高必興，何 芳，齊景梁，茍 琰，耿 昭，鐘 戀，蔣桂華，周 娟，蔣運(yùn)斌

常用兔耳草類藥材的6種有效成分含量對比研究

高必興1, 2，何 芳2，齊景梁2，茍 琰1, 2，耿 昭2，鐘 戀1, 2，蔣桂華1*，周 娟2，蔣運(yùn)斌3*

1.成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610072 2.四川省藥品檢驗(yàn)研究院國家藥品監(jiān)督管理局中成藥質(zhì)量評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 611731 3.西南大學(xué)藥學(xué)院中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 北碚 400715

建立測定兔耳草類藥材主要有效成分苯丙素苷類（毛蕊花糖苷、松果菊苷、大車前苷及鞭打繡球苷B）及環(huán)烯醚萜苷類（10----methoxycinnamoyl-catalpol及10--[()-3,4-dimethoxycinnamoyl]-catalpol）的HPLC-PDA含量測定方法，并比較不同基原兔耳草的含量差異，為其質(zhì)量控制方法及臨床有效性提供依據(jù)。采用資生堂SPOLAR C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-0.4%甲酸溶液，梯度洗脫；體積流量1.0 mL/min；檢測波長為325 nm；柱溫為30 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。依據(jù)測定結(jié)果使用聚類分析法和偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）法進(jìn)行分析。在此條件下，34批全緣兔耳草、21批短筒兔耳草、10批圓穗兔耳草、6批革葉兔耳草、5批短穗兔耳草及4批紫葉兔耳草的6種有效成分的色譜峰分離度均良好，線性關(guān)系良好。不同基原所含的主要有效成分類型及含量均不一致，有共性也有差異性。運(yùn)用SIMCA 14.1和SPSS 25.0軟件分析結(jié)果顯示，短筒兔耳草與圓穗兔耳草聚為一類，紫葉兔耳草與短穗兔耳草聚為一類，內(nèi)在組成及含量差異小；全緣兔耳草不同產(chǎn)區(qū)差異大，革葉兔耳草組間差異最大。建立的含量測定分析方法能有效地對多種基原兔耳草進(jìn)行分析，能有效地對其進(jìn)行質(zhì)量控制；通過比較不同基原的兔耳草，為兔耳草資源的開發(fā)及利用提供有效依據(jù)。

全緣兔耳草；短筒兔耳草；圓穗兔耳草；革葉兔耳草；短穗兔耳草；紫葉兔耳草；苯丙素苷類；環(huán)烯醚萜苷類；毛蕊花糖苷；松果菊苷；大車前苷；鞭打繡球苷B；HPLC-PDA

兔耳草為常用藏藥，始載于《月王藥診》[1]，音譯名為“洪連”[2]。主要分布于甘肅省、青海省、云南省、四川省及西藏自治區(qū)。于《四部醫(yī)典》[3]列為藏草藥之首，藥用價值極高。具有清熱、解毒、利濕、平肝、行血、調(diào)經(jīng)等作用?？捎糜诎l(fā)熱煩渴、肺熱咳嗽、頭痛眩暈、濕熱黃疸、月經(jīng)不調(diào)、藥食中毒等癥[2]。我國現(xiàn)存兔耳草屬植物有17種，多分布于西南高山，部分可藥用[4]。不同地區(qū)使用的兔耳草藥用基原不一樣，大部分基原可作“洪連”使用，其中有一種基原“短穗兔耳草”作藏藥“直打瓦曾”使用，在藏區(qū)主要用于治療“黃水病”[5]。

