趙玉潔, 黃舒欣, 翁澤平, 盧育洪, 李揚(yáng)秋*, 陳少華*

(暨南大學(xué) 1.基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與公共衛(wèi)生學(xué)院 血液學(xué)研究所; 2.附屬第一醫(yī)院 病理科; 3.附屬第一醫(yī)院 血液科， 廣東 廣州 510632)

近年來(lái)，基于免疫檢查點(diǎn)受體抑制劑的抗腫瘤免疫治療取得了很大的成功，延長(zhǎng)了多種晚期腫瘤(如非小細(xì)胞肺癌、黑色素瘤和非霍奇金淋巴瘤)患者的生存時(shí)間[1]。免疫檢查點(diǎn)抑制劑主要通過(guò)阻斷T細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的免疫抑制性信號(hào)，逆轉(zhuǎn)腫瘤患者T細(xì)胞耗竭狀態(tài)，重塑T細(xì)胞抗腫瘤功能，以及削弱腫瘤免疫抑制微環(huán)境等而發(fā)揮作用[2]。T細(xì)胞耗竭是腫瘤患者T細(xì)胞免疫功能不全的主要原因，已知免疫檢查點(diǎn)分子如程序性細(xì)胞死亡蛋白 1(programmed death 1，PD-1)和T免疫球蛋白及黏蛋白分子3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-containing molecule 3，Tim-3)等異常高表達(dá)是導(dǎo)致T細(xì)胞耗竭的關(guān)鍵因素[3-4]，T細(xì)胞上表達(dá)的免疫抑制檢查點(diǎn)分子越多，T細(xì)胞耗竭程度越嚴(yán)重，但是其相關(guān)調(diào)控機(jī)制依然不甚清楚。胸腺細(xì)胞選擇相關(guān)高遷移率族蛋白(thymocyte selection-associated high mobility group box protein, TOX)基因編碼的蛋白是high mobility group box(HMG-box)蛋白超家族的一員，是近期發(fā)現(xiàn)的與T細(xì)胞耗竭有關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，在T細(xì)胞的發(fā)育過(guò)程中起重要作用[5-6]。Kim等[7]研究報(bào)道TOX可能參與了多種惡性腫瘤的形成，且與CD8+耗竭性T細(xì)胞的產(chǎn)生有關(guān)，在實(shí)體瘤中高表達(dá)的TOX可以促進(jìn)CD8+T細(xì)胞的耗竭，并與多個(gè)免疫抑制性受體分子(immune checkpoint, IC)如PD-1和Tim-3等表達(dá)上調(diào)有關(guān)；黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌患者腫瘤浸潤(rùn)C(jī)D8+T細(xì)胞高表達(dá)TOX 的同時(shí)高表達(dá)PD-1、Tim-3、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4, CTLA-4)、淋巴細(xì)胞活化基因3(lymphocyte-activation gene 3, LAG-3)和含Ig 及 ITIM 結(jié)構(gòu)域的 T 細(xì)胞免疫受體(T cell Immunoreceptor with Ig and ITIM domains, TIGIT)等IC分子。此外，TOX表達(dá)水平還與抗PD-1的免疫治療療效呈負(fù)相關(guān)，敲除TOX基因可以下調(diào)IC分子的表達(dá)，削弱CD8+T細(xì)胞的耗竭程度[8-9]。

母細(xì)胞性漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞腫瘤(blastic plasmacytoid dendritic cell neoplasm, BPDCN)，起源于惡性漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞的前體細(xì)胞，是一種罕見(jiàn)的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，患者常表現(xiàn)為無(wú)癥狀、孤立或多個(gè)皮膚病變，可引起淋巴結(jié)、脾臟和骨髓受累[10]，預(yù)后差，目前尚無(wú)共識(shí)的治療方法。Aung等[11]研究報(bào)道BPDCN高表達(dá)程序性死亡配體 1(programmed death-ligand 1, PD-L1)，并與PD-1的表達(dá)相關(guān)。由于其發(fā)病率低，有關(guān)BPDCN細(xì)胞免疫狀態(tài)的相關(guān)報(bào)道還較少。故本研究擬通過(guò)多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)建立分析PD-1、Tim-3和CD244等耗竭性T細(xì)胞亞群中的TOX免疫表型特點(diǎn)，同時(shí)結(jié)合臨床分析TOX在1例罕見(jiàn)CD4-CD56+表型的BPDCN患者骨髓及外周血耗竭性T細(xì)胞亞群中的分布特點(diǎn)，探討B(tài)PDCN患者腫瘤微環(huán)境T細(xì)胞免疫抑制狀態(tài)。

