李文君， 王成章， 雷建都， 唐鳳霞

(1.中國林業(yè)科學(xué)研究院 林產(chǎn)化學(xué)工業(yè)研究所；生物質(zhì)化學(xué)利用國家工程實(shí)驗(yàn)室；國家林業(yè)和 草原局林產(chǎn)化學(xué)工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；江蘇省生物質(zhì)能源與材料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210042；2.北京林業(yè)大學(xué) 材料科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，北京 100083；3.南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037)

特級初榨橄欖油作為地中海地區(qū)居民飲食的重要組成部分，可以預(yù)防Ⅱ型糖尿病、癌癥、神經(jīng)退行性疾病和心血管疾病[1]，這主要?dú)w因于其豐富的單不飽和脂肪酸(C18:1，55%～83%)，以及次要成分醇、甾醇、碳?xì)浠衔铩⒎宇惢衔锏?，尤其是酚醇類和類環(huán)烯醚衍生物[2]。橄欖油中的總多酚浸膏(TPF)是一種復(fù)雜的混合物，包括簡單的酚類、木脂素、類黃酮、裂環(huán)烯醚萜和三萜酸[3]，其中最具特征的成分是羥基酪醇、酪醇、橄欖苦苷、2-(4-羥基苯基)乙基(E)-4-甲?；?3-(2-氧代乙基)己基-4-烯酸酯(OLEO，俗名刺激醛)、2-(3,4-二羥基苯基)乙基(Z)-4-甲醛基-3-(2-氧代乙基)己基-4-烯酸酯(OLEA，俗名油精)等。OLEO由Montedoro等首次發(fā)現(xiàn)[4-5]，是一種比布洛芬活性更強(qiáng)的非甾體抗炎藥，也具有強(qiáng)抗氧化性、神經(jīng)保護(hù)、抗癌、抑菌等作用[6-7]；OLEA也具有強(qiáng)抗氧化、抗癌、抑菌等功能，同時(shí)對心血管疾病和細(xì)胞衰老具有預(yù)防和抑制作用[8-9]。但是，由于基因型、環(huán)境和加工技術(shù)等因素的相互作用，嚴(yán)重影響了橄欖油多酚產(chǎn)量和質(zhì)量[10-11]，導(dǎo)致OLEO和OLEA的分離、純化十分困難。目前研究發(fā)現(xiàn)，相比于傳統(tǒng)的液-液分離萃取、高效逆流色譜[12]、高真空輔助提取[13]等技術(shù)，利用離心分配色譜(CPC)技術(shù)可以對OLEO和OLEA進(jìn)行高效分離純化。CPC是一種由Nunogaki發(fā)明的現(xiàn)代逆流色譜技術(shù)[14-15]，可用于分離TPF，以獲得目標(biāo)化合物的富集餾分[16]，其原理是高速且連續(xù)性的液-液萃取[17]，具有分離速度快、效率高、總樣品回收率高(避免固體載體上不可逆的吸附)且重復(fù)性高、溶劑消耗少和容量高等特點(diǎn)[18]。CPC作為一種溫和而通用的技術(shù)，其高選擇性，也使得利用多種溶劑組合進(jìn)行不同目標(biāo)成分的分離純化具有可能性[16,19]。因此，CPC技術(shù)在天然活性產(chǎn)物分離、純化中的應(yīng)用越來越廣泛，而國內(nèi)目前仍鮮有報(bào)道。本研究基于CPC技術(shù)，快速分離、純化得到高純度的OLEO和OLEA單體化合物，并考察了其對ABTS+·、DPPH·的清除能力和總抗氧化能力(T-AOC)，以期為OLEO和OLEA單體的開發(fā)應(yīng)用提供參考。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原料、試劑與儀器

特級初榨橄欖油總多酚浸膏(TPF)原料，實(shí)驗(yàn)室自制[12]。正己烷、乙酸乙酯、乙醇、二氯甲烷(DCM)、甲酸、濃硫酸均為分析純；甲醇(MeOH)、乙腈(ACN)、水均為HPLC級；香蘭素和丁香醛標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，美國Sigma-Aldrich；TLC Silica gel 60 F254薄層層析硅膠板，美國默克公司；OLEO和OLEA標(biāo)準(zhǔn)品(純度≥98%)，實(shí)驗(yàn)室自制[20]，結(jié)構(gòu)如下圖1所示。