前期調(diào)研發(fā)現(xiàn)，市售及臨床使用的兔耳草為兔耳草屬多種植物，以短筒兔耳草Maxim、全緣兔耳草W.W.Smith、圓穗兔耳草Batalin、短穗兔耳草Maxim.及革葉兔耳草W.W.Smith等使用居多，但僅有短筒兔耳草、全緣兔耳草及革葉兔耳草有標(biāo)準(zhǔn)收載[6-7]，同時僅有短筒兔耳草收載于《中國藥典》2020年版一部中，以松果菊苷為對照品規(guī)定含量測定，其他基原均無含量測定的相關(guān)研究。據(jù)文獻(xiàn)報道，苯丙素苷類及環(huán)烯醚萜苷類成分為玄參科兔耳草屬植物的主要活性成分，具有明顯的藥理活性[8-10]。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)前期研究發(fā)現(xiàn)，兔耳草類藥材中苯丙素苷類成分以毛蕊花糖苷、松果菊苷、大車前苷、鞭打繡球苷B居多，環(huán)烯醚萜苷類成分以10----metho-xycinnamoyl- catalpol及10--[()-3,4-dimetho-xycinnamoyl]- catalpol居多[11]，故針對此6種成分進(jìn)行含量測定，并比較不同植物之間的成分差異，為兔耳草資源的合理開發(fā)、市場的規(guī)范發(fā)展及臨床的正確使用提供科學(xué)的依據(jù)。

1 儀器及試藥

日本島津LC-20AD高效液相色譜儀，PDA檢測器；資生堂SPOLAR C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；德國Sartorious BP211D型十萬分之一電子天平；Milli-Q超純水機(jī)。

對照品毛蕊花糖苷（批號111530-201512，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為96.7%）、松果菊苷（批號111670-201907，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為91.8%）、大車前苷（批號111914-201604，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為90.2%）均購自中國食品藥品檢定研究院。鞭打繡球苷B（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.6%），10----metho- xycinnamoyl-catalpol（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%），10--[()-3,4-dimetho-xycinnamoyl]- catalpol（質(zhì)量分?jǐn)?shù)為99.0%），均為實(shí)驗(yàn)室分離純化的對照品；甲醇和乙腈為色譜純（Fisher公司）；水為Milli-Q純化水。

34批全緣兔耳草W.W.Smith、21批短筒兔耳草Maxim.、10批圓穗兔耳草Batalin、6批革葉兔耳草W.W.Smith、5批短穗兔耳草Maxim.及4批紫葉兔耳草W.W.Smith均經(jīng)四川省藥品檢驗(yàn)檢測院黎躍成主任中藥師鑒定為基原準(zhǔn)確的藥材。具體樣品信息見表1。

2 方法與結(jié)果

2.1 含量測定方法

2.1.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性 色譜柱：資生堂 SPOLAR C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.4%甲酸溶液（B）梯度洗脫（0～20 min，14% A；20～35 min，14%～17% A，35～60 min，17%～20% A；60～70 min，20%～14% A；體積流量1.0 mL/min；檢測波長325 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。

2.1.2 對照品溶液的制備 取毛蕊花糖苷、大車前苷、松果菊苷、鞭打繡球苷B、10----methoxycinnamoyl-catalpol及10--[()-3, 4-dimethoxycinnamoyl]-catalpol對照品適量，精密稱定，加70%甲醇分別制成質(zhì)量濃度均為0.1 mg/mL的對照品溶液。