1 材料與方法

1.1 樣本資料

在知情同意和通過(guò)醫(yī)院倫理委員會(huì)(批準(zhǔn)文號(hào)：〔2015〕倫審批科009)批準(zhǔn)情況下，收集來(lái)自暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科11例健康成年人體檢外周血(peripheral blood,PB)(其中男性6例，女性5例，中位年齡51歲)，作為PB對(duì)照組；收集廣東省人民醫(yī)院2例脊柱外科非腫瘤手術(shù)患者和血液科1例健康供者的骨髓(bone marrow,BM)(其中男性1例，女性2例，中位年齡68歲)，作為BM對(duì)照組;并收集暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科1例免疫表型為CD4-CD56+的BPDCN患者BM及PB(患者女性，65歲)(表1，圖1)。

表1 BPDCN患者的臨床診斷結(jié)果Table 1 Clinical diagnosis of the BPDCN patient

A：BPDCN患者的臨床流式檢查結(jié)果；B：骨髓涂片;C: 骨髓病理圖像A: Immunophenotypic characteristics of the BPDCN patient by flow cytometry; B: Bone marrow smear; C: Bone marrow pathological image圖1 1例BPDCN患者臨床檢查結(jié)果Figure 1 Clinical examination results of one patient with BPDCN

BPDCN的診斷主要依賴于病理活檢和免疫組織化學(xué)檢查，通過(guò)流式細(xì)胞學(xué)檢測(cè)的細(xì)胞表型也對(duì)最終的確診起重要作用。BPDCN的一個(gè)免疫表型特征是有CD4和CD56的共表達(dá)，同時(shí)缺少T細(xì)胞、B細(xì)胞、髓系和單核細(xì)胞家族的特異性標(biāo)志分子[12]，而本研究收集的1例BPDCN具有免疫表型特殊性，是更為罕見(jiàn)的CD4-CD56+表型。有文獻(xiàn)報(bào)道，如果5種主要的細(xì)胞表面抗原(CD4、CD56、CD123、TCL1和CD303)中的4種呈陽(yáng)性，則可以很大程度上確定BPDCN的診斷[13-14]。Ascani等[15]的研究顯示，存在CD4-或者CD56-的BPDCN病例，本實(shí)驗(yàn)中的BPDCN患者腫瘤細(xì)胞免疫表型就較為特殊，檢測(cè)結(jié)果顯示：該患者存在70.68%的異常漿細(xì)胞樣樹(shù)突狀細(xì)胞(plasmacytoid dendritic cells, pDCs)，表達(dá)CD56、CD123、CD303，不表達(dá)MPO、CD19、CD3、CD5，CD4，這與已報(bào)道的大多數(shù)BPDCN病例的經(jīng)典免疫表型有所不同。該患者檢測(cè)的流式、骨髓涂片和病理活檢結(jié)果如圖1所示。病理活檢提示該患者傾向骨髓纖維化病變，骨髓涂片可見(jiàn)到較多的腫瘤細(xì)胞。

1.2 試劑與儀器

單克隆抗體CD45-BV605、CD3-APC-Cy7、CD8-APC-R700、CD25-BB515、PD-1-PE-Cy7、FoxP3-BB700及相應(yīng)同型對(duì)照、細(xì)胞染色緩沖液、補(bǔ)償微球、裂紅液、Transcription Factor Buffer Set(用于配制1×Fix/Perm Buffer和1×Perm/Wash Buffer)均購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司，CD4-BV510、 Tim-3-BV421、CD244-PE及相應(yīng)同型對(duì)照購(gòu)自美國(guó)BioLegend公司，TOX-eFluor660和相應(yīng)同型對(duì)照購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司。PBS購(gòu)自廣州晶欣生物科技有限公司。BD FACSCanto流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD Biosciences公司。

