卓潤, 屠琪峰, 馬超, 林閣, 劉梅, 董張及

(南通大學(xué) 教育部/江蘇省神經(jīng)再生重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 南通 226001)

神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞是一類具有自我更新和分化潛力的細(xì)胞，可以通過不對等的分裂方式產(chǎn)生神經(jīng)組織的各類細(xì)胞。神經(jīng)受損后，神經(jīng)干細(xì)胞的動(dòng)員在一定程度上可以促進(jìn)感覺、認(rèn)知和運(yùn)動(dòng)功能的恢復(fù)[1-3]。Nestin[4]作為一種中間絲蛋白，在細(xì)胞內(nèi)常與微管、微絲共同構(gòu)成細(xì)胞骨架，從而維持細(xì)胞獨(dú)特的形態(tài)和彈性。在生物體發(fā)育中Nestin蛋白主要表達(dá)于神經(jīng)干細(xì)胞，且具有嚴(yán)格的時(shí)空順序。一旦神經(jīng)干細(xì)胞向終末方向分化時(shí)，Nestin表達(dá)顯著減少，甚至不表達(dá)[5]，故在中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)Nestin被認(rèn)為是神經(jīng)發(fā)育中神經(jīng)干細(xì)胞的標(biāo)志之一[6-7]。

微管主要是由α/β微管蛋白異二聚體組裝成的一種細(xì)長、中空的圓柱管狀結(jié)構(gòu)[8]，是真核細(xì)胞骨架的重要組成成分。微管在許多重要的細(xì)胞進(jìn)程中發(fā)揮功能，包括神經(jīng)元特殊形態(tài)的維持、生長錐的導(dǎo)向、軸突的延伸等，同時(shí)微管還為細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)運(yùn)輸提供軌道，參與一系列的細(xì)胞進(jìn)程。

本研究旨在構(gòu)建pzNestin-EGFP-α-Tubulin質(zhì)粒，在nestin啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下表達(dá)GFP-α-Tubulin融合蛋白，用于動(dòng)態(tài)觀察神經(jīng)干細(xì)胞中微管行為。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

野生型Tubingen斑馬魚品系、SD孕鼠均由南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。神經(jīng)干細(xì)胞取自SD大鼠孕14 d胎鼠(E14)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均遵守南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理規(guī)范,本研究獲得南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心審批(編號S20210115-408)。

1.2 試劑與儀器

CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱，限制性內(nèi)切酶NotI 和BamHI(Thermo Fisher公司)，超凈工作臺(tái)(江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司)，激光共聚焦顯微鏡(Leica TCS SP5)，pEASY?-Blunt Cloning Kit和TransZol Up Plus RNA Kit(北京全式金生物技術(shù)有限公司)，HiScript? Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit和DNA Marker(南京諾唯贊公司)，微量注射槍頭(Eppendorf公司)，顯微注射儀(Narishige公司)，高保真PCR酶KOD-FX試劑盒(TOYOBO公司)，YSY buffer(南京堯舜禹生物科技有限公司)，DNA序列分析(蘇州金唯智公司)。

1.3 引物、質(zhì)粒與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)

本研究中所使用引物序列見表1，由南京金斯瑞生物公司合成。全長人α-Tubulin與EGFP融合基因的質(zhì)粒pIRESneo-EGFP-α-Tubulin購自Addgene，登錄號為12298。PCR反應(yīng)按KOD FX DNA聚合酶(東洋紡)試劑說明書操作：反應(yīng)體系2×Buffer，0.4 mmol/L dNTP，0.3 μmol/L正向引物，0.3 μmol/L反向引物，KOD-FX 0.4 U，2 μL模板；擴(kuò)增去除CMV啟動(dòng)子的質(zhì)粒骨架PCR反應(yīng)程序：94 ℃，2 min；30×(98 ℃，10 s；60 ℃，30 s；68 ℃，4 min)；68 ℃, 5 min。擴(kuò)增Nestin啟動(dòng)子上游-925bp序列片段PCR反應(yīng)程序：94 ℃，2 min；30×(98 ℃，10 s；60 ℃，30 s；68 ℃，4 min)；68 ℃, 5 min。擴(kuò)增EGFP-α-Tubulin片段PCR反應(yīng)程序：94 ℃，2 min；30×(98 ℃，10 s；60 ℃，30 s；68 ℃，2.2 min)；68 ℃, 5 min。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequence of PCR

1.4 斑馬魚基因組DNA提取

吸取10個(gè)受精后24 h的斑馬魚胚胎，放入0.2 mL離心管，棄去多余E3 Buffer，加入10 μL的YSY buffer。放入PCR儀，設(shè)置程序：65 ℃、30 min，95 ℃、5 min,16 ℃、1 min。基因組DNA提取結(jié)束后放4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5 斑馬魚RNA提取