圖1 OLEO和OLEA結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The structures of OLEO and OLEA

ABTS自由基(ABTS+·)清除能力試劑盒、DPPH自由基(DPPH·)清除能力試劑盒、總抗氧化能力(T-AOC)測定試劑盒，南京建成生物工程研究所。

FCPC1000?快速離心分配色譜(CPC)儀，法國Kromaton公司；LC-20T高效液相色譜(HPLC)儀，日本島津公司；Avance核磁共振(NMR)儀(配備TXI冷凍探針(Wissembourg,France)及600 MHz的AVIII-600光譜儀)，德國Bruker公司；LTQ Orbitrap DiscoveryTM組合質(zhì)譜儀、MULTISKAN酶標(biāo)儀，美國Thermo公司。

1.2 OLEO/OLEA分析方法的建立

1.2.1HPLC色譜條件 色譜柱為SUPELCOSILTMLC-18(25 cm×21.2 mm, 5 μm)，流動相A為體積分?jǐn)?shù)1%甲酸水溶液，流動相B為5%甲醇和1%甲酸的乙腈溶液(即甲醇、甲酸和乙腈體積比5 ∶1 ∶94)，流速0.8 mL/min，進(jìn)樣量5 μL，梯度洗脫，以80%A開始洗脫，7 min內(nèi)流動相B調(diào)整為30%并保持18 min，之后10 min內(nèi)增加流動相B到95%，并保持5 min，最后調(diào)節(jié)流動相B至20%并保持5 min，總運(yùn)行時(shí)間45 min。

1.3 OLEO/OLEA分離純化

1.3.1CPC初步分離 取9 g TPF浸膏，甲醇溶解后，注入到CPC柱體內(nèi)，溶劑分離體系由體積比為3 ∶2 ∶3 ∶2的正己烷/乙酸乙酯/乙醇/水組成，固定相為該體系(體系混合后分層)的下層溶劑，流動相為其上層溶劑，設(shè)定流速50 mL/min，轉(zhuǎn)速500 r/min，每10 mL收集一次分離溶液。

1.3.2薄層層析色譜(TLC)分析 對CPC各分離溶液在F254硅膠板上進(jìn)行TLC分析，展開劑為DCM/MeOH(體積比95 ∶5)溶劑體系，然后分別在254和365 nm紫外光波長下進(jìn)行觀察。用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的香蘭素/乙醇溶液和體積分?jǐn)?shù)50%的濃硫酸/甲醇溶液等體積混合成顯色劑，再將顯色劑在硅膠板上進(jìn)行霧狀噴灑，在100～120 ℃下加熱2～3 min后各化合物顯色。根據(jù)顯色反應(yīng)，找到相應(yīng)的OLEO和OLEA餾分溶液；然后在40 ℃的真空條件下，分別將OLEO和OLEA餾分溶液以及其他餾分溶液進(jìn)行濃縮，得到含有OLEO、OLEA及其他化合物的提取物浸膏，4 ℃下冷藏放置備用。

表1 OLEO和OLEA制備液相色譜梯度洗脫Table 1 The gradient elution of OLEO and OLEA of pre-HPLC

1.3.3制備高效液相色譜(Pre-HPLC) 取OLEO和OLEA提取物浸膏，甲醇溶解后，首先通過制備液相色譜進(jìn)行純化，色譜柱為C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)，流動相為ACN和水，梯度洗脫程序見表1。根據(jù)相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間確定需要收集的洗脫溶液，但由于OLEO和OLEA在水中不能長時(shí)間穩(wěn)定存在，因此樣品溶液最好迅速于40 ℃ 水浴溫度下真空濃縮，然后置于真空干燥器中過夜干燥。

1.3.41H NMR分析 采用核磁共振儀進(jìn)行1H NMR分析。取干燥后的OLEO和OLEA粗品，用氘代氯仿溶解后，利用OLEO和OLEA標(biāo)準(zhǔn)品的1H NMR圖譜對該粗品進(jìn)行初步的結(jié)構(gòu)鑒定和純度分析，純度達(dá)到95%以上即可，否則重復(fù)1.3.3節(jié)步驟，最終得到OLEO和OLEA的高純度樣品。

