張樂(lè)，張思宇，王亞露，李剛，楊殿林，趙建寧 *

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津 300191；2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部產(chǎn)地環(huán)境污染防控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/天津市農(nóng)業(yè)環(huán)境與農(nóng)產(chǎn)品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300191）

磷是地球生命系統(tǒng)的主要營(yíng)養(yǎng)元素之一，也是生態(tài)系統(tǒng)常見(jiàn)的營(yíng)養(yǎng)限制因子。磷素是植物必需的大量無(wú)機(jī)營(yíng)養(yǎng)元素，在植物體內(nèi)的含量通常僅次于氮和鉀，對(duì)于植物生長(zhǎng)代謝有非常重要的作用。但是世界上絕大部分農(nóng)田土壤嚴(yán)重缺乏作物可利用的有效態(tài)磷。據(jù)報(bào)道全世界13.19 億hm的耕地中約有43%缺磷，我國(guó)1.07 億hm農(nóng)田中大約有2/3 嚴(yán)重缺磷。然而土壤總磷資源豐富，但其主要以無(wú)法直接被作物吸收利用的不溶態(tài)和難溶態(tài)形式存在，可供植株吸收利用的可溶性無(wú)機(jī)態(tài)磷酸鹽含量嚴(yán)重缺少，因此提高作物對(duì)農(nóng)田土壤中磷素的高效利用有重要的研究意義和價(jià)值。

為了解決大面積農(nóng)田土壤有效磷缺失的現(xiàn)狀，基于土壤中磷素的分布情況，當(dāng)前主要從3個(gè)方面提高作物對(duì)農(nóng)田土壤磷素的利用效率：第一個(gè)方面是施加磷肥，補(bǔ)充農(nóng)田土壤中的磷素；第二方面是利用解磷微生物生產(chǎn)解磷菌劑，解磷微生物的發(fā)現(xiàn)為解磷肥料的生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)；第三方面是培育磷高效作物品種，通過(guò)一些傳統(tǒng)雜交育種手段及現(xiàn)代生物技術(shù)手段培育出對(duì)土壤磷素有更高吸收利用效率的品種。雖然施加磷肥在一定程度上緩解了大面積農(nóng)田土壤有效磷缺失的現(xiàn)狀，但是研究表明磷肥在施用農(nóng)田后大部分會(huì)轉(zhuǎn)化成溶解度較低的鈣化態(tài)磷和閉蓄態(tài)磷，同時(shí)由于磷在土壤中的擴(kuò)散系數(shù)很低且受土壤對(duì)磷的吸附和固化作用等因素的影響，土壤中的有效態(tài)磷含量依然很低，可供作物直接吸收利用的磷素十分有限，磷素水平依舊制約著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。而且由于磷肥的消耗，可供生產(chǎn)的磷礦資源日益緊張。在未來(lái)的研究工作中，從提高土壤磷素的吸收效率出發(fā)，生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)解磷菌劑和培育磷高效作物品種將更加具有現(xiàn)實(shí)意義。

土壤微生物是土壤中數(shù)量最大、種類(lèi)最豐富的生物類(lèi)群，在土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化和結(jié)構(gòu)形成中發(fā)揮著重要的作用，其中有一類(lèi)可以將植物無(wú)法吸收的有機(jī)磷轉(zhuǎn)化為可吸收無(wú)機(jī)磷形態(tài)的功能微生物類(lèi)群被稱(chēng)為解磷菌（Phosphate-solubilizing microorganisms，PSM）。解磷菌不僅種類(lèi)繁多，而且在自然界中數(shù)量也十分龐大，是一項(xiàng)非常值得開(kāi)發(fā)研究的資源。1903 年STALSTROM 發(fā)現(xiàn)土壤中存在的某些微生物具有解磷作用，目前已發(fā)現(xiàn)在自然界中存在著大量具有解磷作用的微生物，包括細(xì)菌、真菌、放線(xiàn)菌及藍(lán)藻。世界上應(yīng)用最早且最廣的具有解磷作用的微生物是巨大芽孢桿菌，在后續(xù)的研究中，各類(lèi)芽孢桿菌、假單胞菌和一些桿菌及部分真菌也被開(kāi)發(fā)利用為菌劑菌肥，這些微生物在生物肥料的生產(chǎn)中得到了廣泛的應(yīng)用。