收集含有綠色熒光的胚胎，棄掉多余的液體，然后用TransZol Up Plus RNA 試劑盒，加500 μL TRIzol，勻漿處理后室溫靜置5 min。加入100 μL氯仿，室溫劇烈震蕩30 s后靜置。預(yù)冷離心機(jī)，4 ℃，11 200 r/min、15 min，吸取水相與無水乙醇(V水∶V乙醇=1∶1)過吸附柱。分別使用CB9和WB9(已加無水乙醇)過柱清洗2次，11 200 r/min，離心30 s。最后加入15 μL RNase Free Water洗脫。

1.6 斑馬魚cDNA合成

(1)基因組 DNA 去除。將2 μL 5× gDNA wiper Mix，10 μL水和2 μg總RNA混勻，在42 ℃孵育2 min。(2)配制第一鏈 cDNA 合成反應(yīng)液。取上一步反應(yīng)產(chǎn)物，加入2 μL 10× RT Mix，2 μL HiScript? Ⅱ Enzyme Mix，1 μL Oligo dT23VN (50 μmol/L)，1 μL Random hexamers (50 ng/μL)及4 μL水，在37 ℃孵育15 min，85 ℃熱滅活5 s。

1.7 顯微注射

斑馬魚胚胎注射按文獻(xiàn)[9]操作。簡要步驟包括：收集胚胎，使用1× E3 buffer (5 mmol/L NaCl, 0.17 mmol/L KCl, 0.33 mmol/L CaCl2, 0.33 mmol/L MgSO4, pH 7.4) 沖洗，使胚胎緊密排版于模具槽中；通過Eppendorf微量槍頭將注射液加至已制備好的玻璃電極中，裝到成茂IM400顯微注射儀持針器上；調(diào)節(jié)顯微注射儀注射壓力、時(shí)間，每個(gè)胚胎注射1 nL體積質(zhì)粒溶液。胚胎發(fā)育至78 h進(jìn)行共聚焦顯微鏡觀察并成像。

1.8 神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)

大鼠神經(jīng)干細(xì)胞分離、純化培養(yǎng)方法按文獻(xiàn)[10]操作。簡要步驟如下：

取材及P0代培養(yǎng)：取E14用適量乙醚麻醉，頸椎脫臼處死后75%乙醇消毒；在超凈工作臺(tái)中取出胎鼠置于預(yù)冷的無菌培養(yǎng)皿中，取出胎腦置Hanks解剖液中，清洗2～3遍備用；體視顯微鏡下剝離腦膜，剔除海馬等組織，將皮層放于預(yù)先準(zhǔn)備好的3 mL完全培養(yǎng)基中，剪成1 mm3大小，用吸管輕輕吹打使細(xì)胞分散，制成單細(xì)胞懸液；過200目篩網(wǎng)、計(jì)數(shù)、置于神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至成球。

干細(xì)胞傳代：懸浮培養(yǎng)的神經(jīng)干細(xì)胞球，當(dāng)直徑達(dá)到100～150 μm進(jìn)行傳代。收集細(xì)胞球于15 mL離心管靜置約5 min，棄培養(yǎng)基，留約100 μL細(xì)胞沉淀；加1 mL 干細(xì)胞消化液，室溫消化10 min，加入4 mL 含血清培養(yǎng)基終止消化，1 000 r/min離心5 min收集沉淀；棄上清，加入 2 mL培養(yǎng)基重懸稀釋后計(jì)數(shù)；每個(gè)10 cm直徑大皿中接種6×106個(gè)細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.9 細(xì)胞電轉(zhuǎn)

轉(zhuǎn)染前將培養(yǎng)的神經(jīng)元消化成單個(gè)細(xì)胞，計(jì)數(shù)，1 000 r/min離心5 min；去上清，加入適量電轉(zhuǎn)液opti-MEM重懸，使100 μL opti-MEM中含300萬細(xì)胞。每個(gè)體系中加入2.5 μg的pEGFP-N1或pzNestin-EGFP-α-Tubulin，設(shè)置電壓125V、脈沖時(shí)長7.5 ms條件進(jìn)行電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)完畢，種入6孔板，放入37 ℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)至48 h進(jìn)行熒光顯微鏡觀察并拍攝。

2 結(jié)果

2.1 pzNestin-EGFP載體的構(gòu)建

采用引物(PEGFP-N1-scattold，序列見表1)擴(kuò)增pEGFP-N1質(zhì)粒序列，獲取去除CMV啟動(dòng)子的質(zhì)粒骨架。引物(Nestin promoter，序列見表1)擴(kuò)增斑馬魚基因組DNA得到nestin轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)上游-925 bp啟動(dòng)子[11]序列片段。通過重疊PCR[12]將上述兩個(gè)PCR產(chǎn)物連接，用SalI處理重疊PCR的產(chǎn)物，使其兩端出現(xiàn)SalI黏性末端，純化后用連接酶處理，形成環(huán)形質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化DH5α大腸桿菌。以上改造實(shí)現(xiàn)了用nestin啟動(dòng)子替換pEGFP-N1質(zhì)粒原有的CMV啟動(dòng)子序列。使用Seq1和pEGFP-N-3引物測序，鑒定獲得的pzNestin-EGFP質(zhì)粒。

