陳顯振 朱信霖 姜偉偉 扈東營 張克明 方文捷 潘煒華 劉曉剛 廖萬清

(1.海軍軍醫(yī)大學第二附屬醫(yī)院皮膚科，上海 200003; 2.上海市醫(yī)學真菌分子生物學重點實驗室，上海 200003)

【關(guān)鍵字】 煙曲霉；煙酰胺；伊曲康唑；聯(lián)合治療

近年來，隨著器官移植、免疫抑制劑的應(yīng)用、放化療等醫(yī)療手段的不斷發(fā)展，侵襲性曲霉病發(fā)病率逐年上升[1]。煙曲霉是侵襲性曲霉病的主要病原體，占比約90%，其次為黃曲霉和黑曲霉。目前治療該疾病的藥物較為局限，主要有唑類、多烯類和棘白菌素類藥物。肝腎毒性、電解質(zhì)紊亂等不良反應(yīng)限制了兩性霉素B的應(yīng)用[2]，而棘白菌素類藥物因價格昂貴、缺乏口服劑型，臨床應(yīng)用受限[3]。自1997年首次報道煙曲霉伊曲康唑耐藥株以來，全世界多個國家陸續(xù)報道煙曲霉對唑類耐藥現(xiàn)象，且呈上升趨勢[4]。因此，臨床亟需發(fā)掘新的抗真菌藥物及抗真菌藥物增敏劑。

煙酰胺為維生素B3體內(nèi)衍生物，可用于糙皮病、神經(jīng)退行性疾病和皮膚癌等臨床疾病的治療與預(yù)防[5-7]，同時，煙酰胺還可用于農(nóng)作物真菌病害的防治，如啶酰菌胺(煙酰胺類內(nèi)吸收性殺菌劑)通過抑制菌絲及孢子生長，從而對農(nóng)作物真菌性侵害發(fā)揮良好的防治效果[8]。既往研究表明煙酰胺對多種微生物具有抑制作用[9-14]，同時煙酰胺還可以增強青蒿素、氯喹、乙胺的抗瘧作用[11]以及氟康唑的抗真菌活性[13]。然而煙酰胺對煙曲霉的抗真菌能力尚不明確，與伊曲康唑聯(lián)用是否具有增效能力也未確定。本研究通過體外藥敏實驗對煙酰胺的抗煙曲霉活性及聯(lián)合對伊曲康唑的增效活性進行探索，為臨床抗真菌用藥提供新思路。

1 材料和方法

1.1 菌株

15株煙曲霉，均來自上海市醫(yī)學真菌分子生物學重點實驗室菌種庫。

1.2 抗真菌藥物

伊曲康唑(ITR)、煙酰胺(NAE)，均購于Sigma。ITR用二甲基亞砜(DMSO)溶解并配成6 400 μg/mL的儲存液，NAE用生理鹽水配成200 mg/mL的儲存液。

1.3 抗真菌藥敏試驗

伊曲康唑及煙酰胺單獨作用于煙曲霉的藥敏試驗 根據(jù)CLSI M38-A2方案[15]進行煙曲霉的體外抗真菌藥物敏感性測定(工作濃度梯度分別為：ITR 0.12～16 μg/mL，NAE 0.8～102.4 mg/mL)；質(zhì)控菌株為克柔念珠菌ATCC 6258。48 h后觀察結(jié)果，與陽性對照孔相比≥50%生長抑制所對應(yīng)的藥物濃度為質(zhì)控菌株的MIC，100%抑制煙曲霉生長所對應(yīng)的濃度為煙曲霉的MIC值。

