陳 敏， 胡紹勇， 何成思， 鄒爭志*

(1. 廣州醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院影像科， 廣州 511300； 2. 南方醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院影像科， 廣州 510630； 3. 華南師范大學生物光子學研究院激光生命科學研究所暨激光生命科學教育部重點實驗室， 廣州 510631)

乳腺癌是女性中最常見的惡性腫瘤，其死亡率和發(fā)病率每年持續(xù)上升，近年來已上升至女性腫瘤中的第一位。誘發(fā)乳腺癌發(fā)生發(fā)展的原因很多，有遺傳因素、環(huán)境因素、原癌基因和抑癌基因的突變等，其中環(huán)境因素可能是乳腺癌發(fā)病率上升的重要因素。根據癌組織免疫組織化學檢查結果，乳腺癌分為4種臨床病理亞型：Luminal-A型、Luminal-B型、三陰乳腺癌 (Triple Negative Breast Cancer，TNBC)和Her-2型，其中Her-2型又分為HR陰性型和HR陽性型。TNBC是指雌激素受體(ER)、孕激素受體(PR)和Her-2均為陰性的乳腺癌，占所有乳腺癌病理類型的10%～20.8%，具有特殊的病理特征，表現為高侵襲和遠處轉移性、預后較差、5年復發(fā)率較高、病人整體5年生存率較低。然而，與Luminal型腫瘤相比較，其對化療藥更敏感。因此，臨床上常聯合手術或放療聯合化療藥物治療TNBC。

乳腺癌發(fā)生遠處轉移是導致病人死亡的一個重要原因，因此，針對腫瘤轉移的干預治療能顯著提高乳腺癌患者的生存時間。TNBC在臨床上的表現多為遠處肺轉移和腦轉移。TNBC發(fā)生轉移的因素十分復雜，有腫瘤細胞內在的因素，也有腫瘤細胞周圍微環(huán)境的因素，甚至遠處靶器官的微環(huán)境也是重要的因素。腫瘤細胞內在的因素主要包括促腫瘤轉移相關基因的激活和抑腫瘤轉移相關基因的失活，如BRAC1/2基因突變激活和TP53基因失活。腫瘤細胞周圍微環(huán)境的成分主要包括腫瘤細胞周圍免疫細胞(如巨噬細胞)、腫瘤相關成纖維細胞以及細胞因子，這些因素對腫瘤細胞遷移、侵襲及凋亡有重要的影響[1-2]。腫瘤細胞能否在遠處靶器官駐留增殖完全依賴于靶器官提供的生長因子微環(huán)境。已有研究表明乳腺癌微環(huán)境中巨噬細胞通過分泌CCL18促進TNBC細胞轉移[3-4]。實體腫瘤中由于微小血管的缺陷不能提供足夠的氧分子，因而表現為低氧的微環(huán)境。已有研究發(fā)現低氧微環(huán)境能夠促進腫瘤細胞發(fā)生轉移[5],然而低氧微環(huán)境對TAM的促腫瘤轉移功能是否存在潛在影響，目前尚未見研究報導。本研究旨在探討腫瘤相關巨噬細胞(Tumor-Associated Macrophages，TAM)在低氧環(huán)境下對TNBC細胞轉移能力的影響，以期為臨床TNBC轉移的干預治療提供新的理論依據。

1 材料與方法

1.1 試劑

佛波醇12-十四酸酯13-乙酸酯(Phorbol 12-myristate 13-aceteat,PMA)購自Sigma公司，貨號：P1585，細胞培養(yǎng)液的質量濃度：20 ng/mL；DAPI和DMSO購自Sigma公司；胰蛋白酶消化液購自Thermo Scientific公司；CCL18試劑盒購自R&D Systems公司；IL-10試劑盒購自eBiosciences公司；CCL17和CCL22試劑盒購自Ray Biotech公司，TRIzolTM試劑購自Thermo Fisher公司，RT-PCR試劑盒購自Thermo Fisher公司。

1.2 細胞培養(yǎng)

三陰乳腺癌細胞MDA-MB-231和BT-549(購自ATCC)置于含φ=10%的胎牛血清(Gbico)的DMEM培養(yǎng)基中，人源單核細胞THP-1(購自中科院上海細胞庫)置于含φ=10%的胎牛血清的1640培養(yǎng)基中。常氧培養(yǎng)條件為：37 ℃、φ=5%的CO2、飽和濕度的細胞培養(yǎng)箱；低氧培養(yǎng)條件為：置于37 ℃恒溫箱內,持續(xù)通入V(N2)∶V(CO2)∶V(O2)=94∶5∶1的混合氣體,維持飽和濕度；所有細胞經檢測無支原體污染。