磷高效轉(zhuǎn)基因水稻品種OsPT4，是利用生物技術(shù)手段將水稻高親和磷酸鹽轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因?qū)胧荏w而獲得的磷高效吸收型水稻，由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)資源與環(huán)境學(xué)院培育。OsPT4通過(guò)編碼磷高效轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白編碼基因合成磷高效轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，從而提高了其對(duì)土壤中有效磷的吸收消耗速率。在此基礎(chǔ)上開(kāi)發(fā)解磷菌劑增加土壤有機(jī)磷水解是否可以進(jìn)一步提升其磷素利用效率？為此本研究以磷高效轉(zhuǎn)基因水稻OsPT4為試驗(yàn)材料，利用改良的蒙金娜有機(jī)磷選擇培養(yǎng)基分離OsPT4根際土壤中的高效解有機(jī)磷菌株，初步探究其解磷能力和溶磷特性，并通過(guò)與傳統(tǒng)大田作物中分離獲得的解磷菌資源進(jìn)行比較判斷，以其應(yīng)用可行性和價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣品采集

從2014 年開(kāi)始在農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所內(nèi)的網(wǎng)室中進(jìn)行磷高效轉(zhuǎn)基因水稻OsPT4 連續(xù)種植實(shí)驗(yàn)，目前已連續(xù)種植7 年。土壤樣品為2020 年9月采集的磷高效轉(zhuǎn)基因水稻OsPT4根際土壤，使用直徑3.5 cm 的土鉆在距水稻主莖2 cm 處采集0~20 cm深的土壤。

1.1.2 培養(yǎng)基

改良的蒙金娜有機(jī)磷固體培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，（NH）SO0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO·7HO 0.3 g，F(xiàn)eSO·7HO 0.03 g，MnSO·4HO 0.03 g，卵磷脂0.2 g，CaCO5.0 g，酵母膏 0.4 g，瓊脂 20 g，ddHO 1 000 mL，pH為7.0~7.5（液體培養(yǎng)基不加瓊脂）。

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨 1 g，酵母 0.5 g，NaCl 1 g，ddHO 100 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 解有機(jī)磷菌株的分離純化

稱(chēng)取1.0 g根際土壤樣品，加入9 mL無(wú)菌水，渦旋混勻30 s，靜置10 min。吸取1 mL 土壤懸液，加入49 mL 配制好的蒙金娜有機(jī)磷液體培養(yǎng)基，30 ℃、160 r·min振蕩培養(yǎng)24 h。吸取1 mL 培養(yǎng)好的菌液按照10~10進(jìn)行連續(xù)10倍梯度稀釋?zhuān)謩e涂布在蒙金娜有機(jī)磷固體培養(yǎng)基上，每個(gè)梯度設(shè)置3 個(gè)平行。在30 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d，確定10為最佳稀釋倍數(shù)。按照上述方法和最佳稀釋倍數(shù)將土壤樣品進(jìn)行解有機(jī)磷菌株的分離，挑取產(chǎn)生溶磷圈的單菌落進(jìn)行劃線(xiàn)純化3~5 代獲得純菌株，將純菌株在LB 培養(yǎng)基中擴(kuò)增培養(yǎng)后使用甘油法保存。

1.2.2 解有機(jī)磷菌株的菌落特征觀(guān)察和可溶性指數(shù)的測(cè)定

將分離得到的純菌株點(diǎn)接到蒙金娜固體有機(jī)磷培養(yǎng)基上，30 ℃恒溫培養(yǎng)3 d，觀(guān)察菌落形態(tài)特征，參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》對(duì)菌株進(jìn)行初步鑒定。分別測(cè)定菌落直徑和溶磷圈直徑以計(jì)算可溶性指數(shù)，初步判斷解有機(jī)磷菌株的解磷能力。計(jì)算公式為：

可溶性指數(shù)=溶磷圈直徑/菌落直徑

1.2.3 解有機(jī)磷菌株24 h解磷量和溶磷特性的測(cè)定

挑選產(chǎn)生明顯溶磷圈的解磷菌株進(jìn)行解磷量、pH 和堿性磷酸酶的測(cè)定。將各菌株分別接種于LB液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r·min培養(yǎng)7 h，然后用分光光度計(jì)調(diào)整菌液濃度至OD=0.6。分別吸取750μL菌懸液加入到15 mL 蒙金娜液體培養(yǎng)基中，37 ℃、180 r·min振蕩培養(yǎng)24 h（每個(gè)菌株3 組重復(fù)），取10 mL 培養(yǎng)液用酸度計(jì)測(cè)定pH，剩余培養(yǎng)液4 ℃、12 000 r·min離心 5 min 獲得上清液。取 2 mL 上清液用鉬銻抗顯色法測(cè)定有效磷含量。另取0.5 mL 上清液用堿性磷酸酶活性檢測(cè)試劑盒（BOXBIO）測(cè)定堿性磷酸酶活性。

