楊尾蓮, 王世軍, 沈芳華, 張 勇, 陳福偉, 蘇秋香, 史 超, 余沁瑤, 陳 濤

（1. 福建中醫(yī)藥大學附屬人民醫(yī)院蛇傷科，福建 福州 350004；2. 福建中醫(yī)藥大學研究生院，福建 福州 350122）

毒蛇咬傷是一種毀滅性的公共衛(wèi)生威脅，正日益引起醫(yī)學研究者的重視［1］。全世界有超過2700種蛇，其中約五分之一有毒，蛇毒一旦注入血液，將通過血液循環(huán)擴散到體內(nèi)，引起各種局部或系統(tǒng)性中毒癥狀［2］。中國每年約發(fā)生10 萬起毒蛇咬傷事件，其死亡率為5%～10%，另外25%～30%的受害者將遭受永久性組織損傷［3］。福建省地處亞熱帶地區(qū)，多丘陵，是毒蛇咬傷發(fā)生率最高的省份之一，也是毒蛇種類最多的省份之一，其中最常見的為竹葉青蛇，其為中國最毒的10 種毒蛇之一，染毒后常會導致患者神經(jīng)肌肉抑制、肌肉癱瘓甚至呼吸衰竭［4］。竹葉青蛇咬傷臨床的危急重癥，在急診科較為常見［5］。研究［6］顯示：蛇毒從染毒部位可以迅速被吸收，進入機體血液循環(huán)，造成毒素迅速發(fā)作，這也是蛇毒中毒早期出現(xiàn)全身表現(xiàn)的原因。然而竹葉青蛇蛇毒毒液進入患者血液循環(huán)后，相關血清蛋白質的變化尚無明確報道。早期對蛇毒染毒后機制的研究一般采用免疫熒光法、酶聯(lián)免疫吸附測 定 （enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法和酶活性檢測等傳統(tǒng)方法，但這些方法效率較低，容易漏掉關鍵因素［7］。蛋白質組學作為一種新興技術已被廣泛應用于血清、腦脊液、乳頭浸出液、眼淚、唾液、羊水、尿液和腹水等體液中的蛋白質譜和特性的研究［8］。MALIH 等［9］利用蛋白質組學方法研究眼鏡蛇蛇毒毒液蛋白質組的交叉反應，以探究蛇咬中毒后的治療機制。CHANG等［10］應用蛋白質組學方法鑒定了來自東南亞地區(qū)和中國2 個省份（廣西省和海南?。┑难坨R蛇毒液的地理變異情況。蛋白質組學可能成為研究蛇毒毒性機制的有力工具［11］。因此，為了深入了解蛇毒對血液循環(huán)的影響，本研究采用絕對定量同位素標記（tandem mass tag，TMT）技術分析竹葉青蛇蛇毒毒液染毒家兔模型后血清蛋白質的表達情況，篩選蛇毒毒液染毒過程中關鍵的作用蛋白，探究蛇毒染毒作用的生物學基礎，為識別竹葉青蛇蛇毒染毒損傷的生物標志物提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、試劑和主要儀器健康日本大耳兔12 只，雌雄各半，體質量2.5～3.0 kg，購于贛州畜牧研究所，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK （贛）2018-0009；于SPF 級屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，12 h 明暗循環(huán)，于實驗開始前適應性喂養(yǎng)1 周。竹葉青蛇毒（福州萬隆生物技術有限公司），TMT10 試劑盒（90111LCS，美國ThermoFisher 公司）、血漿去高豐度蛋白試劑盒（85165，美國ThermoFisher 公司）、BCA 蛋白定量試劑盒（CW0014S，北京康為世紀生物科技有限公司），30% 丙烯酰胺（A1010，北京索萊寶科技有限公司），Marker（#26617，美國ThermoFisher 公司），PVDF 膜（IPVH00010，美國Millipore 公司），封閉專用脫脂奶粉（P1622，北京普利萊基因技術有限公司），牛血清白蛋白（A8020， 北京索萊寶科技有限公司），超敏發(fā)光液（RJ239676，美國ThermoFisher 公司）。Q Exactive HF 質譜儀和Easy-nLC 1200 液相系統(tǒng)（美國ThermoFisher 公司），低溫高速離心機（型號5424R，德國Eppendorf 公司），全自動酶標儀（型號WD-2102B，北京市六一儀器廠），蛋白垂直電泳儀（型號DYY-6C，北京市六一儀器廠），超高靈敏度化學發(fā)光成像系統(tǒng)（型號Chemi DocTMXRS+，上海伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司）。