1.3 THP-1誘導分化為巨噬細胞

將1×106個THP-1接種于6孔板，每孔添加PMA,使其終質量濃度為20 ng/mL，培養(yǎng)72 h后去除未貼壁細胞，貼壁細胞即為M0巨噬細胞。

1.4 Transwell法檢測腫瘤細胞遷移

對數生長期乳腺癌細胞經過巨噬細胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h，然后經胰酶消化，用無血清RMPI-1640培養(yǎng)液按照每孔200 μL細胞懸液含10 000個細胞的密度接種于Transwell上室。下室為500 μL腫瘤細胞的生長培養(yǎng)液。置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)18 h后，取上室于φ=75%的酒精中固定20 min，經過PBS清洗3次，用棉簽搽除小室內側細胞，最后經過10 μg/mL的DAPI染色后，在顯微鏡下觀察并統計遷移的細胞數量。

1.5 RT-PCR檢測

對數生長期MDA-MB-231細胞經過巨噬細胞條件培養(yǎng)液培養(yǎng)48 h后，用TRIzolTM試劑提取總RNA，用SuperScript IV 一步法RT-PCR試劑盒逆轉錄成cDNA，然后完成RT-PCR檢測。檢測基因引物如下：E-cadherin：5-TTGCTACTGGAACAGGGACA-3(正向)，5-GTATTGGGAGGAAGGTCTGC-3(反向)；Vimentin：5-GAAGAGAACTTTGCCGTTGA-3(正向)，5-CGAAGGTGACGAGCCATT-3(反向)；SNAIL1：5-TTACCTTCCAGCAGCCCTAC-3(正向)，5-GACAGAGTCCCAGATGAGCA-3(反向)；內參基因:GAPDH 5-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3(正向)，5-GTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3(反向)。

1.6 腫瘤轉移CT掃描

THP1誘導而來的TAM，經過低氧培養(yǎng)后，收集TAM條件培養(yǎng)液處理MDA-MB-231細胞48 h。MDA-MB-231細胞經過胰酶消化后，用無血清RMPI-1640培養(yǎng)液按照100 μL含100 000個細胞的密度，經過尾靜脈注射移植于裸鼠體內。裸鼠經過飼養(yǎng)45 d后，通過CT掃描拍照。CT儀器為東芝64排多層螺旋CT，型號：TSX-101A。掃描方法：將小鼠固定四肢放置在CT掃描床中間，掃描范圍從小鼠頭部至小鼠尾部，包完整只小鼠。掃描完成后，以橫斷位肺窗及軟組織窗為主參數，重建工作站, 用1 mm薄層重建出全胸圖片后選取圖像，統計轉移灶。

1.7 ELISA法檢測細胞因子濃度

將TAM條件培養(yǎng)液按一定比例稀釋。在對應96孔的ELISA板的每個孔中加入100 μL上述條件培養(yǎng)液，置于4 ℃冰箱過夜。倒空液體，用紙巾吸干表面，并拍干殘留液體，用300 μL洗滌液清洗2次。然后加300 μL封閉液于每個孔中，室溫孵育1 h，倒掉殘余液體(方法同上)。每個孔中加100 μL羊抗小鼠二抗，室溫孵育1 h，倒掉殘余液體(方法同上)。每個孔中加滿洗滌液，倒空液體并拍干殘留液體，重復3次。用洗滌液浸泡5 min，拍干殘留液體，每個孔中加100 μL底物，顯色30 min后，立即在酶標儀(Tecan)上檢測，波長為405～410 nm。

1.8 分析乳腺癌組織CCR4表達

通過在線軟件TCGA(https:∥www.aclbi.com/static/index.html#/tcga)，分析數據庫中乳腺癌組織和癌旁正常組織CCR4的表達。