1.2.4 解有機(jī)磷菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)的測(cè)定

將解有機(jī)磷菌株分別接種到LB 液體培養(yǎng)基，37 ℃、180 r·min培養(yǎng)7 h，然后使用分光光度計(jì)調(diào)整菌液濃度至OD=0.1 用于接種。在100 mL LB 液體培養(yǎng)基中接種 5 mL OD=0.1 的菌液，30 ℃、180 r·min恒溫振蕩培養(yǎng)30 h，每隔2 h監(jiān)測(cè)一次OD值并記錄，觀(guān)測(cè)菌株的生長(zhǎng)狀況并繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

1.2.5 菌株的鑒定及其同源性分析

將純化的單菌落挑入10 mL LB 液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)至菌液渾濁后，吸取菌液2 mL進(jìn)行DNA的提取。采用16S rDNA 通用引物27F 和1492R 進(jìn)行16S rDNA基因序列的擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物使用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)后，送上海生工進(jìn)行測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Excel 進(jìn)行初步整理后，用SPSS 軟件（21.0版本）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。對(duì)可溶性指數(shù)、24 h 菌株的解磷量、pH、堿性磷酸酶活性進(jìn)行單因素方差分析和LSD 多重比較（<0.05 表示差異顯著）。使用Origin 軟件（2018 版本）繪制菌株24 h 解磷量、pH 和堿性磷酸酶圖，并擬合6 株菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。菌株鑒定測(cè)序結(jié)果通過(guò)Blast 程序與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，下載同源性高的序列使用MEGA 軟件（7.0 版本）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 解有機(jī)磷菌株的篩選純化

采用傳統(tǒng)微生物分離培養(yǎng)方法，使用蒙金娜固體有機(jī)磷培養(yǎng)基對(duì)磷高效轉(zhuǎn)基因水稻OsPT4 根際土壤中的解有機(jī)磷菌株進(jìn)行分離，共獲得15 株解有機(jī)磷菌株（圖1a），分別命名為Y1~Y15。經(jīng)過(guò)純化培養(yǎng)3代后獲得6 株解磷能力較強(qiáng)且生長(zhǎng)穩(wěn)定的菌株（圖1b），分別是Y1、Y4、Y6、Y7、Y11、Y13，對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步解磷能力和溶磷特性的研究。

圖1 解有機(jī)磷菌株的篩選Figure 1 Screening picture of solution organophosphorus hydrolyzing strains

2.2 菌株的菌落特征觀(guān)察

從菌落的形狀、大小、顏色等方面觀(guān)察6 株解有機(jī)磷菌株單菌落的形態(tài)特征并記錄，初步判斷6 株菌株均為革蘭氏陰性細(xì)菌（表1）。

表1 6株解有機(jī)磷菌株菌落形態(tài)特征Table 1 Colony morphological characteristics of 6 strains of organophosphorus hydrolyzing bacteria

2.3 解有機(jī)磷菌株的解磷能力

可溶性指數(shù)和24 h 解磷量常作為表征菌株解磷能力的指標(biāo)?？扇苄灾笖?shù)結(jié)果顯示：6 株解有機(jī)磷菌株的解磷能力之間存在一定差異，可溶性指數(shù)由大到小排序?yàn)閅7>Y11>Y1>Y13>Y4>Y6，Y7 菌株的可溶性指數(shù)最高為6.33，其次的Y11 為3.81（表2）。另外，對(duì)6 株解有機(jī)磷菌株的解磷能力進(jìn)行定量分析，結(jié)果表明Y7 培養(yǎng)24 h 后的菌液中的無(wú)機(jī)磷濃度達(dá)到87.43 mg·L（圖2），顯著高于其他5個(gè)菌株。

圖2 6株解有機(jī)磷菌株培養(yǎng)24 h的解磷量Figure 2 Phosphorus solubility of the 6 organophosphorus hydrolyzing strains