表1 樣品信息

Table 1 Sample information

編號基原采集地編號基原采集地 QY-1全緣兔耳草四川省甘孜州石渠縣DG-7短筒兔耳草青海省某供應(yīng)商 QY-2全緣兔耳草四川省甘孜州德格藏醫(yī)院DG-8短筒兔耳草甘肅省武夷天柱縣旦馬鄉(xiāng) QY-3全緣兔耳草四川省甘孜州宗薩縣DG-9短筒兔耳草青海省八一路藥材市場 QY-4全緣兔耳草甘孜州藏醫(yī)院DG-10短筒兔耳草青海省藏醫(yī)院（2018采收） QY-5全緣兔耳草宇妥藏藥DG-11短筒兔耳草青海省藏醫(yī)院（2019采收） QY-6全緣兔耳草西藏自治區(qū)藏藥廠DG-12短筒兔耳草澤庫縣藏醫(yī)院 QY-7全緣兔耳草西藏奇正藏藥DG-13短筒兔耳草青海省海南州藏醫(yī)院 QY-8全緣兔耳草金珂藏藥DG-14短筒兔耳草青海三智商貿(mào)有限公司 QY-9全緣兔耳草西藏諾迪康藥業(yè)有限公司DG-15短筒兔耳草湟中縣藏醫(yī)院 QY-10全緣兔耳草青海省八一路藥材市場DG-16短筒兔耳草果洛州藏醫(yī)院 QY-11全緣兔耳草西藏藥檢所DG-17短筒兔耳草移多藏藥 QY-12全緣兔耳草四川省甘孜州石渠縣城關(guān)五村DG-18短筒兔耳草西藏奇正藥業(yè) QY-13全緣兔耳草居麥旁藏藥DG-19短筒兔耳草色達(dá)縣藏醫(yī)院 QY-14全緣兔耳草云南藥檢所DG-20短筒兔耳草荷花池藥材市場（產(chǎn)地西藏） QY-15全緣兔耳草西藏自治區(qū)DG-21短筒兔耳草青海省貴南縣馬營鎮(zhèn)直亥雪山 QY-16全緣兔耳草甘孜州藏醫(yī)院YS-1圓穗兔耳草四川省甘孜州石渠縣 QY-17全緣兔耳草青海省八一路藥材市場（2017）YS-2圓穗兔耳草德格藏醫(yī)院 QY-18全緣兔耳草青海省八一路藥材市場（2020）YS-3圓穗兔耳草宗薩藏醫(yī)院 QY-19全緣兔耳草青海省黃南州藏醫(yī)院YS-4圓穗兔耳草四川省阿壩州壤塘縣中壤塘鄉(xiāng)中壤塘村 QY-20全緣兔耳草四川省甘孜州稻城海子山埡口YS-5圓穗兔耳草四川省阿壩若爾蓋藏醫(yī)院 QY-21全緣兔耳草四川省甘孜州理塘縣藏壩鄉(xiāng)YS-6圓穗兔耳草湟中縣藏醫(yī)院 QY-22全緣兔耳草四川省甘孜州理塘縣兔耳山埡口YS-7圓穗兔耳草阿壩藥檢所 QY-23全緣兔耳草四川省甘孜州理塘縣德巫鄉(xiāng)YS-8圓穗兔耳草青海優(yōu)潤堂商貿(mào)有限責(zé)任公司（2017） QY-24全緣兔耳草四川省甘孜州理塘縣拉波鄉(xiāng)拉美村YS-9圓穗兔耳草青海優(yōu)潤堂商貿(mào)有限責(zé)任公司（2019） QY-25全緣兔耳草四川省甘孜州鄉(xiāng)城縣藏醫(yī)院YS-10圓穗兔耳草小金縣美沃鄉(xiāng) QY-26全緣兔耳草玉樹藏族自治州藏醫(yī)院GY-1革葉兔耳草西藏錯那雷達(dá)站 QY-27全緣兔耳草甘南州藏醫(yī)院GY-2革葉兔耳草四川阿壩年寶葉則 QY-28全緣兔耳草囊謙縣藏醫(yī)院GY-3革葉兔耳草紅原藏醫(yī)院 QY-29全緣兔耳草理塘藏醫(yī)院GY-4革葉兔耳草西藏山南市錯那縣波拉山 QY-30全緣兔耳草西藏拉薩藍(lán)屋石藥材公司GY-5革葉兔耳草拉薩市當(dāng)雄縣羊八井鎮(zhèn)雪古拉山 QY-31全緣兔耳草得榮藏醫(yī)院GY-6革葉兔耳草云南迪慶州白馬雪山第二埡口 QY-32全緣兔耳草西藏藏醫(yī)學(xué)院藏藥有限公司DS-1短穗兔耳草藏瀚閣 QY-33全緣兔耳草涼山州木里藏族自治縣中藏醫(yī)院DS-2短穗兔耳草青海省海晏縣三聯(lián)村 QY-34全緣兔耳草雅江縣雅江縣柯拉山上DS-3短穗兔耳草西藏醫(yī)學(xué)院 DG-1短筒兔耳草馬爾康藏醫(yī)院DS-4短穗兔耳草青海省八一路藥材市場 DG-2短筒兔耳草仁青藏藥行DS-5短穗兔耳草迪慶州藏醫(yī)院 DG-3短筒兔耳草青海省果洛州ZY-1紫葉兔耳草四川省甘孜州理塘縣拉波鄉(xiāng)拉德村 DG-4短筒兔耳草青海省西寧市大通回族土族自治縣ZY-2紫葉兔耳草四川阿壩藏醫(yī)院 DG-5短筒兔耳草青海省門源回族自治縣崗什卡雪峰ZY-3紫葉兔耳草云南迪慶州白馬雪山 DG-6短筒兔耳草青海省大東樹山ZY-4紫葉兔耳草甘孜州巴塘縣禾尼鄉(xiāng)山上