1.3.5OLEO/OLEA的純度確定 將高純度的OLEO/OLEA樣品按1.2節(jié)HPLC分析條件，經(jīng)過0.45 μm濾膜過濾后依次進(jìn)樣5 μL檢測(進(jìn)樣3次)。通過HPLC檢測，由峰面積積分值的平均值和相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算得到樣品質(zhì)量濃度和得率，按峰面積歸一化法計(jì)算OLEO/OLEA的純度。

1.4 OLEO/OLEA的抗氧化活性評價(jià)

1.4.1DPPH·清除率的測定 使用DPPH·清除能力試劑盒測定質(zhì)量濃度分別為1、 0.5、 0.1、 0.05、 0.01、 0.005、 0.001和0 g/L的純度95%以上的OLEO和OLEA對DPPH·的清除能力，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，設(shè)置對照管、測定管、空白管，無水乙醇調(diào)零，測定其517 nm處的吸光度(A517)值，平行測定3次。DPPH·清除率(ηDPPH·)按下式計(jì)算：

ηDPPH·=(1-(A測定-A對照)/A空白)×100%

式中：A測定—測定溶液在517 nm處的吸光度值；A對照—對照溶液在517 nm處的吸光度值；A空白—空白溶液在517 nm處的吸光度值。

1.4.2ABTS+·清除能力的測定 使用ABTS+·清除能力試劑盒測定質(zhì)量濃度分別為1、 0.5、 0.1、 0.05、 0.01、 0.005、 0.001和0 g/L的純度95%以上的OLEO和OLEA對ABTS+·的清除能力，嚴(yán)格按試劑盒說明書操作，設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、測定孔，酶標(biāo)儀測定其在405 nm處的光密度(OD)值，平行測定3次。樣品對ABTS+·的清除能力可以用Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度來計(jì)算，即若樣品溶液與某個濃度的Trolox對ABTS+·的清除率相同，計(jì)算時(shí)其對ABTS+·的清除能力用Trolox的濃度來表示。根據(jù)本試劑盒提供的方法和溶液，分別配制濃度為0.10、 0.20、 0.40、 0.80和1.00 mmol/L的Trolox標(biāo)準(zhǔn)溶液，以標(biāo)準(zhǔn)品OD值為橫坐標(biāo)，各OD值對應(yīng)的樣品濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后把樣品溶液的平均OD值代入計(jì)算公式，即可得結(jié)果。

1.4.3總抗氧化能力(T-AOC)的測定 使用T-AOC試劑盒測定質(zhì)量濃度分別為1、 0.5、 0.1、 0.05、 0.01、 0.005、 0.001和0 g/L的純度95%以上的OLEO和OLEA的體外T-AOC，嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作，設(shè)置空白孔、標(biāo)準(zhǔn)孔、測定孔，酶標(biāo)儀測定其在593 nm下的OD值，平行測定3次。T-AOC用FeSO4·7H2O標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度來表示，即樣品測定的OD值與1 mmol/L的FeSO4·7H2O的OD值相同，則該樣品總抗氧化能力為1 mmol/L。根據(jù)試劑盒提供的方法和溶液，分別配制濃度為0.15、 0.30、 0.60、 0.90、 1.20和1.50 mmol/L 的FeSO4·7H2O標(biāo)準(zhǔn)溶液，以標(biāo)準(zhǔn)品OD值為橫坐標(biāo)，各OD值對應(yīng)的樣品濃度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后把樣品溶液的平均OD值代入計(jì)算公式，即可得結(jié)果。

2 結(jié)果與討論

2.1 OLEO和OLEA的分離純化

2.1.1CPC餾分、得率及其TLC分析 TPF經(jīng)過CPC的初步分離后，共得到了157組分離溶液，然后按照1.3.2節(jié)所述的TLC分析方法，將各個餾分進(jìn)行分析，顯色反應(yīng)結(jié)果見圖2～圖4。

圖2 CPC餾分的TLC分析結(jié)果Fig.2 The analytical results of fractions from CPC by TLC

圖3 CPC餾分在254 nm下的TLC分析結(jié)果Fig.3 The analytical results of fractions from CPC by TLC at 254 nm

圖4 CPC餾分在365 nm下的TLC分析結(jié)果Fig.4 The analytical results of fractions from CPC by TLC at 365 nm

