周有儉，劉曙光，龍嘉莉，曾超

(中山大學附屬第八醫(yī)院病理科，廣東 深圳 518033)

在全世界范圍內，宮頸癌的發(fā)生率和致死率在女性生殖系統(tǒng)腫瘤中均為第一[1]。隨著臨床技術水平的提升，宮頸癌在診療方案已取得突破性進展(如手術方式、放化療等)，顯著提高早期宮頸癌患者預后。但對于進展期的宮頸癌患者，現有臨床治療方案的療效難以進一步提高[2]。宮頸癌發(fā)病相關分子較為復雜，探索與發(fā)病相關的新分子標志物對于宮頸癌的預防及靶向治療尤為重要。

叉頭樣轉錄因子3(forkhead box protein 3，Foxp3)的表達，通過誘導體內T淋巴細胞功能紊亂，誘導癌細胞免疫逃逸[3-4]。除調節(jié)性T細胞(regulatory T cells，Treg細胞)表達Foxp3外，肺癌、腸癌和膠質瘤等部分實體腫瘤細胞中也存在不同水平的表達[5-9]；SMARCE1的表達與乳腺癌、卵巢癌和胃癌患者的預后相關，并且SMARCE1是促進乳腺癌細胞浸潤和轉移的關鍵基因[10-14]。本研究擬探討 Foxp3、SMARCE1蛋白的表達水平與宮頸癌患者臨床病理特征的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年1月至2020年12月中山大學附屬第八醫(yī)院病理科收治的60例宮頸癌患者作為研究組，同時選取同期30例慢性宮頸炎組織作為對照組。研究組中，年齡35～58歲，平均(46.5±0.8)歲；宮頸上皮內瘤變(cervicalintraepithelial neoplasia，CIN)15例，包括CIN1級4例、CIN2級6例、CIN3級5例。對照組中，年齡 30～55歲，平均(42.5±0.4)歲。

1.2 組織芯片制作

對每例組織標本，先在蘇木素-伊紅染色(hematoxylin and eosin，HE)切片上確定典型的組織，并在相應的蠟塊上作好標記，將組織轉移蠟模中。取97.5 g石蠟和2.5 g蜂蠟混合，反復加溫溶解，冷卻數次，制成空白蠟塊。在該蠟塊范圍內組織陣列，用組織儀打孔(0.6 mm)制成組織微陣列模塊。將構建好的組織芯片蠟塊放入55 ℃ 溫箱中約1～2 h，在蠟將要完全溶解前取出，室溫下冷卻，使蠟與新插入的小圓柱狀組織融為一體，取下蠟塊，于 4 ℃ 冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 免疫組化

于二甲苯中將組織芯片脫蠟，梯度酒精水化。磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗，抗原修復后甩干。Foxp3一抗(德國Santa 公司，sc-53876，濃度1∶50)； SMARCE1一抗(英國abcam公司，ab131328，濃度1∶100)，室溫孵育3 h。加入辣根過氧化物酶標二抗，室溫孵育20 min。二氨基聯苯胺四鹽酸鹽(DAB)顯色，蘇木素染色，封片。選取20個視野，每個視野計數100個癌細胞，對癌細胞染色強度和陽性細胞比例進行評分。染色強度：無著色為0分，淺黃色1分，黃色2分，棕色3分；陽性細胞比例：<10%為1分，10%～50%為2分，>50%為3分。染色強度和陽性細胞比例得分之和≥3分記為陽性。

1.4 質粒構建及轉染

從HeLa細胞中提取信使核糖核酸(mRNA)，通過逆轉錄聚合酶鏈反應擴增人Foxp3(NM_014009.4)全長互補/拷貝脫氧核糖核酸(cDNA)。引物序列設計：Foxp3-F∶5-′TGGTACCGAGCTCGCCACCATGCCCACCAGGCCTGGCAAG-3′；Foxp3-R∶5-′GATATCTGCAGAATTCTCAGGGGCCAGGTGTAGGGTTG-3′。將Foxp3 DNA片段克隆入pcDNA3.1構建重組pcDNA3.1-Foxp3質粒。用Lipofectamine 2000(美國Invitrogen公司)將空質粒pcDNA3.1和過表達質粒pcDNA3.1-Foxp3轉染SiHa細胞。