1-松果菊苷 2-大車前苷 3-毛蕊花糖苷 4-鞭打繡球苷B 5-10-O-trans-p-methoxycinnamoyl-catalpol 6-10-O-[(E)-3,4-dimethoxycinnamoyl]- catalpol

2.1.3 供試品溶液的制備 取上述樣品粉末（過三號篩）約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理（功率250 W，頻率33 kHz）30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性關(guān)系 分別精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下的混合對照品儲備溶液0.25、0.5、1.0、2.0、2.5、5.0、10 mL置10 mL的量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。按“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣分析，記錄其峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（），其質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，6種成分線性關(guān)系良好（R≥0.999 8）。各成分標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程、線性范圍及相關(guān)系數(shù)見表2。

表2 各被測成分的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)

Table 2 Calibration curve, linear range, correlation coefficient of each component

成分回歸方程線性范圍/(μg·mL?1)R2 松果菊苷Y＝9 220.6 X＋34 201.32.882 5～115.300 00.999 8 大車前苷Y＝14 700.3 X＋28 163.13.087 5～123.500 00.999 9 毛蕊花糖苷Y＝13 677.2 X－101 358.12.987 5～119.500 00.999 8 hemiphroside BY＝13 958.6 X＋3 408.52.762 5～110.500 01.000 0 10-O-trans-p-methoxycinnamoyl-catalpolY＝18 785.4 X－5 173.93.012 5～120.500 00.999 9 10-O-[(E)-3,4-dimethoxycinnamoyl]-catalpolY＝17 757.5 X－2 081.42.888 5～115.400 00.999 9

2.2.2 檢測限與定量限測定 取“2.1.2”項(xiàng)下對照品混合溶液用70%甲醇逐級稀釋后進(jìn)樣測定，以色譜圖中信噪比（/）3∶1為檢測限，/10∶1為定量限。結(jié)果表明，各成分檢測限為2.8～10.6 ng，定量限為9.3～34.9 ng，靈敏度高。

2.2.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取“2.1.2”項(xiàng)下對照品混合溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果毛蕊花糖苷、大車前苷、松果菊苷、鞭打繡球苷B、10----methoxycinnamoyl-catalpol、10-- [()- 3,4-dimethoxycinnamoyl]-catalpol的峰面積的RSD分別為0.14%、0.21%、0.31%、0.34%、0.42%及0.21%，表明儀器精密度良好。

2.2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取樣品粉末（QY-1）6份，分別按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜方法測定，記錄峰面積，計算含量。結(jié)果各份供試品溶液的毛蕊花糖苷、大車前苷、松果菊苷、鞭打繡球苷B、10----methoxycinnamoyl-catalpol、10--[()-3,4-dimetho- xycinnamoyl]-catalpol的質(zhì)量分?jǐn)?shù)的RSD分別為0.89%、1.21%、0.82%、0.82%、0.76%及0.94%。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一份供試品溶液（QY-1），分別于0、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣測定。結(jié)果毛蕊花糖苷、大車前苷、松果菊苷、鞭打繡球苷B、10----methoxycinnamoyl- catalpol、10--[()-3,4-dimethoxycinnamoyl]-catalpol的峰面積的RSD分別為0.45%、1.01%、0.73%、0.97%、0.84%及0.74%，結(jié)果表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.6 加樣回收率試驗(yàn) 分別取松果菊苷和毛蕊花糖苷適量，精密稱定，置量瓶中，加70%甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度分別為1.040 2、1.016 6 mg/mL的對照品溶液。取已測定的供試品粉末（YS-1）6份，每份各約0.05 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，分別精密加入上述2種對照品溶液貯備液各1.0 mL。另分別取大車前苷、鞭打繡球苷B、10----methoxycinnamoyl-catalpol、10-- [()-3,4- dimetho xycinnamoyl]-catalpol適量，精密稱定，置量瓶中，加70%甲醇溶解配制成質(zhì)量濃度分別為1.011 2、0.301 2、0.511 5、0.253 8 mg/mL的對照品溶液。取已測定的供試品粉末（QY-1）6份，每份各約0.05 g，精密稱定，分別置具塞錐形瓶中，分別精密加入上述2種對照品溶液儲備液各1.0 mL。按照“2.1.3”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液，進(jìn)樣分析，計算回收率，表明該方法加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果良好。松果菊苷、毛蕊花糖苷、大車前苷、鞭打繡球苷B、10----metho-xycinnamoyl- catalpol、10--[()-3,4-dimetho-xycinnamoyl]-catalpol的回收率分別為97.5%、99.9%、99.8%、99.2%、101.3%及100.3%，RSD分別為0.90%、2.11%、2.49%、1.38%、1.48%及0.95%。