1.3 PD-1、Tim-3和CD244耗竭性T細(xì)胞亞群中的TOX免疫表型流式細(xì)胞檢測(cè)

1.3.1 樣本制備

采用2～3 mL EDTA抗凝管收集患者和健康者的骨髓和外周血，取100 μL全血分別置于同型對(duì)照流式管和全染流式管中備用，12 h內(nèi)染色并上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2 流式單克隆抗體染色

將流式單抗CD45-BV605、CD3-APC-Cy7、CD4-BV510、CD8-APC-R700、CD25-BB515、PD-1-PE-Cy7、Tim-3-BV421、CD244-PE按說(shuō)明書(shū)用量依次加入100 μL細(xì)胞染色緩沖液中后與全染管中的血樣混勻，CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、PD-1、Tim-3、CD244等相應(yīng)同型對(duì)照也按照說(shuō)明書(shū)用量依次加入100 μL細(xì)胞染色緩沖液中后與同型對(duì)照管中的血樣混勻，避光孵育15 min；表面染色完成后，每管分別加入2 mL 1×裂紅液，室溫避光孵育10～15 min，離心去上清；流式管中加入2 mL 1×PBS，再次離心去上清；1 mL 1×Fix/Perm Buffer對(duì)細(xì)胞進(jìn)行固定破膜，4 ℃避光孵育30 min；然后加入2 mL 1×Perm/Wash Buffer離心去上清；加入TOX-eFluor660、FoxP3-BB700及同型對(duì)照加入對(duì)應(yīng)流式管中，進(jìn)行細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子染色，4 ℃避光孵育30 min；再次加入2 mL 1×Perm/Wash Buffer 離心去上清；最后，將細(xì)胞重懸于200～500 μL 1×PBS中，等待上機(jī)。

1.3.3 流式細(xì)胞術(shù)分析

采用BD FACSCanto流式細(xì)胞儀進(jìn)行上機(jī)檢測(cè)，使用未經(jīng)染色的全血細(xì)胞懸液和單染CD45-BV605、CD3-APC-Cy7、CD4-BV510、CD8-APC-R700、CD25-BB515、FoxP3-BB700、TOX-eFluor660、PD-1-PE-Cy7、Tim-3-BV421、CD244-PE單陽(yáng)管調(diào)節(jié)各通道的電壓及熒光補(bǔ)償，至少收集30 000個(gè)CD3+CD45+細(xì)胞用于分析，收集原始數(shù)據(jù)利用FlowJo軟件(Becton, Dickinson and Company，美國(guó))進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 25.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，結(jié)果以中位數(shù)表示；采用兩樣本秩和檢驗(yàn)進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，P<0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PD-1、Tim-3和CD244耗竭性T細(xì)胞亞群中TOX表型方法的建立

利用健康者PB和BM樣本建立PD-1、Tim-3和CD244耗竭性T細(xì)胞亞群中TOX表型多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)法，首先通過(guò)細(xì)胞大小及胞內(nèi)復(fù)雜程度圈定淋巴細(xì)胞群，經(jīng)FSC-H/FSC-A去除死細(xì)胞和黏連細(xì)胞，利用CD45、CD3、CD4、CD8、CD25、FoxP3等分子劃定不同T細(xì)胞亞群，進(jìn)而分析TOX在各耗竭表型T細(xì)胞亞群中的比例和分布情況。在檢測(cè)中，根據(jù)SSC/FSC確定細(xì)胞群主體位置，設(shè)定坐標(biāo)軸閾值，達(dá)到收集同時(shí)排除非目標(biāo)細(xì)胞的目的，同時(shí)本研究設(shè)置了單克隆抗體單染管、全染管和相應(yīng)的同型對(duì)照管，以同型管分子陽(yáng)性比例<1%為準(zhǔn)劃分陰陽(yáng)兩群，通過(guò)各流式分子單染管調(diào)節(jié)各通道電壓，各單染管記錄5 000個(gè)細(xì)胞后調(diào)整各通道補(bǔ)償，使細(xì)胞群顯示位置清晰居中，精確設(shè)門(mén)位置，通過(guò)優(yōu)化后均可獲得界限清晰的細(xì)胞群(圖2)。

圖2 TOX在1例健康者骨髓PD-1、Tim-3和CD244耗竭性T細(xì)胞亞群中分布的流式邏輯分析圖Figure 2 The analytic logic of the detection of TOX in PD-1, Tim-3 and CD244 exhausted T cell subsets in BM of one HI

