)，并進(jìn)一步激活caspase-3凋亡途徑，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡損傷[16]。此外，F(xiàn)as/FasL途徑也會(huì)啟動(dòng)壞死性細(xì)胞程序性死亡，這是一種不依賴于caspases途徑，而是通過(guò)受體相互作用蛋白激酶調(diào)控的細(xì)胞死亡途徑。巨噬細(xì)胞和/或淋巴細(xì)胞的活化過(guò)程本身就需要對(duì)外來(lái)病原體產(chǎn)生有效的炎癥和/或適應(yīng)性免疫反應(yīng)。對(duì)于大多數(shù)細(xì)胞來(lái)說(shuō)，這些過(guò)程參與細(xì)胞自身的死亡過(guò)程。而Fas-FasL介導(dǎo)的淋巴細(xì)胞自殺則是炎癥或局部組織損傷過(guò)程的重要機(jī)制，F(xiàn)as/FasL系統(tǒng)平衡也被認(rèn)為是有助于維持腎、胰腺、肺等不同器官免疫功能正常的分子基礎(chǔ)[17]。有研究表明，F(xiàn)asL-/-動(dòng)物模型或通過(guò)服用Fas-受體融合蛋白FasFP競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑的動(dòng)物模型，可明顯降低膿毒癥相關(guān)的死亡風(fēng)險(xiǎn)[18]。因此，筆者認(rèn)為，F(xiàn)as/FasL信號(hào)激活可誘導(dǎo)體內(nèi)/體外細(xì)胞凋亡增加。本研究通過(guò)分析血清miR-98表達(dá)水平與患者臨床特征的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，miR-98低表達(dá)與肝、腎、心及凝血功能指標(biāo)異常有關(guān)。APACHE Ⅱ評(píng)分和SOFA評(píng)分已廣泛應(yīng)用于評(píng)估膿毒癥的嚴(yán)重程度和預(yù)后。然而，這兩項(xiàng)指標(biāo)都涵蓋多個(gè)項(xiàng)目，在早期評(píng)估敗血癥的嚴(yán)重程度和預(yù)后方面價(jià)值有限。本研究血清miR-98表達(dá)與APACHE Ⅱ評(píng)分、SOFA評(píng)分都呈一定的負(fù)相關(guān)性，說(shuō)明miR-98在一定程度上反映疾病進(jìn)展，可作為敗血癥嚴(yán)重程度的預(yù)測(cè)指標(biāo)。

綜上所述，血清miR-98檢測(cè)有助于準(zhǔn)確地反映膿毒癥患者的臨床特征，并有望成為評(píng)估膿毒癥嚴(yán)重程度和預(yù)后的潛在生物標(biāo)志物，其作用機(jī)制之一與調(diào)控Fas/FasL細(xì)胞凋亡通路有關(guān)。