1.2 實驗動物分組和模型制備12 只日本大耳兔按照隨機數(shù)字表法分為假手術組和模型組，每組6 只。模型組：將竹葉青蛇毒干粉用PBS 緩沖液配制為注射液后，按照20 mg·kg－1將蛇毒注射于家兔右后腿肌肉；假手術組：按照相同劑量于右后腿肌肉注射生理鹽水。4 h 后2 組家兔戊巴比妥鈉麻醉后心臟采血，分離血清，用于后續(xù)檢測。

1.3 樣本蛋白提取每個樣品取40 μL 血液，以結合緩沖液10 倍稀釋，將柱體放入一個新的大小適合的收集管中，讓其依靠重力流過柱體，再次以600 μL 結合緩沖液清洗柱體，收集洗脫組分即為去除白蛋白和球蛋白后的樣本。將溶液在室溫下12000 g 離心10 min，取上清，重復離心1 次取上清。上清即為樣品的總蛋白溶液，進行BCA 蛋白濃度測定并分裝后于-80 ℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 樣品蛋白胰蛋白酶酶解根據(jù)BCA 法測定的蛋白濃度，每個樣品取50 μg 的蛋白，加入裂解液后加入二硫蘇糖醇（dithiothreitol，DTT），在55 ℃孵育30 min。加入相應體積的碘乙酰胺，在以上溶液中加入6 倍體積的丙酮沉淀蛋白。加入100 μL 四 乙 基 溴 化 銨 （tetraethylammonium bromide，TEAB）（200 mmol·L―1）復溶沉淀，加入1/50 樣品質量的1 g·L―1胰蛋白酶，并于37 ℃消化過夜。酶解后的樣品凍干后于-80 ℃保存。

1.5 TMT 肽段標記實驗向凍干樣品中加入50 μL、100 mmol·L―1TEAB 緩沖液，渦流混勻，取出TMT 試劑，平衡至室溫，加入88 μL 無水乙腈，渦流5 min，離心。取41 μL TMT 試劑加入樣品中，渦流混勻，室溫放置1 h。加入8 μL 5%羥胺終止反應15 min，凍干后于-80 ℃保存。

1.6 高效液相色譜-串聯(lián)質譜（high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，HPLC-TMS）分析處理后 樣 本 在 EASY-nLC 1000液相中Agilent 1100HPLC色譜柱，先在95%的緩沖溶液中平衡，然后樣品以350 nL·min―1的流速上樣到預柱，再經(jīng)分析柱75 μm×150 mm 分離。

樣本經(jīng)色譜分離后采用Q-Exactive 質譜儀進行質譜分析。檢測方式為正離子母離子，掃描范圍為350～165 m·z―1， 一 級 質 譜 分 辨 率 為120000（200 m·z―1），最大離子注入時間為30 ms，動態(tài)排 除時間為40 s。每次全掃描后采集20 個碎片圖譜（MS2 scan），MS2 激活類型為HCD，隔離窗口為2 m·z―1，二級質譜分辨率為60000（200 m·z―1），共 進 行15 個1 h 的HPLC-TMS 分析，得出原始質譜數(shù)據(jù)。

