董 營, 郭家女, 王思懿, 郭 丹, 王力可, 溫 旭, 劉立峰, 曲 萌, 于春艷, 劉楠楠，王 丹, 陳昌捷

（1. 北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理教研室，吉林 吉林 132013；2. 北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院人體解剖學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；3. 北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院分子生物教研室，吉林 吉林 132013；4. 北華大學(xué)附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 吉林 132013）

惡性腫瘤和阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）是威脅人類健康的兩大疾病，二者之間的關(guān)系受到越來越多的關(guān)注［1］。本課題組前期研究［2］結(jié)果顯示：淀粉樣蛋白前體蛋白（amyloid precursor protein，APP）/早 老 素1 （presenilin 1，PS1） 雙轉(zhuǎn)基因小鼠，同時(shí)移植黑色素瘤B16 細(xì)胞，復(fù)制同時(shí)患有AD 和惡性腫瘤的小鼠模型，移植瘤組織生長緩慢可能與線粒體動(dòng)力學(xué)紊亂有關(guān)。線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)作為細(xì)胞內(nèi)2 個(gè)重要的細(xì)胞器，二者緊密聯(lián)系對(duì)線粒體動(dòng)力學(xué)等進(jìn)行調(diào)控［3-4］，影響細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，但內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是否在其中發(fā)揮作用尚不清楚。有研究［5-8］顯示：在小鼠成纖維細(xì)胞中線粒體Mfn2 缺失誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（endoplasmic reticulum stress， ERS）， 且 蛋 白 激 酶R 樣 內(nèi) 質(zhì) 網(wǎng) 激 酶（protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase，PERK） - 真 核 翻 譯 起 始 因 子2α （eukaryotic translation-initiation factor 2α，eIF2α）-活化轉(zhuǎn)錄因子4（activating transcription factor 4，ATF4）信號(hào)途徑增強(qiáng)，ERS 的PERK 持續(xù)激活，并與線粒體功能失調(diào)有關(guān)。因此本研究旨在從PERK-eIF2α-ATF4 介導(dǎo)的ERS 通路角度探討其在APP/PS1 移植瘤組織生長中的作用，為探討AD 與腫瘤之間的關(guān)系及防治提供基礎(chǔ)指標(biāo)，具有重要的臨床意義及應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、細(xì)胞、主要試劑和儀器健康C57BL/6J 小鼠和APP/PS1 移植瘤小鼠各7 只，均為雄性，體質(zhì)量16～20 g，購于北京華阜康股份有限公司，SPF級(jí)（No. 11401300086251），動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0004，小鼠飼養(yǎng)在安靜、通風(fēng)的環(huán)境中，定時(shí)喂食飲水。黑色素瘤B16細(xì)胞購于吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院。Trizol 試劑購于美國Invitrogen 公司，預(yù)混型逆轉(zhuǎn)錄試劑購于美國Trans 公司，葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（glucose regulated protein 78， GRP78）、 PERK、 磷 酸 化PERK（p-PERK）、FAM 134B、ATF4、eIF2α、磷酸化eIF2α （p-eIF2α） 和 β -actin 抗 體 均 購 自 中 國Proteintech 公 司，p-PERK 購 自Cell Signaling 公 司，GRP78、PERK 和GAPDH 引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。蛋白濃度分析儀、蛋白質(zhì)電泳裝置、轉(zhuǎn)移系統(tǒng)和凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 移植瘤模型的制備培養(yǎng)黑色素瘤B16 細(xì)胞，細(xì)胞生長處于對(duì)數(shù)期時(shí)采用不含EDTA 的0.25%胰酶消化并收集細(xì)胞。先用無菌PBS 緩沖液沖洗2 次， 再 用PBS 緩 沖 液 重 懸， 細(xì) 胞 濃 度 為1×107mL－1時(shí)再用無菌注射器將100 μL 細(xì)胞懸液接種到C57 小鼠和APP/PS1 移植瘤小鼠背部右側(cè)皮下［9］。小鼠飼養(yǎng)在22 ℃～24 ℃恒溫、濕度為40%～60%的動(dòng)物房中，每天觀察小鼠的狀態(tài)和腫瘤生長狀況。在體移植瘤通過游標(biāo)卡尺測(cè)量移植瘤的長徑（a）、寬徑（b） 和厚徑（c），通過V=πabc/6 的方法準(zhǔn)確計(jì)算出移植瘤體積及推算出移植瘤質(zhì)量。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time fluorescence quantitative PCR，RT-qPCR）法檢測(cè)2 組小鼠移植瘤組織中GRP78、PERK 和溶酶體組織蛋白酶L（cathepsin L）mRNA 表達(dá)水平2 組小鼠于接種B16 細(xì)胞的第11 天手術(shù)，每個(gè)凍存移植瘤組織稱取30 mg，加入液氮后充分研磨，應(yīng)用Trizol 試劑提取總RNA，用Pure Link RNA mini 試劑盒純化。純化后經(jīng)Nanodrop 分光光度計(jì)NP-1000 測(cè)定260 和280 nm 波長處吸光度（A）值，計(jì)算樣本總RNA 濃度并評(píng)估純度。應(yīng)用預(yù)混型逆轉(zhuǎn)錄試劑，RNA（1 μg）得到第一條鏈cDNA。每個(gè)樣本的5 ng cDNA應(yīng)用RT-qPCR試劑盒，通過RT-qPCR法進(jìn)行擴(kuò)增，應(yīng)用檢測(cè)儀進(jìn)行mRNA 水平檢測(cè)，引物序列見表1。

