李秀珍 劉風(fēng)琴 王芳 郭樹(shù)靜

[摘要]目的建立焦磷酸測(cè)序?qū)λ幤分?種致病菌的快速鑒定方法。方法通過(guò)信息網(wǎng)站及專業(yè)設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增后進(jìn)行電泳與焦磷酸測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與Genebank庫(kù)相應(yīng)基因序列進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果5種致病菌測(cè)序結(jié)果與Genebank庫(kù)相應(yīng)基因序列匹配率均在93%以上，均能得到良好的鑒定結(jié)果。結(jié)論焦磷酸測(cè)序方法可以實(shí)現(xiàn)對(duì)5種致病菌的快速鑒定，大大提高鑒定效率。

[關(guān)鍵詞]焦磷酸測(cè)序;5種致病菌;通用引物;快速鑒定

[中圖分類號(hào)]R969;R446.5??? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A??? [文章編號(hào)]2095-0616（2022）01-0055-04

Rapid identification of five pathogenic bacteria in drugs by pyrosequencing

LI Xiuzhen??? LIU Fengqin??? WANG Fang??? GUO Shujing

Department of Biological Testing，Dezhou Food and Drug Inspection and Testing Center，Shandong，Dezhou 253000，China

[Abstract]Objective To establish a rapid identification method for five pathogenic bacteria in drugs by pyrosequencing. Methods Primers were designed through information website and professional design software，and then electrophoresis and pyrosequencing were conducted after the amplification of primers. The sequencing results were compared with the corresponding gene sequences in Genebank library. Results The sequencing results of the five pathogenic bacteria matched the corresponding gene sequences of the Genebank library by more than 93%，and all of them could be identified well. Conclusion The method of pyrosequencing can realize the rapid identification of five pathogenic bacteria and greatly improve the identification efficiency.

[Key words]Pyrosequencing;Five pathogenic bacteria;Universal primer;Rapid identification

隨著人們對(duì)微生物快速鑒定的重視，建立一種快速準(zhǔn)確的致病菌鑒定方法成為研究熱點(diǎn)[1-2]。傳統(tǒng)的鑒定方法主要是表型微生物鑒定法，其操作煩瑣，耗時(shí)長(zhǎng)，受主觀因素影響較大[3-5]，且可能存在因受損微生物不能完整表達(dá)其表型屬性，而被正確鑒定分類的情況[6]。焦磷酸測(cè)序（pyrosequencing）技術(shù)是新一代脫氧核糖核酸（DNA）序列分析技術(shù)，克服了傳統(tǒng)培養(yǎng)技術(shù)的不足，具有敏感快速、操作簡(jiǎn)便、分析結(jié)果更加全面、準(zhǔn)確等優(yōu)勢(shì)[7-9]，可應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域的病原菌快速檢測(cè)[10]。目前，應(yīng)用焦磷酸測(cè)序?qū)ξ⑸镞M(jìn)行鑒定，大多需要使用不同的引物。對(duì)于同一樣本，想要排查多種致病菌時(shí)，需要多次重復(fù)操作，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。通過(guò)研究，本研究建立5種常見(jiàn)致病菌（副溶血性弧菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、福氏志賀氏菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌）快速鑒定方法。采用一條通用引物，一次鑒定可同時(shí)排查5種致病菌，大大提高鑒定效率?，F(xiàn)報(bào)道如下。

1??? 材料與方法

1.1??? 材料

1.1.1??? 標(biāo)準(zhǔn)菌株??? 選取福氏志賀菌ATCC12022、金黃色葡萄球菌ATCC6538、單核細(xì)胞增生李斯特菌ATCC19115、副溶血性弧菌ATCC17802、阪崎腸桿菌ATCC29544、沙門氏菌ATCC14028、大腸0157 ATCC35150共7種常見(jiàn)致病菌株，均為德州市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心購(gòu)買標(biāo)準(zhǔn)菌株。菌株復(fù)蘇后接種于相應(yīng)的增菌培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)。

1.1.2??? 主要儀器和試劑??? 儀器：刀式研磨儀GM200、冷凍高速離心機(jī)FRESCO21、核酸蛋白測(cè)定儀QIAxpert、基因擴(kuò)增儀ETC811、QIAxcel Advanced全自動(dòng)核酸分析系統(tǒng)、實(shí)時(shí)定量焦磷酸序列分析儀PyroMark Q48 Autoprep。測(cè)序軟件及版本號(hào)為PyroMark Q48 Autoprep 2.4.2。試劑：PowerFood Microbial DNA Isolation kit購(gòu)于凱杰企業(yè)管理（上海）有限公司、PyroMark PCR Kit（200）購(gòu)于凱杰企業(yè)管理（上海）有限公司、PyroMark Q48 advanced CpG Reagents購(gòu)于凱杰企業(yè)管理（上海）有限公司、擴(kuò)增及測(cè)序引物購(gòu)于生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2??? 方法

1.2.1??? 引物的設(shè)計(jì)與合成利用基因庫(kù)數(shù)據(jù)檢索網(wǎng)站美國(guó)國(guó)家生物信息中心（NCBI）及焦磷酸測(cè)序儀配套專業(yè)軟件，設(shè)計(jì)測(cè)定通用引物，進(jìn)行致病菌的鑒定。通用引物為：上游引物F：5TCGATGCAACGCGAAGAA 3，下游引物R：5ACATTTCACAACACGAGCTGACGA 3，測(cè)序引物S：CGCGAAGAACCTTACC，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2??? 細(xì)菌DNA的提取??? 取1.8 ml上述各細(xì)菌過(guò)夜培養(yǎng)物（或樣品中分離的各純菌落過(guò)夜培養(yǎng)物）至2 ml收集管中，13 000 r/min離心1 min，棄上清，按照PowerFood Microbial DNA Isolation kit 提取試劑盒操作說(shuō)明，提取上述各細(xì)菌DNA模板備用。