1.7 樣品篩選差異蛋白數(shù)據(jù)采用Proteome Discover 2.4 蛋白質組學分析軟件分析注釋信息、目標蛋白、重要信號通路和信號網(wǎng)絡。對倍數(shù)變化≥1.2 倍，且P＜0.05 的差異蛋白質進行生物信息學分析，包括利用差異表達蛋白（differentially expressed proteins，DPEs）進行樣本差異蛋白基因本體（Gene Ontology，GO）和京都基因與基因組百 科 全 書 （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）的富集分析。使用String 數(shù)據(jù)庫（https：//cn.string-db.org/）預測可能的蛋白-蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡。

1.8 Western blotting 法檢測各組日本大耳兔血清中肌酸激酶（creatine kinase，CK）和溶質載體家族16 成員1（solute carrier family 16 member 1，SLC16A1）表達水平提取各組日本大耳兔血清樣本總蛋白。根據(jù)BCA 試劑盒測定蛋白濃度。蛋白變性，上樣，進行十二烷基苯磺酸鈉凝膠電泳1～2 h，后濕法轉膜30～50 min。一抗溶液孵育，4 ℃過夜；二抗溶液中室溫孵育1～2 h。在膜上滴加ECL 曝光液，在凝膠成像系統(tǒng)中曝光。使用圖像軟件Image Pro 進行定量分析，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平＝目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.9 統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。2 組日本大耳兔血清CK 和SLC16A1表達水平呈正態(tài)分布，以±s表示，2 組間樣本均數(shù)比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 2 組樣本可信蛋白相關性分析主成分分析（PCA 分析） 結果顯示：與模型組（M1、M2 和M3） 比較，假手術組（CK1、CK2 和CK3） 坐標點在PCA 分析3D 圖上的位置相對較遠，明顯分成2 簇。見圖1。

圖1 2 組PCA 分析3D 圖Fig.13D diagram of PCA analysis in two groups

2.2 2 組樣本差異蛋白表達水平與假手術組比較，模型組共鑒定出差異蛋白199 個，其中139 個蛋白表達上調(diào)，60 個蛋白表達下調(diào)，篩選條件為差異倍數(shù)（Foldchange） ≥1.2 倍且P＜0.05。其中上調(diào)蛋白主要包括骨骼肌快肌肌鈣蛋白2（troponin Ⅰtype 2， fast skeletal muscle，TNNI2）和小清蛋白α（parvalbum alpha，PV），參與肌肉收縮活動、 調(diào)節(jié)鈣離子轉運； 肌紅蛋白（myoglobin，MB） 和CK 參與催化ATP 和各種磷酸原之間的轉移，在能量轉導中起著核心作用；SLC16A1 參與調(diào)節(jié)中樞代謝過程等。根據(jù)假手術組與模型組的差異蛋白列出明顯上調(diào)的前30 個蛋白和明顯下調(diào)的前30 個蛋白。見表1 和2。

表1 竹葉青蛇蛇毒染毒后前30 位上調(diào)的差異表達蛋白Tab 1 Top 30 up-regulated of differentially expressed protein after poison of snake venom of Trimeresurus stejnegeri

2.3 樣本差異蛋白GO 富集分析為了明確TMT檢測到的假手術組和模型組之間所有下調(diào)和上調(diào)差異蛋白的生物學過程、細胞組分和分子功能分類，進行GO 富集分析。結果顯示：GO 富集度較高的生物學過程主要包括先天性免疫應答、磷脂酰膽堿分解代謝過程的調(diào)控、血小板活化因子分解代謝過程、脂肪氧化過程、免疫應答中自然殺傷細胞分化的調(diào)控、補體激活的調(diào)控和細胞質翻譯的正向調(diào)控等。參與胞外調(diào)節(jié)功能過程的差異蛋白最多，其次為鈣離子調(diào)節(jié)和蛋白降解調(diào)節(jié)過程蛋白。見圖2。

圖2 樣本差異蛋白GO 富集分析直條圖Fig.2 Histogram of GO enrichment analysis of sample differential proteins