1.5 Western blot實驗

提取各組宮頸癌細胞蛋白，取上清液采用聚氰基丙烯酸正丁酯(BCA)試劑盒進行蛋白定量，加入5×Loading Buffer煮沸后，使用SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，聚偏氟乙烯(PVDF)轉膜、5%脫脂奶粉封閉，用1∶1 000稀釋后的一抗過夜孵育，次日選擇辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，增強型化學發(fā)光(ECL)試劑盒顯影。采用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)檢測染色條帶的強度，計算目的蛋白和內參蛋白的光密度比值。

1.6 細胞免疫熒光實驗

室溫下4%多聚甲醛固定細胞15 min，室溫下0.5% Triton X-100浸潤20 min，然后與一抗孵育。主要使用的抗體如下： Foxp3 (1∶50稀釋，德國santa)， smarce1 (1∶100稀釋，英國abcam)。4 ℃ 孵育過夜，加熒光二抗，滴加4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)避光孵育5 min，對標本進行染核，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

1.7 雙熒光素酶實驗

測序確定SMARCE1啟動子片段(在5-3 bp和452-460 bp區(qū)域)并克隆到pGL3-Basic載體(Wisconsin，Promega)中。將細胞接種于24孔板，瞬時轉染含有螢火蟲熒光素酶報告子和重組啟動子報告子的質粒。熒光素酶活性在孵育24 h后，使用雙熒光素酶檢測試劑盒(中國碧海)進行測定。轉染效率以Renilla熒光素酶活性為標準。特異性啟動子活性表現為實驗組與對照組的變化。

1.8 染色質免疫共沉淀實驗

染色質免疫共沉淀實驗是依照ChIP檢測試劑盒(美國Epigentek)實驗步驟進行。5 μg Foxp3抗體(英國Abcam)和20 μL完全重懸蛋白A/G磁珠免疫沉淀染色質-蛋白復合物。實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qPCR)擴增感興趣區(qū)域或內部陰性控制區(qū)。每個樣品進行3個重復的分析，沉淀的DNA的數量計算為輸入樣品的百分比。用于Chip-qPCR定量分析的引物列為：SMARCE1 F∶5′-TGTCAAAATCTCCACCCTGATG-3′；SMARCE1 R∶5′-CCACCACACCCTGCTAATTT-3′。

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數資料以[n(%)]表示，組間比較使用χ2檢驗；等級資料以頻數表示，組間比較使用U檢驗；Foxp3和SMARCE1 表達的相關性采用Spearman秩相關分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組織Foxp3、SMARCE1陽性表達率比較

研究組Foxp3和SMARCE1陽性表達率均高于對照組，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表1及圖1。

表1 兩組Foxp3和SMARCE1表達比較[n(%)]

2.2 研究組中Foxp3和SMARCE1表達與宮頸癌臨床病理關系

Foxp3蛋白陽性表達產物主要定位于宮頸癌腫瘤細胞的胞質，間質中的淋巴細胞也可見陽性表達，Foxp3蛋白表達與宮頸癌的TNM分期相關(P<0.05)，而與年齡、腫瘤分化程度和淋巴結轉移均無關(P>0.05)。SMARCE1蛋白陽性表達產物也主要定位于宮頸癌腫瘤細胞的胞質，SMARCE1蛋白與宮頸癌的淋巴結轉移相關(P<0.05)，但與年齡、腫瘤分化程度和臨床分期無關(P>0.05)。見表2。

表2 研究組中Foxp3和SMARCE1表達與宮頸癌各臨床病理參數之間的關系[n(%)]

2.3 研究組中Foxp3和SMARCE1在宮頸癌組織中表達相關性分析

Spearman秩相關分析顯示Foxp3和SMARCE1表達呈正相關(r=0.894，P<0.05)。見表3。

表3 研究組中Foxp3和SMARCE1在宮頸癌組織中表達相關性

2.4 SMARCE1在宮頸CIN組織中的表達

免疫組化結果表明，SMARCE1在CIN1級組織中呈陰性表達，而SMARCE1在CIN3(原位癌)級組織中的染色強度和染色范圍強于其在CIN2級組織中的表達，表明SMARCE1在宮頸高級別上皮內瘤變中的表達強于其在低級別上皮瘤病變，提示SMARCE1可能參與了宮頸癌的進展。見圖2。