3例健康者BM和11例健康者PB的檢測(cè)結(jié)果分析顯示，TOX在健康者BM和PB CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD25+FoxP3+調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells, Treg)中均能被檢測(cè)到，但比例較低，分布頻率存在一定的個(gè)體差異，此外，TOX+PD-1+, TOX+Tim-3+，TOX+CD244+細(xì)胞在健康者BM和PB CD3+、CD4+、CD8+、CD4+CD25+FoxP3+Treg等T細(xì)胞亞群中的分布比例較低，經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示，兩組中只有TOX+Tim-3+CD8+T細(xì)胞比例存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.022)，這可能與BM的樣本數(shù)量較少有一定關(guān)系(表2)。

表2 TOX與 PD-1、Tim-3、CD244在健康者BM和PB T細(xì)胞亞群中的分布情況Table 2 Distribution of TOX expression and co-expression with PD-1, Tim-3, and CD244 in T cell subsets from BM and PB of HIs %

2.2 BPDCN患者BM和PB中TOX在PD-1、Tim-3和CD244耗竭性T細(xì)胞亞群中的分布情況

對(duì)1例罕見(jiàn)的CD4-CD56+表型BPDCN患者BM(圖3)和PB進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，BPDCN患者BM和PB中TOX+CD3+(10.9%、28.4%)、TOX+CD4+(8.32%、35.7%)、TOX+CD8+T(16.3%、29.8%)和TOX+CD4+CD25+FoxP3+Treg(15.3%、47.1%)細(xì)胞比例比對(duì)照組明顯升高；進(jìn)一步分析顯示，TOX+細(xì)胞在BPDCN患者BM和PB中PD-1+CD3+(8.32%、18.3%)、Tim-3+CD3+(4.60%、14.2%)、CD244+CD3+(4.52%、8.27%)、PD-1+CD4+(6.82%、22.2%)、Tim-3+CD4+(3.78%、21.9%)、CD244+CD4+(0.66%、5.61%)、PD-1+CD8+(11.6%、15.7%)、Tim-3+CD8+(5.29%、17.8%)、CD244+CD8+(13.9%、22.4%)、PD-1+CD4+CD25+FoxP3+Treg(9.53%、30.0%)、Tim-3+CD4+CD25+FoxP3+Treg(6.10%、35.7%)和CD244+CD4+CD25+FoxP3+Treg(0.26%、7.14%)耗竭性T細(xì)胞亞群中的分布比例也顯著高于對(duì)照組 (圖4)。此外，CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞在BPDCN患者BM(22.2%)和PB(4.14%)中比例相較于對(duì)照組(中位數(shù)：0.89%、1.61%)均明顯升高。

圖3 BPDCN患者BM中TOX在PD-1、Tim-3和CD244耗竭性T細(xì)胞亞群中的流式分析圖Figure 3 The analytic logic of TOX expression and co-expression with PD-1, Tim-3 and CD244 in T cell subsets in BM of the BPDCN patient

A-B：TOX+細(xì)胞分別在BPDCN患者及健康者的BM和PB中的分布情況；C-J：TOX+CD244+、PD-1+、Tim-3+細(xì)胞分別在BPDCN患者及健康者BM和PB CD3+T、CD4+T、CD8+T、CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞中的分布情況A-B: The frequency of TOX expression in BM and PB from the BPDCN patient and healthy individuals；C-J：The frequency of TOX co-expression with PD-1, Tim-3, and CD244 in CD3+T/CD4+T/CD8+T/CD4+CD25+FoxP3+Treg cells in BM and PB from the BPDCN patient and healthy individuals圖4 TOX與PD-1、 Tim-3、CD244耗竭性T細(xì)胞在1例BPDCN患者和健康者BM和PB中的分布情況Figure 4 The distribution and frequency of TOX expression and co-expression with PD-1, Tim-3, and CD244 in T cell subsets in BM and PB from the BPDCN patient and HIs