2.4 KEGG 富集分析為了確定已鑒定差異蛋白在竹葉青蛇蛇毒染毒的代謝過程和生物發(fā)生過程中的作用，進行差異蛋白信號通路KEGG 分析。其中KEGG 主要富集通路分別為細胞外基質（extracellular matrix，ECM） 受體交互作用通路、磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）/蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號通路、補體系統(tǒng)改變通路、糖酵解和糖質新生等通路，其中參與ECM 受體交互作用通路和PI3K/Akt信號通路的差異蛋白最多，可能為蛇毒血液循環(huán)損傷的關鍵信號通路。見圖3。

圖3 樣本差異蛋白KEGG 通路富集分析Fig.3 KEGG pathway enrichment analysis of sample differential proteins

2.5 差異蛋白PPI 網(wǎng)絡分析為了對差異蛋白PPI網(wǎng)絡進行分析，采用基因/蛋白質的搜索工具11.0（String 11.0） 數(shù)據(jù)庫進行檢索，得到的PPI 網(wǎng)絡生成25 個蛋白節(jié)點和90 條邊，并將數(shù)據(jù)文件直接導入Cytoscape 軟件進行可視化編輯，在PPI 網(wǎng)絡中，連接比其他更高的差異蛋白被認為是樞紐蛋白，這些樞紐蛋白可能在調(diào)控網(wǎng)絡中發(fā)揮重要作用。 其中前4 位的分別為清蛋白（albumin，ALB）、血管性血友病因子（von willebrand factor，vWF）、糖原磷酸化酶（glycogen phosphorylase，PYGM） 和磷酸丙糖異構酶1 （triose phosphate isomerase 1，TPI1）。見圖4。

圖4 樣本差異蛋白PPI 圖Fig.4 PPI diagram of sample differential proteins

表2 竹葉青蛇蛇毒染毒后前30 位下調(diào)的差異表達蛋白Tab 2 Top 30 down-regulated of differentially expressed protein after poison of snake venom of Trimeresurus stejnegeri

2.6 Western blotting 法檢測2組樣本差異蛋白表達水平采用Western blotting 法對TMT 蛋白組學差異蛋白表達水平進行驗證。TMT 蛋白組學檢測結果顯示：模型組CK 和SLC16A1 蛋白表達水平明顯升高。Western blotting 法檢測結果顯示：與假手術組比較，模型組CK 和SLC16A1 蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.05）。見圖5。

圖5 2 組差異蛋白表達電泳圖（A,C）和直條圖（B,D）Fig.5 Electrophoregram(A,C)and histogram(B,D)of expressions of differential proteins in two groups

3 討論

劇毒種類蛇的咬傷是致命的，然而臨床診斷中暫無對于毒蛇咬傷導致染毒明確的診斷標志物或試劑盒，只能通過觀察患者的臨床表現(xiàn)進行判斷，尚缺乏對毒蛇咬傷后血清蛋白譜的詳細研究。因此，本研究采用竹葉青蛇蛇毒毒液建立日本大耳兔染毒模型，收集血液上清進行蛋白質組學分析，探究蛇毒染毒過程中的生物學改變情況。有助于理解竹葉青蛇蛇毒誘導機體染毒的復雜發(fā)病機制，并為其染毒臨床診斷提供新的生物標志物。