根據(jù)OLEO和OLEA的特定顯色結(jié)果，迅速定位下一步要分析的餾分，即收集管103～111，含有OLEO，將其濃縮物定為餾分8(Fr.8)，質(zhì)量為1.987 0 g，得率為22.078%；收集管128～137，含有OLEA，將其濃縮物定為餾分10(Fr.10)，質(zhì)量為0.707 3 g，得率7.816%，其余CPC餾分的質(zhì)量和得率結(jié)果見表2。相比Taticchi等[13]改變橄欖油提取階段的真空系統(tǒng)來控制油橄欖細(xì)胞的機(jī)械和結(jié)構(gòu)特性，改善油滴的聚集，使酚類物質(zhì)從25.2%顯著提高到48.6%，因此，在確定了特定的目標(biāo)化合物OLEO和OLEA之后，說明通過CPC可實(shí)現(xiàn)對OLEO和OLEA快速、高效地初步分離，為進(jìn)一步分離純化得到更多的相應(yīng)單體化合物創(chuàng)造了良好的基礎(chǔ)。

表2 CPC各組餾分的質(zhì)量和得率Table 2 The quality and yield of fractions from CPC

2.1.2OLEO和OLEA的制備和1H NMR分析 通過Pre-HPLC，對含有OLEO的Fr.8和含有OLEA的Fr.10進(jìn)一步分離純化，發(fā)現(xiàn)OLEO的出峰時(shí)間在15.5～20.1 min，而OLEA的出峰時(shí)間在13.2～20.2 min， 收集對應(yīng)色譜峰的洗脫溶液，立即于40 ℃下真空濃縮、干燥，分別得到純化過的高純度OLEO和OLEA樣品。依據(jù)1.3.4節(jié)方法分別對其進(jìn)行1H NMR分析，同時(shí)對應(yīng)OLEO和OLEA標(biāo)準(zhǔn)品的1H NMR圖譜，結(jié)果見圖5。

a.Pre-HPLC OLEO; b.OLEO標(biāo)準(zhǔn)品standard of OLEO; c.Pre-HPLC OLEA; d.OLEA標(biāo)準(zhǔn)品standard of OLEA圖5 OLEO/OLEA的1H NMR圖譜Fig.5 1H NMR spectra of OLEO/OLEA

根據(jù)文獻(xiàn)[21～22]報(bào)道可知，由于該OLEO和OLEA樣品與其標(biāo)準(zhǔn)品的1H NMR圖譜的氫原子特征峰具有相同的化學(xué)位移，以及對應(yīng)峰組面積的氫原子數(shù)目，且OLEO和OLEA標(biāo)準(zhǔn)品的純度大于98%，因此，OLEO和OLEA的樣品已達(dá)到較高的純度，具體純度數(shù)值需要進(jìn)一步分析。

2.1.3Pre-HPLC制備的OLEO和OLEA的純度測定 根據(jù)1.3.3節(jié)的Pre-HPLC方法分別制備OLEO和OLEA，結(jié)果見圖6。

圖6 OLEO/OLEA的Pre-HPLC(a,b)和HPLC(c,d)圖Fig.6 Pre-HPLC(a,b) and HPLC(c,d) of OLEO/OLEA

為了得到高純度的樣品，收集其特征峰峰腰至峰頂時(shí)間段的制備溶液，濃縮后，根據(jù)1.3.5節(jié)方法，將配制的質(zhì)量濃度為1 g/L高純度的OLEO和OLEA粗品溶液進(jìn)行HPLC分析，根據(jù)OLEO和OLEA標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，故得到樣品純度分別為98.78%和97.75%，由于標(biāo)準(zhǔn)品純度為大于等于98%，因此對應(yīng)的實(shí)際純度為大于等于96.80%和95.79%。因此，最終得到純度在95%以上的高純度OLEO和OLEA，質(zhì)量分別為422.3 mg和OLEA 163.0 mg，得率分別為4.69%和1.81%。