3 討論

近年來(lái)研究表明TOX的調(diào)節(jié)紊亂在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色[7,16-18]。在腫瘤中高表達(dá)的TOX是CD8+T細(xì)胞耗竭形成的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子[7]，在一些實(shí)體瘤的腫瘤浸潤(rùn)性CD8+T細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，TOX表達(dá)增加伴隨PD-1等免疫抑制分子的高表達(dá)[16]。目前有關(guān)TOX在血液腫瘤中的研究還較少，為了更好地了解血液惡性腫瘤的免疫學(xué)特點(diǎn)，本研究首先在既往建立了免疫檢查點(diǎn)受體如PD-1和Tim-3，以及耗竭表型分子如CD244和CD57表型T細(xì)胞流式檢測(cè)法而了解健康者T細(xì)胞耗竭分布特點(diǎn)和急性髓細(xì)胞白血病等患者T細(xì)胞耗竭特點(diǎn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步通過(guò)健康成年人外周血和骨髓樣本建立PD-1、Tim-3和CD244耗竭性T細(xì)胞亞群中TOX免疫表型多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)法。流式細(xì)胞術(shù)作為輔助臨床診斷的檢測(cè)技術(shù)，在腫瘤患者中有較為廣泛的應(yīng)用，常用于患者血液腫瘤細(xì)胞上的表型檢測(cè)， 腫瘤患者T細(xì)胞免疫抑制性受體的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)也是目前研究的熱點(diǎn)，其結(jié)合臨床結(jié)果可以更全面的了解患者自身的免疫狀態(tài)，制定更有針對(duì)性的個(gè)體化治療方案。

BPDCN是一種臨床侵襲性血液系統(tǒng)惡性腫瘤，來(lái)源于樹(shù)突狀前體細(xì)胞，其典型特征是CD4、CD56和CD123的表達(dá)，沒(méi)有共同的淋巴或是髓系標(biāo)記物，預(yù)后極差。BPDCN的治療目前尚沒(méi)有統(tǒng)一治療標(biāo)準(zhǔn)，最常用的仍然是急性髓細(xì)胞白血病/急性淋巴細(xì)胞白血病相關(guān)治療方案，目前新興發(fā)展的靶向治療雖給BPDCN的治療帶來(lái)了新的希望，但復(fù)發(fā)和難治性BPDCN治療伴隨的嚴(yán)重的不良反應(yīng)仍然是目前研究者具有挑戰(zhàn)性的課題[20]。因此，本研究將建立的方法應(yīng)用于1例罕見(jiàn)CD4-CD56+表型的血液惡性腫瘤BPDCN的研究分析，以期更好地探討B(tài)PDCN的免疫狀態(tài)，為BPDCN患者的免疫治療提供理論基礎(chǔ)。

本研究收集的1例BPDCN患者骨髓和外周血經(jīng)流式分析發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組相比，TOX+細(xì)胞在BPDCN患者的骨髓和外周血CD3+、CD4+、CD8+T細(xì)胞亞群中比例增加，骨髓中以CD8+T細(xì)胞的占比升高最為顯著，這與TOX在實(shí)體瘤和淋巴瘤中的報(bào)道相似[17-18]，提示TOX可能是CD8+T細(xì)胞耗竭形成的原因之一。有研究顯示在多種實(shí)體瘤的腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞CD8+T細(xì)胞中PD-1高表達(dá)伴隨TOX、CD39、Tim-3和LAG-3的高表達(dá)[21-23]。而本研究在BPDCN患者的骨髓和外周血T細(xì)胞亞群中也同樣檢測(cè)到高分布頻率的TOX+PD-1+、TOX+Tim-3+和TOX+CD244+T細(xì)胞，提示TOX可能是促進(jìn)T細(xì)胞耗竭的重要轉(zhuǎn)錄因子，可以作為逆轉(zhuǎn)T細(xì)胞耗竭和改善BPDCN患者T細(xì)胞抗腫瘤效應(yīng)的潛在靶點(diǎn)。