2.2 pzNestin-EGFP-α-Tubulin表達(dá)載體的構(gòu)建

采用引物(EGFP-α-Tubulin，序列見表1)。對質(zhì)粒pIRESneo-EGFP-α-Tubulin進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得含BamHI和NotI酶切位點(diǎn)的EGFP-α-Tubulin片段，目的片段大小為2 128 bp，PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化。

同時(shí)采用NotI和BamHI對pzNestin-EGFP質(zhì)粒快速酶切。酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，片段大小與預(yù)期一致(圖1A)。酶切產(chǎn)物(條帶a)經(jīng)切膠回收，與酶切后的EGFP-α-Tubulin片段進(jìn)行連接、轉(zhuǎn)化、單克隆PCR鑒定(使用引物Seq1和Seq2)，大小與預(yù)期相符(1 066 bp,圖1B)。經(jīng)過測序鑒定，獲得pzNestin-EGFP-α-Tubulin表達(dá)載體的質(zhì)粒(圖1C)。

A：pzNestin-EGFP質(zhì)粒酶切電泳圖(條帶a為載體骨架，條帶b為EGFP)；B：pzNestin-EGFP-α-Tubulin質(zhì)粒連接驗(yàn)證電泳圖；C：pzNestin-EGFP-α-Tubulin質(zhì)粒圖譜。A: Electrophoresis of digested pzNestin-EGFP plasmid (band a is the vector backbone, and band b is EGFP); B: Verification of pzNestin-EGFP-α-Tubulin plasmid; C: pzNestin-EGFP-α-Tubulin plasmid map.圖1 pzNestin-EGFP-α-Tubulin質(zhì)粒的構(gòu)建Figure 1 Construction of pzNestin-EGFP-α-Tubulin plasmid

2.3 pzNestin-EGFP-α-Tubulin在斑馬魚中的定位與表達(dá)

將pEGFP-N1或pzNestin-EGFP-α-Tubulin通過顯微注射注入斑馬魚胚胎，并將斑馬魚胚胎置于含有0.003%PTU[13]的1× E3 buffer中，在28.5 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在部分個(gè)體中捕捉到熒光信號；63倍水鏡下能夠明顯觀察到微管樣絲狀的網(wǎng)架結(jié)構(gòu)，表明質(zhì)粒在斑馬魚胚胎發(fā)育中表達(dá)(圖2)。拍照后分別收集注射pEGFP-N1以及pzNestin-EGFP-α-Tubulin后檢測到綠色熒光的斑馬魚胚胎提取RNA并逆轉(zhuǎn)錄提取cDNA，采用引物(GFP F1、GFP R1和α-Tubulin-R)對cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增結(jié)果見圖2D，表明pzNestin-EGFP-α-Tubulin在斑馬魚體內(nèi)轉(zhuǎn)錄出EGFP-α-TubulinmRNA，提示綠色熒光信號是EGFP-α-Tubulin在斑馬魚胚胎中的特異性表達(dá)。

A：胚胎發(fā)育78 h斑馬魚泄殖孔附近明場成像；B：圖A所攝區(qū)域的綠色熒光信號, 箭頭所示為EGFP-α-Tubulin融合蛋白信號;C：圖A和圖B的重疊，左上小圖中黃色箭頭所指為白色箭頭處的放大圖；D：PCR檢測EGFP-α-Tubulin在斑馬魚胚胎中的特異性表達(dá)A: Brightfield image of 78 hpf zebrafish cloacal pore; B: Fluorescence image of the area in panel A, the white arrow indicates the expression of EGFP-α-Tubulin protein; C: Merge image of panel A and B, the yellow arrow indicates a magnification box of the white arrow pointed; D: Detection of specific expression of EGFP-α-Tubulin in zebrafish圖2 pzNestin-EGFP-α-Tubulin在斑馬魚胚胎中的表達(dá)Figure 2 Expression of pzNestin-EGFP-α-Tubulin in zebrafish embryo

2.4 pzNestin-EGFP-α-Tubulin在大鼠神經(jīng)干細(xì)胞中的表達(dá)