1.9 統計學分析

2 結果與分析

2.1 巨噬細胞在低氧條件下促進三陰乳腺癌細胞遷移

為了評估低氧是否激活了TAM的促三陰乳腺癌細胞的轉移功能，本研究選取了BT-549細胞和MDA-MB-231細胞進行遷移實驗。首先，分別收集M0巨噬細胞、TAM和低氧培養(yǎng)的TAM的條件培養(yǎng)液(Condition Media，CM)；然后，用以上收集的3種CM處理BT-549細胞和MDA-MB-231細胞48 h后完成遷移實驗。結果(圖1)表明：相對于M0巨噬細胞CM處理的TNBC細胞，經過TAM的CM處理的TNBC細胞具有更強的遷移能力；與正常培養(yǎng)的TAM相比，低氧培養(yǎng)的TAM進一步促進了腫瘤細胞遷移，且差異具有統計學意義(P<0.01)。

圖1 3種CM處理的三陰乳腺癌細胞Transwell實驗

上皮-間質轉化(Epithelial-mesenchymal Transition，EMT)是腫瘤發(fā)生轉移過程中的一個重要特征。為了進一步驗證腫瘤細胞的轉移能力，通過RT-PCR檢測了EMT標志物基因(E-cadherin、ZEB1、SNAIL1)的mRNA表達水平。結果(圖2)表明：相對于常氧培養(yǎng)的腫瘤相關巨噬細胞，低氧處理的腫瘤相關巨噬細胞更能顯著地誘導MDA-MB-231細胞的EMT轉化，表現為上皮型標志基因E-cadherin表達下降和間質型標志基因ZEB1、SNAIL1表達上升。

圖2 RT-PCR檢測3種CM處理的MDA-MB-231細胞遷移相關基因表達

2.2 巨噬細胞促進三陰乳腺癌細胞肺轉移

以上體外實驗表明TAM在低氧條件下能夠促進TNBC細胞遷移，接下來探討低氧培養(yǎng)的TAM是否能夠促進TNBC在體內的轉移。MDA-MB-231細胞分別經過TAM的CM和低氧培養(yǎng)的TAM的CM處理72 h后，經尾靜脈注入裸鼠體內。飼養(yǎng)4周后，經過CT掃描觀察肺部。結果(圖3)表明低氧處理的TAM顯著誘導了MDA-MB-231細胞的肺轉移：低氧處理的TAM誘導腫瘤細胞在肺部的腫瘤轉移灶數目顯著高于常氧培養(yǎng)的TAM。

圖3 CT掃描檢測三陰乳腺癌細胞肺轉移灶

2.3 低氧誘導巨噬細胞分泌CCL22

已有研究[6]報導TAM能分泌CCL18、CCL17、CCL22和IL-10等促腫瘤轉移因子。因此，本研究通過ELISA實驗，將CCL18、CCL17、CCL22和IL-10因子分別在低氧、常氧培養(yǎng)的TAM條件培養(yǎng)液中進行檢測，以探討低氧是否刺激TAM表達這4種轉移因子。檢測結果(圖4)表明CCL22可能是低氧TAM刺激TNBC轉移的重要因子：CCL18在TAM中表達最高，而CCL22和IL-10表達相對較低；低氧能夠顯著刺激CCL22表達的上升，而對其他3個細胞因子表達無顯著影響。

2.4 CCL22促進三陰乳腺癌遷移

為了進一步證明CCL22是否促進了TNBC的轉移，TNBC細胞MDA-MB-231和BT-549經0、5、10 ng/mL的CCL22處理48 h，然后進行Transwell實驗。結果(圖5)顯示：5、10 ng/mL的CCL22能夠顯著地促進MDA-MB-231、BT-549細胞的遷移。

圖4 通過ELISA方法檢測巨噬細胞分泌細胞因子的質量濃度

圖5 不同質量濃度的CCL22誘導的三陰乳腺癌細胞Transwell實驗

2.5 CCR4介導低氧條件下巨噬細胞促進三陰乳腺癌細胞遷移

已有報道[6]表明CCL22通過與其受體CCR4結合來激活細胞的下游信號，從而促進細胞的運動與遷移。接下來，本研究探討CCR4基因是否在腫瘤細胞中存在高表達，從而促進TNBC細胞的遷移。通過TCGA在線數據庫分析CCR1至CCR5基因的表達，結果(表1)表明CCL22與CCR4的結合在促進乳腺癌轉移中起了重要作用：相對于正常組織，CCR3、CCR4和CCR5在腫瘤組織中表達顯著升高，其中，CCR4升高最顯著。

表1 CCR家族基因在乳腺癌組織與正常組織中表達的差異與比值Table 1 The expression and ratio of CCR family members in breast cancer tissue and normal tissue