2.2 OLEO/OLEA的抗氧化活性

2.2.1DPPH·清除能力 OLEO和OLEA對DPPH·的清除率結(jié)果見圖7(a)。由圖7(a)可以看出，在質(zhì)量濃度0～0.10 g/L范圍內(nèi)，OLEO和OLEA對DPPH·的清除率不斷增加，在低質(zhì)量濃度時(shí)即0.10 g/L之前，兩者的抗氧化能力均隨質(zhì)量濃度的升高迅速增加，但OLEO的抗氧化活性始終低于OLEA；當(dāng)質(zhì)量濃度為0.1～1 g/L時(shí)，OLEO的抗氧化能力增長緩慢，最高達(dá)到77.79%；而OLEA的抗氧化能力在0.1～1 g/L范圍內(nèi)趨于平穩(wěn)，DPPH·的清除率基本穩(wěn)定在90%左右。此外，OLEO對DPPH·的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)值為0.029 g/L，OLEA對DPPH·的IC50值為1.85×10-11g/L，說明在低質(zhì)量濃度下OLEA的抗氧化能力遠(yuǎn)大于OLEO。

2.2.2ABTS+·清除能力 首先測得Trolox的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=-0.749 4X+1.183 4，R=0.995 6，OLEO和OLEA對ABTS+·的清除能力結(jié)果見圖7(b)。由圖7(b)可以看出，在質(zhì)量濃度0～0.10 g/L范圍內(nèi)，以Trolox濃度表示的ABTS+·清除能力不斷增加，在質(zhì)量濃度較低(0～0.10 g/L)時(shí)，兩者的抗氧化能力均隨質(zhì)量濃度的升高迅速增加，但OLEO的抗氧化活性始終低于OLEA；當(dāng)質(zhì)量濃度為0.1～1 g/L時(shí)，兩者的抗氧化能力增長緩慢，OLEO的ABTS+·清除能力最高達(dá)到Trolox 0.765 5 mmol/L，而OLEA的ABTS+·清除能力最高達(dá)到Trolox 0.894 2 mmol/L。說明在整個質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，OLEA的抗氧化能力大于OLEO，且在質(zhì)量濃度0.1～1 g/L時(shí)，質(zhì)量濃度越大，差別越不明顯。

2.2.3T-AOC 首先測得FeSO4的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程為Y=0.182 5X+0.104 6，R=0.995 3，OLEO和OLEA的T-AOC結(jié)果見圖7(c)。由圖7(c)可以看出，以FeSO4·7H2O濃度表示的總抗氧化能力不斷增加，在質(zhì)量濃度較低(0～0.10 g/L)時(shí)，兩者的總抗氧化能力均隨質(zhì)量濃度的升高緩慢增加，但OLEO的抗氧化活性始終低于OLEA；當(dāng)質(zhì)量濃度為0.1～1 g/L時(shí)，OLEO的總抗氧化能力并無明顯增長，最高僅達(dá)到FeSO40.157 1 mmol/L，而OLEA的總抗氧化能力迅速增加，最高達(dá)到FeSO40.646 2 mmol/L。說明在整個質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，OLEA的總抗氧化能力大于OLEO，且在質(zhì)量濃度為0.1～1 g/L時(shí)，質(zhì)量濃度越大，差別越明顯。

a.DPPH·清除率scavenging rate of DPPH·; b.ABTS+·清除能力scavenging ability of ABTS+·; c.T-AOC圖7 OLEO/OLEA抗氧化活性Fig.7 The antioxidant activities of OLEO/OLEA

3 結(jié) 論

3.1以特級初榨橄欖油總多酚浸膏為原料，通過CPC初步分離和TLC分析得到14種餾分，其中對應(yīng)OLEO和OLEA化合物的Fr.8和Fr.10質(zhì)量分別為1.987 0和0.707 3 g，得率分別為22.078%和7.816%；利用Pre-HPLC、1H NMR等技術(shù)進(jìn)一步純化、分析，得到純度95%以上的OLEO 422.3 mg和OLEA 163.0 mg，得率分別為4.69%和1.81%。

3.2考察了不同質(zhì)量濃度的OLEO和OLEA的抗氧化能力，結(jié)果表明：隨著質(zhì)量濃度的增大，OLEO和OLEA的DPPH·清除率先快速增加后趨于穩(wěn)定，IC50值分別為0.029和1.85×10-11g/L；而兩者對ABTS+·的清除能力和T-AOC則先迅速增加后緩慢增加，OLEO和OLEA對ABTS+·的清除能力最高分別為0.765 5和0.894 2 mmol/L(以Trolox計(jì))，OLEO和OLEA的總抗氧化能力最高分別達(dá)到0.157 1和0.646 2 mmol/L(以FeSO4計(jì))。整體上，OLEA具有比OLEO更強(qiáng)的抗氧化能力，尤其是OLEA的T-AOC 明顯高于OLEO。