2.2.7 樣品含量測定 稱取樣品兔耳草粉末（過3號篩）0.1 g，精密稱定，分別按照“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜方法測定，記錄6種成分的峰面積，計算含量。結(jié)果見表3。

表3 樣品測定結(jié)果(n＝3)

Table 3 Results of samples determination (n＝3)

編號質(zhì)量分?jǐn)?shù)/% 松果菊苷大車前苷毛蕊花糖苷鞭打繡球苷B10-O-trans-p-metho-xycinnamoyl-catalpol10-O-[(E)-3,4-dimetho-xycinnamoyl]-catalpol苯丙素苷類環(huán)烯醚萜苷類 QY-1/2.47/0.471.090.492.941.58 QY-2/2.48/0.880.680.273.360.95 QY-3/3.19/1.302.520.274.492.79 QY-4/1.00/0.170.010.011.170.02 QY-5/2.78/1.770.440.154.550.59 QY-6/1.47/2.520.110.053.990.16 QY-7/3.10/1.121.381.014.222.39 QY-8/2.88/1.720.850.114.600.96 QY-9/2.88/1.720.850.114.600.96 QY-10/2.21/1.770.120.033.980.15 QY-11/5.89/0.822.671.516.714.18 QY-12/1.78/0.210.410.151.990.56 QY-13/3.34/0.881.230.594.221.82 QY-14/2.80/0.680.800.153.480.95 QY-15/2.90/1.990.180.044.890.22 QY-16/1.87/0.280.010.012.150.02 QY-17/2.11/1.830.120.033.940.15 QY-18/3.42/2.111.620.485.532.10 QY-19/3.38/1.423.110.364.803.47 QY-20/2.19/0.190.030.012.380.04 QY-21/7.70/0.200.060.017.900.07 QY-22/5.72/1.550.010.017.270.02 QY-23/5.76/0.640.040.016.400.05 QY-24/6.13/0.330.060.016.460.07 QY-25/2.29/0.940.170.043.230.21 QY-26/1.77/1.340.070.013.110.08