表2 6株解有機(jī)磷菌株的可溶性指數(shù)Table 2 Disolving phosphate zone diameter to culture community zone diameter of organophosphorus hydrolyzing bacteria

2.4 解有機(jī)磷菌株的溶磷特性

酸化作用和堿性磷酸酶作用是解磷菌溶磷的主要機(jī)制。各菌液在培養(yǎng)24 h 后pH 均有所降低，表現(xiàn)為酸性，Y7 菌株的pH 下降最顯著，為3.42，各菌株培養(yǎng)24 h 后菌液pH 由大到小的排序?yàn)閅11>Y6>Y1>Y13>Y4>Y7（圖3a）。培養(yǎng)24 h 菌液中的堿性磷酸酶活性結(jié)果顯示（圖3b）：6 株解有機(jī)磷菌株之間分泌堿性磷酸酶的能力存在一定的差異，Y11菌株分泌堿性磷酸酶的能力最強(qiáng)，為38.69 μg·mL·h，其次是Y7菌株，為36.20 μg·mL·h，堿性磷酸酶活性由大到小排序?yàn)閅11>Y7>Y4>Y13>Y6>Y1。

圖3 6株解有機(jī)磷菌株培養(yǎng)24 h后菌液的pH和堿性磷酸酶活性Figure 3 The pH and alkaline phosphatase activity of the 6 organophosphorus hydrolyzing strains

2.5 解有機(jī)磷菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)

各菌株生長(zhǎng)曲線(xiàn)均可分為3 個(gè)時(shí)期，即指數(shù)生長(zhǎng)期、平穩(wěn)增長(zhǎng)期和緩慢衰落期。在培養(yǎng)的前8 h中，菌落環(huán)境和營(yíng)養(yǎng)條件適宜，菌株以指數(shù)倍數(shù)快速增長(zhǎng)，在8~26 h 內(nèi)以平穩(wěn)速度緩慢增長(zhǎng)，在第26 h 達(dá)到頂峰，隨后受營(yíng)養(yǎng)條件的限制速度開(kāi)始緩慢下降。其中Y1 和 Y4 增長(zhǎng)稍緩慢，Y6、Y7、Y11 和 Y13 增長(zhǎng)速度基本一致（圖4）。

圖4 6株解有機(jī)磷菌株的生長(zhǎng)曲線(xiàn)Figure 4 Growth curve of 6 organophosphorus hydrolyzing strains

2.6 解有機(jī)磷菌株的鑒定

經(jīng)16S rDNA擴(kuò)增子基因序列測(cè)序分析（圖5），結(jié)果發(fā)現(xiàn)：6 株菌株屬于不動(dòng)桿菌屬（）、假單胞菌屬（）、腸桿菌屬（）和泛菌屬（）4 個(gè)菌屬。Y6 與 Y13 的親緣關(guān)系較近，同屬腸桿菌屬；Y4 和Y11 的親緣關(guān)系較近，同屬假單胞菌屬。

圖5 6株解有機(jī)磷菌株的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)Figure 5 Phylogenetic tree of established based on 16S rDNA sequences of 6 organophosphorus hydrolyzing strains

3 討論

解磷微生物在土壤磷素循環(huán)中具有重要作用，解磷微生物的分布具有明顯的根際效應(yīng)，且受到土壤類(lèi)型、環(huán)境因子和種植作物類(lèi)型等多因素的影響。本研究從OsPT4根際土壤中共分離獲得15株解有機(jī)磷菌株，在后續(xù)分離純化過(guò)程中僅6株能在有機(jī)磷培養(yǎng)基上穩(wěn)定生長(zhǎng)且形成明顯的透明圈。有研究發(fā)現(xiàn)，約60%初篩得到的有解磷能力的菌株在后續(xù)純化培養(yǎng)過(guò)程中失去解磷能力，其原因可能是不同菌株對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性和對(duì)磷素的要求有一定差異。此外，6株菌株的生長(zhǎng)特性和活性基本保持一致，生長(zhǎng)曲線(xiàn)均符合微生物培養(yǎng)特點(diǎn)，即在有限資源的條件下培養(yǎng)階段分為指數(shù)生長(zhǎng)期、平穩(wěn)增長(zhǎng)期和緩慢衰落期3個(gè)階段。