伊曲康唑聯(lián)合煙酰胺的抗煙曲霉活性參照CLSI M38-A2方案并稍作修改進行菌株藥物敏感性測定，將藥物儲存液用RPMI-1640稀釋為4倍最大工作濃度(工作濃度梯度分別為：ITR 0.00375～0.5 μg/mL，NAE 0.2～25.6 mg/mL)，倍比稀釋為所需濃度梯度。按照如下方法進行操作：使用排槍分別取50 μL倍比稀釋的伊曲康唑工作液，自高濃度至低濃度依次加至96孔板的第1～8列；自高濃度到低濃度的順序，取50 μL倍比稀釋后的煙酰胺工作液依次加入96孔板的第1～8行；向已加藥液孔分別加入100 μL菌懸液；第11列為陰性對照(只加200 μL RPMI-1640)，第12列為生長對照(100 μL菌懸液加100 μL RPMI-1640)。37℃恒溫培養(yǎng)48 h，用放大鏡觀測儀判定結(jié)果。

聯(lián)合用藥效能評價標準：分級抑制指數(shù)(FICI)=MIC(A藥聯(lián)合)/MIC(A藥單用)+MIC(B藥聯(lián)合)/MIC(B藥單用)。當FICI≤0.5時，兩藥為協(xié)同作用；當0.54時，兩藥為拮抗作用。

1.4 RT-qPCR檢測煙曲霉膜蛋白及外排泵相關(guān)基因表達水平

以煙曲霉標準株Af293為研究對象，向SDB培養(yǎng)基中加入孢子，使最終菌密度為(1～5)×105CFU/mL，220 r/min，35℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h后，分別加入煙酰胺與伊曲康唑使每管藥物濃度達到亞致死濃度(煙酰胺12.8 mg/mL，伊曲康唑0.12 μg/mL)，培養(yǎng)8 h后收集菌絲[17]。參照絲狀菌RNA抽提和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TIANGEN)操作得到cDNA，對膜蛋白基因cyp51A、erg3、erg24、erg25及外排泵基因cdr1B基因表達進行PCR擴增，內(nèi)參為GAPDH,反應(yīng)過程：95℃，3 min；95℃ 5s、60℃ 10s、72℃ 15s，40個循環(huán)。采用2-ΔΔCT法進行數(shù)據(jù)分析，相關(guān)引物見表1。

表1 引物序列

2 結(jié) 果

2.1 伊曲康唑及煙酰胺單獨作用于煙曲霉的藥敏試驗

體外藥物敏感性試驗表明，煙酰胺對煙曲霉具有抑菌作用，MIC為12.8～25.6 mg/mL。15株煙曲霉中有2株(CZZJ100527、CZZJ100528)伊曲康唑的MIC>2 μg/mL，對伊曲康唑耐藥株，其余MIC為0.25～1 μg/mL ，為伊曲康唑敏感株(見表2)。

2.2 伊曲康唑聯(lián)合煙酰胺的抗煙曲霉活性

煙酰胺聯(lián)合伊曲康唑?qū)?5株煙曲霉的MIC值見表2。煙酰胺的MIC值由12.8～25.6 mg/mL降至0.2～6.4 mg/mL，伊曲康唑的MIC值由0.25～16 μg/mL降至0.00375～0.12 μg/mL。煙酰胺聯(lián)合伊曲康唑的FICI值均小于0.5，表明煙酰胺聯(lián)合伊曲康唑具有協(xié)同作用。

表2 煙酰胺單用及聯(lián)合伊曲康唑作用于煙曲霉的MIC值

2.3 RT-qPCR檢測煙曲霉膜蛋白及外排泵相關(guān)基因表達水平

通過對膜蛋白及外排泵相關(guān)基因進行相對表達分析，結(jié)果顯示，與對照組相比，煙酰胺加藥組膜蛋白基因cyp51A、erg3、erg24、erg25及外排泵基因cdr1B的表達水平顯著下調(diào)；與伊曲康唑加藥組相比，聯(lián)合加藥組cyp51A、erg3、erg24、erg25、cdr1B的mRNA表達水平顯著降低。說明NAE作用于Af293可下調(diào)膜蛋白基因cyp51A、erg3、erg24、erg25及外排泵基因cdr1B的表達水平，而且NAE對ITR降低Af293膜蛋白基因cyp51A、erg3、erg24、erg25及外排泵基因cdr1B的mRNA水平有增效作用(見圖1)。