1.2.3??? PCR（聚合酶鏈反應(yīng)）反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序PCR反應(yīng)體系的配制??? 擴(kuò)增反應(yīng)體積為25 μl，分別為：10×CoralLoad Concentrate 2.5 μl，2×PyroMark PCR Master Mix 12.5 μl，引物（5 μmol/L）各1μl，模板DNA（50～200 ng/μl）2 μl，加滅菌去離子水至25 μl;擴(kuò)增程序：95℃-15 min，94℃-30 s，60℃-30 s，72℃-30 s，45個(gè)循環(huán)，72℃-10 min，4℃保存。

1.2.4??? 電泳取PCR產(chǎn)物??? 利用QIAxcel Advanced 全自動(dòng)核酸分析系統(tǒng)進(jìn)行毛細(xì)管電泳。

1.2.5??? 測(cè)序??? 按照焦磷酸測(cè)序儀操作規(guī)程進(jìn)行操作，按照（ATCG35個(gè)循環(huán)）進(jìn)行噴射，單端測(cè)序，根據(jù)儀器提示在試劑艙相應(yīng)位置加入所需產(chǎn)物、底物、酶和A、C、G、T等，按照儀器操作提示進(jìn)行測(cè)序。

2??? 結(jié)果

2.1??? 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果

將PCR產(chǎn)物進(jìn)行毛細(xì)管電泳，均能得到100 bp左右的擴(kuò)增片段條帶。見(jiàn)圖1～3。

2.2??? 擴(kuò)增產(chǎn)物焦磷酸測(cè)序結(jié)果

將擴(kuò)增后產(chǎn)物進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，測(cè)序后其中5種致病菌均能得到良好的測(cè)序結(jié)果。見(jiàn)圖4～8。

2.3??? 測(cè)序比對(duì)結(jié)果

將上述5種致病菌測(cè)序結(jié)果與標(biāo)準(zhǔn)序列進(jìn)行比對(duì)，測(cè)得序列與標(biāo)準(zhǔn)序列幾乎一致，均能得到良好的比對(duì)結(jié)果。見(jiàn)圖9～13。

以上5種致病菌經(jīng)同一引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)得序列（以上擴(kuò)增后測(cè)序結(jié)果，均為原結(jié)果，由測(cè)序序列去除兩端引物區(qū)，未進(jìn)行拼接與剪切，未進(jìn)行任何修飾與改動(dòng)）與Genebank庫(kù)相應(yīng)基因序列進(jìn)行比對(duì)，匹配率（identities）均在93%以上，均能得到良好的鑒定結(jié)果。

3??? 討論

3.1??? 當(dāng)前研究狀況

3.1.1??? 方法設(shè)計(jì)??? 本研究利用微生物特異性與保守型更強(qiáng)的V3、V4、V5、V6區(qū)分別進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，旨在尋求一條通用引物，可以同時(shí)對(duì)更多菌株進(jìn)行焦磷酸快速鑒定。本研究使用常見(jiàn)的7種致病菌：副溶血性弧菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、福氏志賀菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、大腸0157進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)使用V6區(qū)設(shè)計(jì)的引物（見(jiàn)1.2.1），對(duì)其中5種菌（副溶血性弧菌、單核細(xì)胞增生李斯特菌、福氏志賀菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌）擴(kuò)增后均可以進(jìn)行測(cè)序區(qū)分，省時(shí)省力。本研究以V6區(qū)設(shè)計(jì)的引物作為通用引物，建立焦磷酸測(cè)序?qū)?種致病菌的快速鑒定方法。

3.1.2??? 方法證實(shí)??? 為進(jìn)一步驗(yàn)證方法的可靠性，本研究用上述5種標(biāo)準(zhǔn)菌株及實(shí)驗(yàn)室樣品中分離的5種陽(yáng)性菌株進(jìn)行多次測(cè)定，測(cè)定結(jié)果與傳統(tǒng)培養(yǎng)法、全自動(dòng)微生物鑒定儀鑒定結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，鑒定結(jié)果均一致。

3.2??? 同類研究比較

焦磷酸測(cè)序作為新一代DNA測(cè)序技術(shù)，在突變基因[11-13]、DNA甲基化[14-15]等方面已有大量研究報(bào)道。在致病菌的快速檢測(cè)方面，曹冬梅等[16]建立了快速鑒定食品中腸炎沙門菌的PCR—焦磷酸測(cè)序法，張麗娜等[10]建立了快速檢測(cè)3種海洋性弧菌的焦磷酸測(cè)序方法。對(duì)致病菌的快速鑒定，多采用不同引物，對(duì)不同致病菌鑒定，操作煩瑣。本研究建立的焦磷酸測(cè)序?qū)?種致病菌的快速鑒定方法，僅采用一條通用引物，即可同時(shí)滿足對(duì)5種致病菌的快速鑒定，操作更方便，鑒定時(shí)間更短，可大大提高鑒定效率。

3.3??? 不足之處及今后探索的方向

因本研究實(shí)驗(yàn)室菌株有限，該方法僅驗(yàn)證了7種致病菌，測(cè)序后其中5種致病菌均能得到良好的測(cè)序結(jié)果。未能實(shí)現(xiàn)對(duì)更多致病菌的鑒定研究。今后將繼續(xù)探索研究，希望能夠建立焦磷酸測(cè)序?qū)Ω嘀虏【耐ㄓ描b定方法，為實(shí)驗(yàn)室快速鑒定致病菌提供更多的參考。

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