續(xù)表3

編號質(zhì)量分?jǐn)?shù)/% 松果菊苷大車前苷毛蕊花糖苷鞭打繡球苷B10-O-trans-p-metho-xycinnamoyl-catalpol10-O-[(E)-3,4-dimetho-xycinnamoyl]-catalpol苯丙素苷類環(huán)烯醚萜苷類 QY-27/1.59/0.410.610.022.000.63 QY-28/4.98/0.900.160.045.880.20 QY-29/4.61/0.423.520.265.033.78 QY-30/2.54/3.180.290.085.720.37 QY-31/4.19/1.231.570.105.421.67 QY-32/3.57/0.160.180.013.730.19 QY-33/3.01/1.101.981.104.113.08 QY-34/3.22/0.240.020.013.460.03 均值/3.27/1.070.790.224.341.02 DG-11.060.110.48///1.65/ DG-21.160.010.79///1.96/ DG-30.860.080.85///1.79/ DG-40.700.100.63///1.43/ DG-50.730.090.45///1.27/ DG-61.150.210.45///1.81/ DG-71.640.051.45///3.14/ DG-81.050.150.55///1.75/ DG-90.600.050.43///1.08/ DG-101.490.160.71///2.36/ DG-111.480.020.68///2.18/ DG-121.260.031.19///2.48/ DG-131.720.050.98///2.75/ DG-141.380.130.76///2.27/ DG-151.000.190.84///2.03/ DG-161.710.150.94///2.80/ DG-171.190.010.66///1.86/ DG-182.040.041.65///3.73/ DG-191.850.150.85///2.85/ DG-201.170.021.15///2.34/ DG-211.200.040.97///2.21/ 均值1.260.090.83///2.18/ YS-11.310.121.35///2.78/ YS-20.960.130.74///1.83/ YS-31.350.251.11///2.71/ YS-40.930.221.17///2.32/ YS-51.610.212.53///4.35/ YS-60.650.370.63///1.65/ YS-71.190.011.22///2.42/ YS-81.250.210.70///2.16/ YS-91.110.490.87///2.47/ YS-100.860.112.05///3.02/ 均值1.120.211.24///2.57/ GY-1/2.77/0.880.382.773.653.15 GY-2/1.44/0.050.051.441.491.49 GY-3/2.37/0.800.212.373.172.58 GY-4/1.17/0.373.801.171.544.97 GY-5/2.09/1.950.042.094.042.13 GY-6/4.84/0.030.054.844.874.89 均值/2.45/0.680.762.453.133.20 DS-1/0.840.400.010.840.401.251.24 DS-2/0.930.040.080.930.041.050.97 DS-3/1.250.240.021.250.241.511.49 DS-4/0.630.280.030.630.280.940.91 DS-5/0.750.110.140.750.111.000.86 均值/0.880.210.060.880.211.151.09 ZY-1/2.15/0.05//2.20/ ZY-2/0.33/0.07//0.40/ ZY-3/0.31/0.11//0.42/ ZY-4/0.24/0.10//0.34/ 均值

2.2.8 聚類分析（hierarchical clustering alg，HCA） 采用SPSS 25.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行HCA分析，選用組內(nèi)聯(lián)接聚類法，以歐式平方距離度量標(biāo)準(zhǔn)，數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。當(dāng)歐式平方距離為2.5時，短筒兔耳草與圓穗兔耳草聚成了一類，紫葉兔耳草與短穗兔耳草聚成了一類；當(dāng)歐式平方距離為10時，大部分全緣兔耳草與革葉兔耳草聚成了一類，剩下的全緣兔耳草單獨(dú)聚成了一類，此類全緣兔耳草實(shí)地采樣均是來源于甘孜州理塘周邊區(qū)域，稻城，巴塘等區(qū)域，植物形態(tài)上與西藏所產(chǎn)兔耳草存在著一定的差異，說明其種內(nèi)存在著一定的差異。

2.2.9 偏最小二乘法判別分析（orthogonal partial least squares discrimination analysis，OPLS-DA）法 采用SIMCA 14.1統(tǒng)計軟件，先對數(shù)據(jù)進(jìn)行分類識別，進(jìn)行OPLS-DA分析，采用無監(jiān)督模式識別方法觀察樣品的自然聚集，結(jié)果見圖2。結(jié)果表明短筒兔耳草與圓穗兔耳草相互聚集，可與其他4種兔耳草明顯的區(qū)分；紫葉兔耳草與短穗兔耳草聚集，革葉兔耳草不同樣品間分散，組間差異大；全緣兔耳草大部分相互聚集，不同樣品間存在一定差異，與HCA結(jié)果大體一致。

圖2 不同基原兔耳草的OPLS-DA得分圖

3 討論

本研究針對色譜條件與系統(tǒng)適用性及供試品溶液的制備進(jìn)行了考察。色譜柱的考察了資生堂SPOLAR C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），Waters X-Bridge C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）及Hypersil GOLD C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），最終以資生堂SPOLAR C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）分離度最佳；檢測波長在190～700 nm進(jìn)行紫外-可見光全波長掃描，發(fā)現(xiàn)檢測波長在325 nm時各色譜峰的峰面積最高；流動相系統(tǒng)及比例針對了乙腈-水、甲醇-水、乙腈-0.2%甲酸溶液、乙腈-0.4%甲酸溶液、乙腈-0.5%甲酸溶液及乙腈-0.2%磷酸溶液，最終以乙腈（A）-0.4%甲酸溶液梯度洗脫分離效果最佳。供試品溶液的制備針對了樣品的提取溶劑，提取方法及料液比進(jìn)行了考察，最終以“2.1.3”項(xiàng)所述方法為最佳。