表1 基因引物序列Tab.1 Primer Sequence of genes

反應(yīng)條件：50 ℃、2 min，95 ℃、2 min 預(yù)變性，95 ℃、15 s，64 ℃、15 s，72 ℃、45 s，共40 次循環(huán)，72 ℃、10 min。系統(tǒng)將采集到的各反應(yīng)管的熒光強(qiáng)度增長指數(shù)與對(duì)應(yīng)的循環(huán)數(shù)繪制成每一反應(yīng)管的熒光變化曲線。采用2－ΔΔCt法計(jì)算目的基 因mRNA 的 相 對(duì) 表 達(dá) 水 平，ΔCt=Ct目的基因－Ct內(nèi)參照基因，依據(jù)公式求得2 組ΔCt，ΔCt 值越大表明基因表達(dá)量越低。每個(gè)基因mRNA 表達(dá)水平用定量Ct 法與管家基因水平比值作為基本水平，計(jì)算相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 Western blotting 法檢測(cè)2 組小鼠移植瘤組織中 GRP78、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α 和ATF4 及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬標(biāo)記蛋白FAM 134B 蛋白表達(dá)水平移植瘤組織中按1 mL /100 mg 加入RIPA裂解液，提取總蛋白，采用Bio-Rad 法測(cè)蛋白濃度，配制12%聚丙烯酰胺凝膠，以β-actin 水平作為等量蛋白質(zhì)上樣對(duì)照，取30 μg 蛋白質(zhì)樣品進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，恒壓100 V 將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜，再用10%脫脂奶粉室溫封閉1 h 后用含0.01%吐溫20 的TBST 漂洗3 次，每次10 min；加入相應(yīng)的抗體GRP78 （1∶3000）、PERK （1∶1000）、p-PERK（1∶100）、eIF2α （1∶200）、p-eIF2α（1∶200）、ATF4（1∶500）、FAM 134B（1∶500）和β-actin（1∶5000），4 ℃孵育過夜。TBST 漂洗3 次后，再加入相應(yīng)的辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶2000），室溫?fù)u床孵育2 h；再用TBST 漂洗3 次，每次10 min；ECL 發(fā)光試劑盒顯色，凝膠成像分析系統(tǒng)拍照，以β-actin 為內(nèi)參照，進(jìn)行蛋白表達(dá)分析，按照下列公式計(jì)算蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶的A 值/β-actin 條帶的A 值。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)各組小鼠移植瘤組織中蛋白質(zhì)二硫異構(gòu)酶（protein disulfide isomerase，PDI）蛋白表達(dá)情況石蠟切片進(jìn)行透明、脫水和抗原修復(fù)后，加一抗、二抗和顯色劑，蘇木素復(fù)染，脫水，封片，顯微鏡下觀察，具體染色步驟按免疫組織化學(xué)試劑盒說明書進(jìn)行。

1.6 熒光法檢測(cè)2 組小鼠移植瘤組織中腺嘌呤核苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）水平稱取20 mg 移植瘤組織加入200 μL 裂解液冰上玻璃勻漿器勻漿，臺(tái)式離心機(jī)，4 ℃、12000 g離心5 min，取上清。取20 mg 組織加入200 μL 裂解液，用勻漿器進(jìn)行勻漿，保證組織完全裂解。裂解后4 ℃、12000 g 離心5 min 取上清液。每個(gè)孔加入100 μL工作液，室溫靜置3～5 min。每個(gè)孔加樣品/標(biāo)準(zhǔn)品20 μL 迅速混勻，間隔2 s，檢測(cè)樣品置于多功能酶標(biāo)儀中，測(cè)定ATP 水平，獲得相對(duì)發(fā)光單位歸一化為蛋白質(zhì)豐度和線粒體DNA （mitochondrial DNA，mtDNA）水平。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。2 組小鼠腫瘤體積，移植瘤組織中GRP78、PERK 和cathepsin L mRNA 表 達(dá) 水 平，GRP78、p-PERK/PERK、p-eIF2α/eIF2α、ATF4和FAM 134B 蛋白表達(dá)水平及ATP 水平均符合正態(tài)分布且方差齊，以-±s表示，2 組間樣本均數(shù)比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 2 組小鼠移植瘤組織生長情況C57 移植瘤組小鼠第4 天開始出瘤，第11 天移植瘤體積為（94.5±12.1）mm3。APP/PS1 移植瘤組小鼠在第7 天開始出瘤，第11 天移植瘤體積為（19.1±8.9） mm3。與C57 移植瘤組比較，APP/PS1 移植瘤組小鼠出瘤時(shí)間晚，腫瘤體積小（P＜0.05）。