3 討論

TNBC占乳腺癌病例的10%～20%。由于雌激素受體、孕激素受體和Her-2均為陰性，目前缺乏特異性針對TNBC的抗激素療法。目前，除了傳統的化療外，僅有少數的靶向治療方法應用于臨床的TNBC治療。TNBC是高轉移性的乳腺癌，其轉移機制十分復雜。已有研究發(fā)現，TNBC的高轉移與腫瘤細胞自身癌基因信號通路的激活及抑癌基因信號通路的失活有關，如：PI3K/AKT和WNT/β-catenin信號通路的激活[7-8]。盡管已有針對這些信號通路的靶向抑制劑，然而并沒有在臨床上應用。實體腫瘤常處于缺氧環(huán)境，有研究發(fā)現缺氧能夠誘導腫瘤細胞發(fā)生轉移[9]，機制研究表明缺氧激活了HIFα信號通路，從而促進了腫瘤細胞的遷移能力[10]。腫瘤微環(huán)境存在大量的免疫細胞，其中TAM與乳腺癌細胞的轉移密切相關。目前的觀點認為，TAM主要分為M1型和M2型，其中M1型主要起抗腫瘤作用，而M2型起促腫瘤作用[11]。 如：鄒爭志等[12]發(fā)現M2型TAM能夠增強宮頸癌對化療藥的抵抗，證明了M2型TAM具有促腫瘤發(fā)展的作用；在乳腺癌的研究中，CHEN等[3]發(fā)現TNBC細胞促進TAM轉化成M2型，M2型TAM通過分泌CCL18反過來促進TNBC細胞的轉移；TU等[13]發(fā)現M2型TAM分泌IRF7調節(jié)因子和促進miR-1587在乳腺癌細胞中的表達，從而誘導乳腺癌細胞轉移；ALLEN等[14]發(fā)現TAM通過激活炎性乳腺癌細胞RhoC-GTPase信號通路來促進癌細胞轉移。本研究發(fā)現TAM能夠顯著促進TNBC細胞的轉移，該研究結果與已有研究結果[13]是一致的。更重要的是，本研究發(fā)現低氧能夠更進一步地增強TAM促進乳腺癌細胞轉移的能力。

盡管有一些研究報道低氧能直接促進腫瘤細胞的轉移[15]、TAM增強了TNBC細胞的轉移潛能[16]。然而，關于TAM在低氧狀態(tài)下的促腫瘤轉移能力是否增強尚未見文獻報道。本研究通過小鼠體內實驗和體外細胞實驗，證明了缺氧能夠激活TAM的促腫瘤轉移功能。機制上的研究[17]也表明:低氧刺激了TAM細胞CCL22表達的上調，CCL22通過分泌到腫瘤微環(huán)境來促進TNBC細胞的遷移；CCL22是一個促腫瘤轉移的重要趨化因子，其表達受到多個信號通路的調節(jié)；IL4和IL13通過激活STAT3信號通路來促進CCL22的表達，而IFN-γ抑制CCL22的表達。本研究指出低氧促進巨噬細胞表達CCL22，這意味著低氧有可能激活了促進CCL22表達的信號通路，或抑制了下調CCL22表達的信號通路。低氧是否激活IL4和IL13信號或抑制IFN-γ信號，需要進一步的研究。有研究[18]報道低氧能夠激活STAT3，STAT3進一步上調HIFα的表達。HIFα作為一個轉錄因子能夠調節(jié)許多基因的表達，然而至今尚未有研究報道HIFα調節(jié)CCL22的表達。本研究通過TCGA在線數據庫分析CCR家族基因在乳腺癌中的表達，發(fā)現相對于正常組織，CCR4在乳腺癌組織表達升高最顯著。CCR家族下游存在許多與腫瘤轉移相關的信號通路，如PKC、JNK、AKT、MAPK等信號通路[19]。CCL22通過激活CCR4來促進TNBC轉移是否與上面這幾條信號通路有關，在本研究中并沒有闡明清楚，需要進一步的驗證。

4 結論

本研究發(fā)現TAM在低氧條件下促進三陰乳腺癌細胞遷移，并進一步在小鼠體內模型中驗證了TAM促進三陰乳腺癌細胞肺轉移。通過機制研究，發(fā)現低氧誘導巨噬細胞分泌CCL22，CCL22在促進三陰乳腺癌遷移中起了重要作用；通過TCGA在線數據庫，進一步證明CCL22受體CCR4和腫瘤的發(fā)展密切相關。