解磷能力是篩選解磷菌資源的基本標(biāo)準(zhǔn)。聶振等從我國(guó)南方水稻根際土中分離的24 株解磷菌株的發(fā)酵液的可溶性總磷含量為23.7~79.3μg·mL，張廣志等從設(shè)施菜地土壤中分離獲得的14 株解磷菌株的平均解磷量為48.7 mg·L，莊馥璐等從蘋(píng)果根際分離獲得的10株解磷菌株的可溶性指數(shù)在1.5~5.3之間，解磷量最高為104.125 mg·L。本研究OsPT4根際土中分離獲得的6 株解磷菌的可溶性指數(shù)為1.50~6.33，培養(yǎng)24 h 后培養(yǎng)液中的有效磷含量為10.60~87.43 mg·L，解磷能力與上述研究中篩選得到的菌株相當(dāng)，其中Y7 菌株在可溶性指數(shù)和解磷量上均表現(xiàn)最好，解磷能力在上述解磷菌株中也屬于較高水平，為高效解磷菌資源。

不同菌株在不同培養(yǎng)條件下的解磷能力有差異，菌株之間的溶磷特性也不完全相同。目前，相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)解磷菌解磷主要有兩大機(jī)制：一是部分微生物可以分泌出有機(jī)酸、硫化物、H等酸性物質(zhì)降低生長(zhǎng)環(huán)境的pH，從而使難溶性磷酸鹽溶解；二是在受到磷限制時(shí)，一些微生物可以分泌釋放胞外磷酸酶水解有機(jī)磷。通過(guò)測(cè)定培養(yǎng)24 h 后菌液的pH 和堿性磷酸酶活性分析菌株的解磷特性發(fā)現(xiàn)，Y7 菌株的解磷機(jī)制主要為酸化作用和堿性磷酸酶作用，而Y11菌株解磷的主要機(jī)制是堿性磷酸酶作用，其他菌株在分泌堿性磷酸酶活性方面差異不顯著，pH 降低量與解磷能力有一定的相關(guān)性。

從大田作物中篩選獲得的常見(jiàn)解磷微生物種類(lèi)主要有芽孢桿菌、不動(dòng)桿菌、假單胞菌、埃希氏菌、歐文氏菌、沙雷氏菌和腸桿菌等菌屬。從OsPT4根際土中篩選獲得的6株高效解有機(jī)磷菌株在分類(lèi)上，Y1屬于不動(dòng)桿菌屬，Y6和Y13屬于腸桿菌屬，Y4和Y11為假單胞菌屬，5 株菌株均為常見(jiàn)的解磷菌類(lèi)別。特殊的是解有機(jī)磷能力最強(qiáng)的Y7菌株屬于泛菌屬，雖然目前從水稻土壤中分離獲得高效解磷泛菌菌株的研究較少，但相關(guān)研究表明泛菌在自然界中分布廣泛，可以從水中和土壤中分離獲得，且在研究中其常作為水稻、大麥、蘿卜等大田作物的種子內(nèi)生菌核心類(lèi)群，多個(gè)類(lèi)型的泛菌都具有解磷能力和分泌IAA的能力，對(duì)植物具有促生作用和抵抗真菌性病害的功能。

4 結(jié)論

從磷高效轉(zhuǎn)基因水稻根際土壤中分離獲得15 株解有機(jī)磷菌株，純化復(fù)篩后獲得6 株可以在有機(jī)磷培養(yǎng)基上產(chǎn)生明顯透明圈的解有機(jī)磷菌株。6 株菌株在解磷能力上與大田作物中分離獲得的解磷菌解磷能力相當(dāng)，其中Y7 菌株表現(xiàn)最好，可溶性指數(shù)高達(dá)6.33，在 24 h 內(nèi)的解磷量達(dá)到87.43 mg·L，為高效解磷菌資源。除菌株Y7 外的5 株菌株均為大田土壤中可分離獲得的常見(jiàn)解磷菌類(lèi)別，Y7 屬于水稻種子內(nèi)生菌核心類(lèi)群泛菌屬（），酸化作用和堿性磷酸酶作用是其主要的解磷機(jī)制。另外，磷高效轉(zhuǎn)基因水稻的種植對(duì)有效磷消耗效率的影響是否改變了根系土壤中的解磷菌群落結(jié)構(gòu)，使泛菌等類(lèi)群菌株的相對(duì)豐度增加則需要基于現(xiàn)代分子生物學(xué)方法對(duì)解磷微生物整體群落進(jìn)行進(jìn)一步研究。