王一涵, 王奕丹, 惠赫童, 范馨元, 王添琦, 夏 薇, 劉麗梅

（北華大學醫(yī)學技術學院實驗中心，吉林 吉林 132013）

急性淋巴細胞白血?。╝cute lymphoblastic leukemia，ALL）是一種由淋巴細胞異常增生引起的淋巴祖細胞惡性疾病。異常增生的白血病細胞可在骨髓聚集并抑制正常造血功能，同時也可侵犯骨髓外的組織。在ALL 治療方案中通常包括髓外浸潤預防治療，然而白血病細胞髓外浸潤仍然是一個主要的臨床問題，具有很高的抗化療復發(fā)風險［1-2］。近年來，隨著腫瘤細胞生物學及分子生物學檢測技術的快速發(fā)展，血清游離DNA （circulating free DNA，cfDNA） 甲基化成為腫瘤檢測與病情監(jiān)測的研究熱點［3］。血清cfDNA 是外周血中存在的非結(jié)合DNA，多種惡性腫瘤患者的血清cfDNA 具有與腫瘤組織中DNA 相同的基因特性。Wnt 家族成員 5A （Wingless-type MMTV integration site family member 5A，Wnt5A）是一種自分泌和旁分泌的β-連環(huán)蛋白非依賴性配體，已被證明可誘導腫瘤 抑 制 和 致 癌 信 號［4］。研 究［4］顯 示：Wnt5A 的 表達下調(diào)與癌癥的不良預后有關，表明Wnt5A 在癌癥中具有腫瘤抑制作用。盡管Wnt5A 與不同病理狀況有關，但其在癌癥中的具體作用尚不明確，可能涉及甲基化修飾、不同的mRNA 異構(gòu)體及不同的下游途徑［5］。逆轉(zhuǎn)座子長散布核元件1 （long interspersed nuclear element-1，LINE-1） 是目前唯一已知的具有自主活性的人類反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子，約占人類基因組的1/6。LINE-1 啟動子低甲基化可作為全基因組DNA 低甲基化的生物標記物，而DNA 低甲基化本身就是癌癥的一種主要標志。LINE-1 甲基化在實體瘤中的研究［6］可見報道，而在淋巴腫瘤中異常LINE-1 低甲基化的研究較少。為此，本研究構(gòu)建了急性淋巴細胞白血病移植瘤小鼠模型，通過綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）監(jiān)測髓外浸潤情況，同時探討白血病細胞髓外浸潤過程中血清cfDNA 中Wnt5A 與癌基因LINE-1 啟動子區(qū)甲基化變化，為ALL 復發(fā)及抗化療風險提供可行的診斷和監(jiān)控策略。

1 材料與方法

1.1 細胞、實驗動物、試劑和主要儀器小鼠急性B 淋巴細胞白血病細胞L1210（中科院上海細胞庫）；60 只ICR 小鼠購自吉林省長春市億斯實驗動物技術有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（吉） -2018-0007， 體 質(zhì) 量（13.94±3.42） g。DMEM 培養(yǎng)液（美國Gibco 公司），胎牛血清（美國Hyclone 公司），嘌呤霉素和Hoechst33258（美國Sigma 公司），慢病毒載體（蘇州吉瑪基因股份有限公司），血清cfDNA 提取試劑盒（天根生化科技公司），亞硫酸氫鹽快速轉(zhuǎn)化試劑盒（蘇州唯善生物科技有限公司），RNA 提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Premix Taq Hot Start 和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（大連寶生物公司），PCR 引物由華大科技有限公司合成。流式細胞儀（型號：NovoCyte）［艾森生物（杭州） 有限公司］，倒置熒光顯微鏡（型號：TS100）（日本尼康公司），冰凍切片機（型號：CM1950）［徠卡顯微系統(tǒng)（上海）貿(mào)易有限公司］，PCR 擴增儀（型號：ECT811）［東勝（廣州） 生物科技有限公司］，Real time PCR 儀（型號：5100）［賽默飛世爾科技（中國） 有限公司］。

1.2 GFP 標記的急性B 淋巴細胞白血病小鼠模型構(gòu)建采用攜帶有GFP 的慢病毒載體轉(zhuǎn)染小鼠急性B 淋巴細胞白血病L1210 細胞，熒光顯微鏡下篩選表達有GFP 的細胞，流式細胞儀檢測細胞熒光強度。將60 只4 周齡ICR 小鼠隨機分為對照組、實驗15 d 組和實驗30 d 組，每組20 只。腹腔注射環(huán)磷酰胺進行免疫抑制后，實驗組通過尾靜脈注射L1210 細胞，每只小鼠1.0×107個細胞，對照組注射同等體積PBS 緩沖液。實驗15 d 組和實驗30 d組小鼠分別于接種腫瘤細胞15 和30 d 后處死，解剖，取內(nèi)臟組織稱質(zhì)量、包埋劑包埋并進行冰凍切片，并用Hoechst 33258 工作液染色。提取血中單個核細胞與血清備用。流式細胞儀分析單個核細胞熒光強度，倒置熒光顯微鏡觀察GFP 記錄腫瘤細胞浸潤情況。