考慮到nestin啟動(dòng)子序列在物種間的高度保守性，通過PROMO數(shù)據(jù)庫(http://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3/)預(yù)測大鼠Nestin啟動(dòng)子區(qū)上游 (-1 000 bp) 和斑馬魚nestin啟動(dòng)子區(qū)上游 (-925 bp) 序列是否具有相同的轉(zhuǎn)錄因子(TFs)結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)果顯示大鼠Nestin啟動(dòng)子區(qū)域預(yù)測有77個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，斑馬魚nestin啟動(dòng)子區(qū)域預(yù)測有70個(gè)轉(zhuǎn)錄因子。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)有36個(gè)相同的轉(zhuǎn)錄因子，其中包括轉(zhuǎn)錄因子Pax6和Nkx2.1，被認(rèn)為是神經(jīng)干細(xì)胞中重要的轉(zhuǎn)錄因子[14-15]。因此，斑馬魚nestin啟動(dòng)子可能在大鼠細(xì)胞中有相似的表達(dá)活性。采用電轉(zhuǎn)方法嘗試pzNestin-EGFP-α-Tubulin質(zhì)粒在大鼠神經(jīng)干細(xì)胞中表達(dá)。電轉(zhuǎn)后培養(yǎng)48 h在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果顯示在干細(xì)胞球中有綠色熒光表達(dá)(圖3)。

A、D：質(zhì)粒電轉(zhuǎn)48 h神經(jīng)干細(xì)胞的明場；B、E：質(zhì)粒電轉(zhuǎn)48 h神經(jīng)干細(xì)胞的熒光圖；C、F：明場和熒光的疊加圖。白色箭頭為EGFP表達(dá)，黃色箭頭為EGFP-α-Tubulin融合蛋白表達(dá)。A、D: brightfield images of neural stem cells 48 h after plasmid electroporation; B、E: fluorescence images of neural stem cells 48 h after plasmid electroporation; C、F: merge images of panel A-B and panel D-E. The white arrow indicates expression of GFP, while the yellow arrow indicates expression of EGFP-Tubulin protein.圖3 質(zhì)粒pEGFP-N1(A-C)和pzNestin-EGFP-α-Tubulin(D-F)在大鼠神經(jīng)干細(xì)胞中的表達(dá)Figure 3 Expression of pEGFP-N1 (A-C) and pzNestin-EGFP-α-Tubulin (D-F) in rat neural stem cells

3 討論

中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育對于動(dòng)物體早期發(fā)育至關(guān)重要，神經(jīng)干細(xì)胞在增殖和遷移過程中涉及微管網(wǎng)絡(luò)的變化，其呈高度動(dòng)態(tài)性[16, 17]。微管在快速聚合與解聚階段之間不斷變換，這個(gè)過程稱為“動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定”[18]。微管依賴這種動(dòng)態(tài)性不斷地進(jìn)行重塑，組裝成各種微管陣列，來滿足細(xì)胞的需求，使細(xì)胞發(fā)揮正常的功能[19]。

巢蛋白Nestin是一種中間絲蛋白，它在哺乳動(dòng)物神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞中高表達(dá)，已被廣泛用作神經(jīng)干細(xì)胞/前體細(xì)胞的標(biāo)志分子。因此，Nestin的表達(dá)位置和強(qiáng)度對分析神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育具有重要作用。雖然成體神經(jīng)系統(tǒng)的Nestin表達(dá)下降，但是中樞神經(jīng)損傷后神經(jīng)干細(xì)胞有一定的動(dòng)員能力，Nestin表達(dá)又重新升高[20]，因此Nestin也可以作為神經(jīng)系統(tǒng)病變和損傷的快速敏感診斷指標(biāo)之一。

本研究構(gòu)建的pzNestin-EGFP-α-Tubulin質(zhì)粒能在斑馬魚胚胎和大鼠來源的神經(jīng)干細(xì)胞中表達(dá)，表明nestin啟動(dòng)子高度保守性，可以跨物種用于其他高表達(dá)Nestin細(xì)胞中的微管骨架標(biāo)記，同時(shí)采用特異性引物對注射過pEGFP-N1以及pzNestin-EGFP-α-Tubulin且綠色熒光的斑馬魚胚胎的cDNA進(jìn)行特異性擴(kuò)增，確保了pzNestin-EGFP-α-Tubulin在斑馬魚胚胎中表達(dá)的特異性；為進(jìn)一步探討Nestin特異表達(dá)與細(xì)胞行為，如增殖、遷移等過程中的微管動(dòng)態(tài)改變提供了一種新的研究工具。

作者貢獻(xiàn)聲明

卓潤：實(shí)驗(yàn)研究、分析數(shù)據(jù)、撰寫論文；屠琪峰：參與實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)分析；馬超：參與實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)分析；林閣：參與實(shí)驗(yàn)操作和數(shù)據(jù)分析；劉梅：提出研究思路和框架，修改論文；董張及：提出研究思路和框架，修改論文。

利益沖突聲明

本研究未受到企業(yè)、公司等第三方資助不存在潛在利益沖突。