圖1 AF293加藥組與不加藥組膜蛋白及外排泵蛋白的基因相對表達量

3 討 論

近年來，隨著免疫抑制人群數(shù)量的不斷增加，侵襲性曲霉病的發(fā)病率也不斷升高，全世界年發(fā)病率約為25萬例[18]，煙曲霉是侵襲性曲霉病最常見的病原體[19]。很多研究報道煙酰胺具有保護神經(jīng)、抗炎、抗糖尿病、保護皮膚及緩解腎功能不全等功能[20]，近些年發(fā)現(xiàn)煙酰胺對一些微生物如結(jié)核分枝桿菌、HIV、念珠菌、隱球菌等具有抑制作用[9,13,21]，然而煙酰胺對煙曲霉的抑制情況尚無相關(guān)報道，本研究發(fā)現(xiàn)，NAE對煙曲霉具有抑制作用，MIC為12.8～25.6 mg/mL，與煙酰胺對念珠菌的抑菌濃度相近[13]。伊曲康唑為臨床曲霉病的常用藥，然而自1997年Denning[22]課題組首次報道檢出對伊曲康唑耐藥的煙曲霉后，全球范圍內(nèi)有關(guān)煙曲霉對伊曲康唑耐藥的報道日漸增多。有研究發(fā)現(xiàn)通過藥物聯(lián)用方式，不僅可以增效還可以逆轉(zhuǎn)耐藥株，如漢防己甲素與伊曲康唑聯(lián)合使用時，漢防己甲素可增加伊曲康唑抑制煙曲霉的作用同時可逆轉(zhuǎn)伊曲康唑耐藥株[23]，煙酰胺聯(lián)合氟康唑也具有協(xié)同抑制白念珠菌及逆轉(zhuǎn)氟康唑耐藥株的作用[13]。因此本研究對煙曲霉進行煙酰胺聯(lián)合伊曲康唑的藥敏實驗，結(jié)果發(fā)現(xiàn)煙酰胺可增強伊曲康唑抑制煙曲霉的作用，且對伊曲康唑耐藥煙曲霉菌株具有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用，為伊曲康唑增敏劑研究提供了新的思路。

煙曲霉對唑類藥物耐藥機制主要有唑類藥物靶蛋白(Cyp51A)過表達及外排泵蛋白的過表達等[24]。因此可通過抑制麥角甾醇的生物合成及抑制外排泵基因的表達來增強唑類藥效[25]。Cyp51A為14-α-羊角甾醇去甲基酶，唑類與該酶結(jié)合抑制該酶活性，影響麥角甾醇合成及細胞膜結(jié)構(gòu)和功能，Erg3、Erg24、Erg25均為麥角甾醇合成過程中的催化酶[26]。Cdr1B屬于三磷酸腺苷結(jié)合盒(ATP-binding cassette)轉(zhuǎn)運蛋白超家族，英國Paul Bowyer課題組發(fā)現(xiàn)該蛋白的高表達可以增加煙曲霉對伊曲康唑的耐藥性[27]。我們對部分麥角甾醇合成通路蛋白的基因cyp51A、erg3、erg24、erg25及外排泵基因cdr1B進行了加藥與不加藥的RT-qPCR檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)單用煙酰胺時，這些基因的表達較對照組下調(diào)，聯(lián)合用藥時，這些基因較伊曲康唑組下調(diào)，由此推測，煙酰胺可能通過抑制膜蛋白及外排泵相關(guān)基因的表達來發(fā)揮抑菌作用，從而聯(lián)合伊曲康唑發(fā)揮抗煙曲霉的增效作用，但具體的信號通路和作用機制有待進一步研究。綜上，本研究為煙曲霉感染患者的臨床用藥提供新的思路。