本研究結果顯示：竹葉青蛇蛇毒毒液誘導的毒性損傷主要影響機體先天性免疫應答、磷脂酰膽堿分解代謝調(diào)控和血小板活化因子分解代謝等過程。此外竹葉青蛇蛇毒毒素還可誘導并激活多種氧化酶和炎癥相關反應。血清CK 水平已被用來作為危重患者的可能預后因素［12］，但已有研究［13］指出：血清CK 水平可代表肌肉、心臟和腦損傷的出現(xiàn)，如心肌梗死、橫紋肌溶解、自身免疫性肌炎和腎臟損傷等器官損傷通常由血液中CK 的存在來確定。本研究通過分析蛋白組學中PPI 相互作用網(wǎng)絡發(fā)現(xiàn)：主要集簇聚集在心臟與骨骼肌調(diào)節(jié)的相關激酶里。心臟和骨骼肌收縮過程中受到相關激酶的調(diào)節(jié)，這些不同亞型激酶在微調(diào)肌蛋白鈣離子敏感性、協(xié)同性和pH 耐受性方面發(fā)揮作用。研究［14］指出：在有重要臟器損傷危險的患者中，測定血清CK 水平能夠在確定毒性嚴重程度方面起到重要作用，而采用Western blotting 法檢測結果進一步驗證了蛇毒咬傷后日本大耳兔蛋白質組學血清CK 表達水平升高。因此可以猜測CK 可能是蛇毒染毒后起到關鍵作用的激酶，CK 在大腦、心臟和肌肉等不同類型的身體器官中影響能量供應，而這些器官的損傷變化也往往是由于能量供應受損所致。GO 和KEGG 富集分析結果也顯示鈣離子信號通路改變，鈣網(wǎng)蛋白是一種鈣離子依賴蛋白，廣泛分布于真核細胞中，一旦鈣網(wǎng)蛋白與鈣離子結合，即被激活，可以觸發(fā)一系列激酶和磷酸酶，從而調(diào)節(jié)新陳代謝過程［15］。

此 外 包 括TNNI2、 角 蛋 白15 （keratin 15，KRT15）和肌球蛋白重鏈4（myosin heavy chain 4，MYH4）等多種蛋白的表達水平也在竹葉青蛇蛇毒日本大耳兔染毒模型中明顯升高，提示竹葉青蛇蛇毒毒液對肌肉有明顯的損傷作用［16］。另外甘油三磷酸脫氫酶1 （glycerol-3-phosphate dehydrogenase 1，GPD1）、脂肪酸結合蛋白5（fatty acid binding protein 5，F(xiàn)ABP5） 和SLC16A1 蛋白表達水平升高，這些蛋白與代謝過程中多條信號通路的激活有關［17-19］，提示竹葉青蛇蛇毒毒液進入血液循環(huán)可能通過損傷機體代謝平衡進而發(fā)揮損傷作用。SLC16A1 是一個質子連接的一元羧酸轉運蛋白，催化許多一元羧酸（乳酸和丙酮酸）在質膜上的轉運，SLC16A1 蛋白表達上調(diào)可以促進乳酸積累進而調(diào)節(jié)免疫炎癥反應。研究［20］顯示：T 細胞通過SLC16A1 轉運乳酸并感知到微環(huán)境中乳酸濃度變化。高濃度乳酸抑制了T 細胞的遷移運動能力，增加炎癥細胞因子的產(chǎn)生，最終增加了慢性炎癥進程。

研究［21-24］顯示：明顯下調(diào)的蛋白主要包括載脂蛋白C1（apolipoprotein C1，APOC1）、轉鈷胺素蛋白1（transfer cobalamin protein 1，TCN1）和前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶9 （proproteinin vertase Bacillus subtilisproteinase 9，PCSK9）等這些蛋白是參與信號轉導的重要蛋白，具有炎癥、代謝和細胞凋亡等多種生物學功能，其缺失會導致機體損傷的進一步加劇，嚴重者將導致死亡。

綜上所述，本研究的血清蛋白組學結果反映了竹葉青蛇蛇毒染毒過程中血液循環(huán)中各類蛋白的功能分類改變情況。差異表達的高豐度蛋白CKM 和SLC16A1 為后期臨床區(qū)分毒蛇咬傷提供了新的生物標志物。蛋白與蛋白間的相互作用網(wǎng)絡有助于理解蛇毒毒液誘導機體染毒的復雜發(fā)病機制。