據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)與標(biāo)準(zhǔn)記載，兔耳草于藏區(qū)主要用于清肝膽熱，用于治療熱性肝病[2,12]等，本實(shí)驗(yàn)所測成分均為其活性成分。結(jié)果表明，不同基原兔耳草含有此6種成分的種類及含量具有共性及差異性：首先在種類方面，全緣兔耳草主要含有苯丙素苷類成分（大車前苷及鞭打繡球苷B）與環(huán)烯醚萜苷類（10----methoxycinnamoyl-catalpol及10--[()-3,4-dimethoxycinnamoyl]-catalpol），無毛蕊花糖苷及松果菊苷；革葉兔耳草與全緣兔耳草相似，含有此4類成分；短穗兔耳草除此4類成分外，還含有少量的松果菊苷。短筒兔耳草主要含有苯丙素苷類成分（毛蕊花糖苷、大車前苷及松果菊苷），無上述環(huán)烯醚萜苷類成分。圓穗兔耳草同短筒兔耳草。紫葉兔耳草含有大車前苷及少量的鞭打繡球苷B。其次在含量方面，單體成分平均含量方面，大車前苷：全緣兔耳草（3.27%）＞革葉兔耳草（2.28%）＞短穗（0.88%）＞紫葉（0.76%）＞圓穗（0.21%）＞短筒（0.09%）；松果菊苷：短筒（1.26%）＞圓穗（1.12%）；毛蕊花糖苷：圓穗（1.24%）＞短筒（0.83%）＞短穗（0.21%）；鞭打繡球苷B：全緣（1.07%）＞革葉（0.68%）＞紫葉（0.08%）＞短穗（0.06%）。10---- methoxycinnamoyl-catalpol：短穗（0.88%）＞全緣（0.79%）＞革葉（0.76%）；10--[()-3,4- dimethoxycinnamoyl]- catalpol：革葉（2.45%）＞全緣（0.22%）＞短穗（0.21%）。大類成分的總量方面，苯丙素苷類：全緣（4.34%）＞革葉（3.13%）＞圓穗（2.57%）＞短筒（2.18%）＞短穗（1.15%）＞紫葉（0.84%），環(huán)烯醚萜苷類：革葉（3.20%）＞短穗（1.09%）＞全緣（1.02%）。

通過上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果同時說明，不同基原兔耳草所含成分的種類及含量很多不一致，作同一藥材使用有待商榷；HCA分析及OPLS-DA法分析結(jié)果表明圓穗兔耳草與短筒兔耳草明顯的聚成了一類，互相聚集，2種內(nèi)在化學(xué)組成與含量相似，圓穗兔耳草與短筒兔耳草同屬于“雄洪連”[11]，此研究結(jié)果表明短筒兔耳草與圓穗兔耳草在成分的種類及含量上具有很大的相似性，而圓穗兔耳草未被現(xiàn)行國家和地方標(biāo)準(zhǔn)收載，但在市場及臨床有一定的應(yīng)用基礎(chǔ)，與短筒兔耳草等同入藥，并取得了相應(yīng)的臨床療效，以緩解當(dāng)前短筒兔耳草資源緊缺的問題。而全緣兔耳草所含成分的種類和含量與短筒兔耳草有很大的差異，從大類成分的含量來看，無論從苯丙素苷類還是環(huán)烯醚萜苷類成分全緣兔耳草的含量均大于短筒兔耳草，前期通過調(diào)研及本草文獻(xiàn)考證發(fā)現(xiàn)，圓穗兔耳草與短筒兔耳草同屬于“雄洪連”，全緣兔耳草屬“雌洪連”，雄洪連的臨床療效優(yōu)于雌洪連[13]，短筒兔耳草優(yōu)于全緣兔耳草有待進(jìn)一步的研究。