Treg細(xì)胞在人體免疫中的作用主要是抑制異常的免疫反應(yīng)，包括感染、自身免疫性疾病、腫瘤等，以維持體內(nèi)的免疫平衡[24]。在動(dòng)物癌癥模型和臨床試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，去除小鼠體內(nèi)的CD4+CD25+Treg細(xì)胞可恢復(fù)機(jī)體對(duì)腫瘤的免疫能力[25]。Dehghani等[26]研究表明,CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞比例升高在實(shí)體瘤和血液系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)揮負(fù)免疫調(diào)節(jié)作用，并與疾病的不良預(yù)后有關(guān)。本課題組前期的研究也發(fā)現(xiàn)TOX+CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞在淋巴瘤中比例增加；本研究還同時(shí)檢測(cè)了TOX在CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞和耗竭性CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞中的分布情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BPDCN患者無(wú)論是骨髓還是外周血中TOX在Treg細(xì)胞中的比例均明顯升高，同時(shí)伴隨PD-1、Tim-3和CD244等耗竭表型的升高,這些結(jié)果提示BPDCN患者CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞呈現(xiàn)耗竭狀態(tài)。有報(bào)道PD-1+CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞共表達(dá)可增強(qiáng)負(fù)性免疫調(diào)節(jié)功能，那么TOX與PD-1、Tim-3共表達(dá)并增高是否具有協(xié)同增強(qiáng)作用？而耗竭CD4+CD25+FoxP3+Treg細(xì)胞的功能性改變或細(xì)胞比例增加是否與免疫抑制過(guò)度活化有關(guān)還尚不清楚，仍需要擴(kuò)大樣本量深入探討。

在該檢測(cè)方法的建立中，本研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的檢測(cè)，細(xì)胞核膜破膜是否成功對(duì)于實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的客觀性和穩(wěn)定性十分重要，破膜過(guò)程中維持低溫(2～8 ℃)、破膜后低溫離心、加入破膜液時(shí)充分振蕩混勻和破膜過(guò)程中適當(dāng)振蕩，可提高破膜效果。對(duì)于核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子抗體的染色，加入抗體后多次震蕩，抗體孵育過(guò)程中保持低溫可保證一定的染色效果?？紤]到細(xì)胞破膜后的質(zhì)量變化，在破膜完成后加長(zhǎng)離心時(shí)間，可以減少細(xì)胞損耗，提高收集效率。在建立模板過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，對(duì)于T細(xì)胞上不確定表達(dá)強(qiáng)度或表達(dá)較低難以在流式細(xì)胞圖上分群清晰的分子，補(bǔ)償微球單染管對(duì)于模板的成功建立有較好的輔助作用，它可在儀器上顯示清晰的陰陽(yáng)兩群以替代細(xì)胞調(diào)節(jié)電壓與補(bǔ)償，使細(xì)胞群在合適的位置上顯示[27]。對(duì)于BD FACSCanto流式細(xì)胞儀，上樣速度不宜過(guò)快，細(xì)胞數(shù)控制在1 000～3 000 event/s較佳，可有較好的收樣質(zhì)量與效率。為避免初上樣時(shí)電壓與儀器激光不穩(wěn)定等問(wèn)題，上樣之前用超純水或非實(shí)驗(yàn)用的單染管細(xì)胞懸液試跑樣，可避免因儀器不穩(wěn)定等造成的樣品浪費(fèi)或收樣數(shù)據(jù)質(zhì)量不高等問(wèn)題。

本研究成功建立了多參數(shù)流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)PD-1、Tim-3和CD244等耗竭性T細(xì)胞亞群中TOX表型的免疫表型方法，初步探討1例罕見(jiàn)表型CD4-CD56+血液惡性腫瘤BPDCN患者的T細(xì)胞免疫狀態(tài)，TOX在BPDCN患者骨髓和外周血T細(xì)胞亞群中分布頻率增高，并與 PD-1+、Tim-3+和CD244+等耗竭性T細(xì)胞共同高表達(dá)，提示TOX可能是調(diào)節(jié)BPDCN患者T細(xì)胞免疫抑制性受體表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)T細(xì)胞耗竭，影響T細(xì)胞抗白血病功能的重要轉(zhuǎn)錄因子。由于本研究樣本局限，尚需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量。本研究建立的方法可運(yùn)用于血液腫瘤的檢測(cè)，為進(jìn)一步研究患者T細(xì)胞免疫抑制特點(diǎn)提供更全面的認(rèn)識(shí)。

作者貢獻(xiàn)聲明

李揚(yáng)秋、陳少華：提出研究思路和框架，修改論文；趙玉潔、黃舒欣：設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)、統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)，撰寫(xiě)論文；盧育洪、翁澤平:提供檢測(cè)樣本及臨床結(jié)果。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助，不存在潛在利益沖突。