2.5 Foxp3調控宮頸癌細胞中SMARCE1表達

Western blot實驗發(fā)現，與SiHa細胞組和轉染pcDNA3.1空質粒組相比，增強宮頸癌細胞SiHa 中Foxp3表達后，SMARCE1表達隨之上調。免疫熒光檢測發(fā)現，與未處理組和對照組相比，上調SiHa細胞中Foxp3表達后，SMARCE1的熒光信號也隨之增強。見圖3。

雙熒光素酶實驗結果表明，與pGL-basic-SMARCE1報告基因和對照載體的共轉染相比，共轉染Foxp3過表達質粒和pGL-basic-SMARCE1報告基因顯著提高了螢火蟲對renilla熒光素酶活性的比率。本研究進一步利用JASPAR數據庫預測轉錄因子Foxp3與SMARCE1基因相互作用的位置。SMARCE1啟動子的5-13 bp和452-460 bp區(qū)域是Foxp3激活的關鍵區(qū)域。將Foxp3抗體沉淀的DNA進行凝膠電泳和qPCR檢測，以確定轉錄因子Foxp3與SMARCE1啟動子之間的關系。結果表明，轉錄因子Foxp3可直接結合到SMARCE1啟動子區(qū)域，Foxp3過表達可使Foxp3更多地結合到SMARCE1啟動子區(qū)域。因此，Foxp3可轉錄激活宮頸癌細胞中SMARCE1的表達。見圖4。

3 討論

宮頸癌是女性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，腫瘤的浸潤或轉移常提示預后差。晚期宮頸癌患者復發(fā)率高，化療耐藥，導致其生存率更低。因而探尋宮頸癌進展中的分子標志物，可為臨床宮頸癌的免疫靶向治療提供理論基礎。

Foxp3 能抑制 CD4+T 淋巴細胞功能，阻礙 T 細胞的抗原提呈作用，降低自然殺傷性T淋巴細胞對于腫瘤細胞的殺傷作用。表達Foxp3的胃癌細胞可起到了模擬Treg細胞功能的作用，促進腫瘤免疫逃逸；Foxp3在惡性上皮性腫瘤組織中的表達顯著強于其在卵巢良性、交界性上皮性腫瘤中的表達[15]；SMARCE1高表達促進胃癌細胞轉移，影響患者的預后[10]。目前關于Foxp3和SMARCE1在宮頸癌進展中的作用及其臨床意義的研究甚少。

本研究中，研究組宮頸癌病灶組織中Foxp3和SMARCE1的表達陽性率顯著高于對照組的正常宮頸組織，且臨床分期較晚的患者中Foxp3和SMARCE1的表達陽性率較高，存在淋巴結轉移的患者SMARCE1的表達異常高，提示了 Foxp3和SMARCE1等的異常表達均可能參與到了宮頸癌發(fā)生發(fā)展，與Sethuraman等[11]研究結果一致。進一步利用免疫組化研究發(fā)現，SMARCE1在宮頸高級別上皮內瘤變中的表達強于其在低級別上皮瘤病變中的表達，提示SMARCE1在宮頸癌的癌前病變中也起著重要的作用，很有可能在宮頸癌的癌變過程中起著關鍵性的促進作用。此外，本研究還發(fā)現，增強宮頸癌細胞中Foxp3表達后，SMARCE1表達也隨之上調。雙熒光素酶實驗和免疫共沉淀實驗也證實了Foxp3通過激活SMARCE1啟動子區(qū)域激活SMARCE1表達?？傊緦嶒灡砻鱂oxp3/ SMARCE1通路在宮頸癌的癌變過程和發(fā)生發(fā)展的進程中均起著重要的作用。但是，本研究僅為單中心、小樣本研究，后續(xù)仍需進行多中心、大樣本研究以進一步驗證相關結論。此外，本研究未闡明Foxp3和SMARCE1蛋白通過何種作用機制參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過程，后續(xù)仍需開展更深入的生物學研究以進一步明確相關作用途徑。

綜上所述，宮頸癌中Foxp3和SMARCE1蛋白的表達成正相關，Foxp3可通過轉錄激活SMARCE1表達，參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展。