現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)中，《中國藥典》2020年版[2]洪連（基原：短筒兔耳草）中收載的以松果菊苷（苯丙素苷類成分）作為對照品進(jìn)行含量測定。全緣兔耳草作為藥材“兔耳草”的基原收載于《部頒藏藥材》標(biāo)準(zhǔn)[6]，但無含量測定項(xiàng)，革葉兔耳草作為藥材“兔耳草”的基原收載于《云南省藥品標(biāo)準(zhǔn)》（1996）[7]中，但無含量測定項(xiàng)。圓穗兔耳草、紫葉兔耳草及短穗兔耳草則未有相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)收載；本研究針對其有效成分進(jìn)行研究，也為不同基原兔耳草質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立和提高打下基礎(chǔ)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Comparation study on contents of six active ingredients of

GAO Bi-xing1, 2, HE Fang1, QI Jing-liang2, GOU Yan1, 2, GENG Zhao2, ZHONG Lian1, 2, JIANG Gui-hua1, ZHOU Juan2, JIANG Yun-bin3

1.School of Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, Chengdu 610072, China 2.Sichuan Institute for Drug Control/Key Laboratory of Quality Evaluation of Chinese Patent Medicines, NMPA, Chengdu 611731, China 3.College of Pharmaceutical Sciences and Chinese Medicine, Southwest University, Chongqing 400715, China

HPLC-PDA content determination method was established to determinate the main active ingredients of Honglian (), which included phenylpropanoid glycosides (verproside, echinacoside, plantamajoside, hemiphroside B) and iridoid glycosides (10----methoxycinnamoyl-catalpol and 10--[()-3,4-dimethoxycinnamoyl]-catalpol and compared with the other primitive species, so as to provide evidence for quality control methods and clinical effectiveness.The HPLC analysis was performed on SPOLAR C18(250 mm × 4.6 mm, 5μm), using acetonitrile and 0.4% formic acid solution as the mobile phase at a flow rate of 1.0 mL/min, the detection wave-length was 325 nm and column temperature was 30 ℃ with 10 μL injection volume.The combined determination results were analyzed using partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) and cluster analysis.Under this condition, the chromatographic peak resolution of the six active ingredients had good separationin in 34 batches of，21 batches of, 10 batches of, six batches of, five batches ofMaxim.and four batches of.The six ingredients had a good linear relationship.The types and contents of the main active ingredients contained in different bases were all inconsistent, with commonalities and differences.The results analyzed by SPSS 25.0 and SIMCA 14.1 software showed thatandwere clustered,andwere clustered together, and there were large difference in different producing areas of,andthe difference between groups ofwas the greatest .The established content determination and analysis method could effectively analyze a variety ofand could effectively control its quality.By comparing the species from different origins, it provided an effective basis for the development and utilization of its resources.

W.W.Smith;Maxim;Batalin;W.W.Smith;Maxim;W.W.Smith.; phenylpropanoid glycosides; iridoid glycosides; verproside; echinacoside; plantagoside; hemiphroside B; HPLC-PDA

R286.2

A

0253 - 2670(2022)09 - 2810 - 08

2021-09-06

國家食藥監(jiān)總局藥化司專項(xiàng)“特色民族藥材檢驗(yàn)方法示范性研究”；國家重點(diǎn)研發(fā)計劃子課題（2019YFC1712302）；成都中醫(yī)藥大學(xué)杏林學(xué)者項(xiàng)目（XSGG2019023）；成都中醫(yī)藥大學(xué)杏林學(xué)者項(xiàng)目（QNXZ2019024）

高必興，男，博士研究生，研究方向?yàn)橹兴幖懊褡逅庂|(zhì)量研究。Tel: (028)87877141 E-mail: laughgao@foxmail.com

10.7501/j.issn.0253-2670.2022.09.025

通信作者：蔣桂華，女，教授，博士生導(dǎo)師。Tel: 18980923782 E-mail:11469413@qq.com

蔣運(yùn)斌，男，講師，研究方向?yàn)槊褡逅帉W(xué)，Tel: 13368082556 E-mail: yunbinjiang@swu.edu.cn

[責(zé)任編輯 時圣明]