1.3 實時熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法檢測各組小鼠外周血細胞中相關基因mRNA 表達水平提取血液RNA 進行反轉(zhuǎn)錄，再采用RT-qPCR 法擴增，反應體系為25 μL，其中上下游引物各0.75 μL，引物序 列 見 表1。cDNA 模 板2 μL，去 離 子 水9 μL，SYBR Premix Ex Taq Ⅱ12.5 μL。 反 應 程 序：95 ℃預變性30 s；95 ℃、5 s，55 ℃、30 s，72 ℃、30 s；共40 個循環(huán)。實驗獨立重復3 次，以Ct 值計算外周血細胞中相關基因mRNA 表達水平。

表1 RT-qPCR 法引物序列Tab.1 Primer sequences of RT-qPCR method

1.4 血清cfDNA 提取及Wnt5A 和LINE-1 基因甲基化水平檢測使用血清cfDNA 提取試劑盒按說明書操作提取各組小鼠血清cfDNA，按照重亞硫酸氫鹽快速轉(zhuǎn)化試劑盒說明書操作，對所提取的cfDNA 進 行 處 理。MethyPrimer 軟 件 設 計Wnt5A 和LINE-1 基因啟動子區(qū)CpG 島并進行引物設計，引物序列見表2。采用降落PCR 將亞硫酸鹽處理后的cfDNA 進行PCR 擴增，反應體系為25 μL，其中上下游引物各1 μL，模板3 μL，去離子水7.5 μL，Premix Taq Hot Start 12.5 μL。擴增程序：95 ℃預變性，98 ℃變性10 s， 65 ℃退火30 s，每個循環(huán)降低1 ℃，共15 個循環(huán)，50 ℃退火30 s，15 個PCR循環(huán)。使用凝膠回收試劑盒按照說明書對PCR 產(chǎn)物進行純化后，連接T 載體，進行轉(zhuǎn)化，每個樣品挑取至少20 個克隆進行質(zhì)粒提取并送至華大科技有限公司測序，測序結(jié)果采用BIQ Analyzer 軟件進行分析，得到單個位點甲基化水平。

表2 BSP 法引物序列Tab.2 Primer sequences of BSP method

1.5 統(tǒng)計學分析采用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組小鼠外周血細胞中相關基因mRNA 表達水平和血清中甲基化水平以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間樣本均數(shù)兩兩比較采用SNK-q檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 急性B 淋巴細胞白血病小鼠模型鑒定慢病毒感染后的L1210 細胞經(jīng)4 mg·L－1嘌呤霉素篩選7 d 后，熒光顯微鏡下可見均勻綠色熒光。連續(xù)傳代培養(yǎng)，經(jīng)流式細胞術檢測GFP 陽性細胞的比例均大于80%，表明感染后L1210 細胞穩(wěn)定表達GFP（圖1 和2）。小鼠建模12 d，實驗組小鼠出現(xiàn)精神萎靡、活動減少、嗜睡和脊背弓起等癥狀。建模15 和30 d 分別處死小鼠，取各臟器稱質(zhì)量，與對照組比較，實驗30 d 組小鼠脾臟質(zhì)量增加（P＜0.05），脾腫大較為明顯，小鼠肝臟、心臟和腎臟質(zhì)量差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖3）。實驗15 d 組小鼠脾組織中有明顯綠色熒光，表明腫瘤細胞已浸潤至小鼠脾組織中，實驗30 d 組小鼠脾組織熒光強度更為明顯（圖4）。流式細胞術檢測各組小鼠外周血細胞熒光強度，與對照組比較，實驗15 d 和30 d 組小鼠外周血細胞熒光強度均明顯增強，實驗30 d 組小鼠外周血細胞熒光強度較實驗15 d 組更高（圖5）。

圖1 倒置熒光顯微鏡觀察慢病毒感染后L1210 細胞形態(tài)Fig. 1 Morphology of lentivirus infected L1210 cells observed by inverted fluorescence microscope

圖2 流式細胞術分析慢病毒感染情況Fig. 2 Analysis on lentivirus infection by flow cytometry

圖3 各組小鼠心臟、腎臟、脾臟和肝臟大體表現(xiàn)（A)和質(zhì)量（B)Fig.3 Mass of heart,kidney,spleen and liver of mice in various group

圖4 各組小鼠脾組織浸潤情況（Hoechst33258,×400）Fig.4 Infiltration of spleen tissue of mice in various groups(Hoechst33258,×400）

圖5 流式細胞術檢測各組單個核細胞綠色熒光強度Fig. 5 Green fluorescence intensities of mononuclear cells in various groups detected by flow cytometry

2.2 各組小鼠血細胞中相關基因mRNA 表達水平與對照組比較，實驗15 d 組和實驗30 d 組小鼠血清中單個核細胞中去甲基轉(zhuǎn)移酶雙加氧酶2（methylcytosine dioxygenase 2，TET2） mRNA 表達水平明顯降低，DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶3a （DNA methyltransferase 3a，DNMT3a）、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶3b（DNA methyltransferase 3b，DNMT3b） mRNA表達水平明顯升高；Wnt5A mRNA 表達水平明顯 降 低（P＜0.05）， LINE-1 mRNA 表 達 水 平明顯升高（P＜0.05）。見表3。

表3 各組小鼠細胞中癌基因和抑癌基因mRNA 表達水平Tab. 3 Expression levels of oncogenes and tumor suppressors mRNA in cells of mice in various groups (n=20,x±s)

2.3 各組小鼠血清中Wnt5A 與LINE-1 基因啟動子區(qū)甲基化水平實驗15 d 組小鼠血清中抑癌基因Wnt5A 基因啟動子區(qū)甲基化水平（90.00%±12.91%） 明顯高于對照組（73.75%±3.95%）（P＜0.05）， 實 驗30 d 組Wnt5A 甲 基 化 水 平（75.00%±22.68%） 高 于 對 照 組 （P＜0.05）（圖6A）；實驗15 d 組LINE-1 基因啟動子區(qū)甲基化水 平 （53.41%±20.87%） 明 顯 低 于 對 照 組（71.59%±25.45%）（P＜0.05），實驗30 d 組啟動子區(qū)甲基化水平（44.32%±12.95%） 低于實驗15 d 組（P＜0.05）（圖6B）。

圖6 各組小鼠血清中基因啟動子區(qū)甲基化水平差異Fig.6 Differences of methylation levels in promoter regions of genes in serum of mice in various groups

3 討論

與實體腫瘤動物模型不同，血液腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移難以定位。近年來，熒光免疫標記技術在許多研究領域中得到應用，提示研究者可以采用熒光標記對血液腫瘤細胞進行更明確的體內(nèi)追蹤。本研究應用表達有GFP 的慢病毒載體成功構(gòu)建了急性淋巴細胞性白血病小鼠模型，并通過脾組織切片監(jiān)測到腫瘤細胞的髓外浸潤。在此基礎上進行血液特征的分析。

Wnt5A 信號的異常激活或抑制正在成為腫瘤發(fā)生過程中的一個重要事件，同時發(fā)揮致癌和抑癌作用［7］，其基因的異常甲基化會導致其表達沉默［8］。Wnt5A 下調(diào)或沉默可見于多種血液腫瘤細胞系，包括鼻NK/T 細胞淋巴瘤和NK 白血病細胞系、白血病和伯基特淋巴瘤［9］。由于Wnt5A 可以抑制B 細胞的增殖，因此其在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中發(fā)揮腫瘤抑制作用，從而抑制腫瘤細胞的生長和遷移，但在ALL 血清cfDNA 中其啟動子甲基化狀態(tài)尚未可知。本研究通過對cfDNA 甲基化水平分析發(fā)現(xiàn)：腫瘤細胞接種15 d 時Wnt5A 基因已呈現(xiàn)高甲基化狀態(tài)，其甲基化表達明顯下降，提示其高甲基化狀態(tài)抑制了mRNA 的轉(zhuǎn)錄水平。在ALL 患者中Wnt5A 的高甲基化，可直接影響mRNA 的表達［10］。注射30 d，甲基化水平有所降低，這可能由于注射腫瘤細胞后，細胞逐漸釋放到血液中，但隨著細胞生長，部分腫瘤細胞無法適應導致其不能全部存活，故腫瘤細胞濃度有所降低。且DNA 甲基化水平與DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶（DNMT）、組蛋白甲基化、RNA 干擾和病毒感染等多種因素有關。

在癌細胞中，LINE-1 逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子可以通過插入突變、異常剪接或DNA 斷裂使基因功能失活，導致基因組不穩(wěn)定［11-12］。LINE-1 插入更多地發(fā)生在基因間或異染色質(zhì)區(qū)域［13］、癌癥特異性低甲基化區(qū)域和癌癥中常見突變的基因中，表明LINE-1轉(zhuǎn) 導 的 致 癌 性 質(zhì)［11，14］。LINE-1 反 向 啟 動 子 通 過 基于小干擾RNA 的機制調(diào)節(jié)LINE-1 逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座，還可能調(diào)節(jié)其他臨近基因的轉(zhuǎn)錄［10］。目前研究者認為LINE-1 低甲基化是癌癥發(fā)生的起始因素，在某些癌癥中，癌前病變在癌癥轉(zhuǎn)化前可觀察到LINE-1 明顯的去甲基化。本研究結(jié)果顯示：LINE-1 基因在髓外浸潤過程中呈現(xiàn)逐步低甲基化，其轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)，提示LINE-1 可作為一種癌基因成為ALL 中病情監(jiān)測的靶點。

綜上所述，通過尾靜脈注射表達GFP 的小鼠ALL L1210 細胞構(gòu)建ALL 小鼠髓外浸潤模型，可方便地監(jiān)測其髓外浸潤情況。血清中抑癌基因Wnt5A 與癌基因LINE-1 作為ALL 的監(jiān)測靶點，可為ALL 早期診斷與治療監(jiān)測提供新的手段與策略，為預后判斷及個體化治療提供新的方向。