2.2 2 組小鼠移植瘤組織中GRP78 和PERK mRNA 表達(dá)水平與C57 移植瘤組比較，APP/PS1 移植瘤組小鼠腫瘤組織中GRP78 和PERK mRNA 表達(dá)水平升高（P＜0.05）。見表2。

表2 2 組小鼠移植瘤組織中GRP78 和PERK mRNA 表達(dá)水平Tab. 2 Expression levels of GRP78 and PERK mRNA in transplanted tumor tissue of mice in two groups （n=7,±s）

表2 2 組小鼠移植瘤組織中GRP78 和PERK mRNA 表達(dá)水平Tab. 2 Expression levels of GRP78 and PERK mRNA in transplanted tumor tissue of mice in two groups （n=7,±s）

*P＜0.05 compared with C57 transplanted tumor group.

Group C57 transplanted tumor APP/PS1 transplanted tumor GRP78 PERK 1.00±0.001.00±0.001.39±0.29* 1.26±0.15★

2.3 2 組小鼠移植瘤組織中ERS 相關(guān)蛋白表達(dá)水平與C57 移植瘤組比較，APP/PS1 移植瘤組小鼠腫瘤組織中ERS 相關(guān)蛋白GRP78 和ATF4 蛋白表 達(dá) 水 平 及p-PERK/PERK 和p-eIF2α/eIF2α 比 值均升高（P＜0.05）。見圖1。

圖1 Western blotting 法檢測(cè)各組小鼠移植瘤組織中GRP78、PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α 和ATF4 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖(B)Fig.1 Electrophoregram（A）and histogram (B) of expressions of GRP78, PERK, p-PERK, eIF2α, p-eIF2α and ATF4 proteins in transplanted tumor tissue of mice in two groups detected by Western blotting method

2.4 2 組小鼠移植瘤組織中PDI 蛋白表達(dá)C57 移植瘤組小鼠腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)多見黑色素顆粒，為移植瘤組織的形態(tài)特征，可見少量棕黃色顆粒，為PDI 陽性顆粒。APP/PS1 移植瘤組小鼠腫瘤細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)可見少量黑色素顆粒和廣泛表達(dá)的棕黃色顆粒。見圖2。

圖2 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)2 組小鼠移植瘤組織中PDI 蛋白表達(dá)（×400）Fig.2 PDI expressions in transplanted tumor tissue of mice in two groups detected by immunohistochemistry（×400）

2.5 2 組小鼠移植瘤組織中FAM134B 蛋白表達(dá)水平與C57 移植瘤組（1.00±0.00） 比較，APP/PS1 移植瘤組小鼠腫瘤組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬標(biāo)記FAM 134B 蛋 白 表 達(dá) 水 平（1.41±0.06） 升 高（P＜0.05）。見圖3。

圖3 Western blotting 法檢測(cè)2 組小鼠移植瘤組織中FAM 134B 蛋白表達(dá)電泳圖Fig. 3 Electrophoregram of expressions of FAM 134B protein transplanted tumor tissue of mice in two groups detected by Western blotting method

2.6 2 組小鼠移植瘤組織中cathepsin L mRNA 表達(dá)水平與C57 移植瘤組（1.00±0.00） 比較，APP/PS1 移植瘤組小鼠移植瘤組織中cathepsin L mRNA 表達(dá)水平（3.28±0.58）升高（P＜0.05）。

2.7 2 組小鼠移植瘤組織中ATP 水平與C57 移植瘤組（1.00±0.00） 比較，APP/PS1 移植瘤組小鼠腫瘤組織中ATP 水平（0.54±0.06） 降低（P＜0.05）。

3 討論

本研究基于同時(shí)患有AD 和惡性腫瘤的動(dòng)物模型，從ERS 通路PERK-eIF2α-ATF4 的角度，探討移植瘤小鼠腫瘤生長情況的差異及可能的作用機(jī)制。

當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)營養(yǎng)缺乏、缺氧、能量不足或氧化應(yīng)激時(shí)，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)會(huì)發(fā)生功能紊亂并應(yīng)激釋放直接產(chǎn)物PERK［10］。PERK 是一類具有絲氨酸/蘇氨酸激酶結(jié)構(gòu)域的蛋白，當(dāng)PERK 被釋放并通過自身磷酸化活化后，進(jìn)一步激活eIF2α，短期應(yīng)激時(shí)PERK 通過eIF2α 使蛋白合成停止。在細(xì)胞內(nèi)主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的PDI，細(xì)胞內(nèi)表達(dá)水平的上調(diào)可能是緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中產(chǎn)生過多的錯(cuò)誤折疊蛋白壓力的有效措施之一［11］。本研究結(jié)果顯示：與C57 移植瘤組比較，APP/PS1 移植瘤組小鼠腫瘤組織中ERS相關(guān)蛋白GRP78 和p-PERK/p-eIF2α 蛋白表達(dá)水平升高，細(xì)胞漿PDI 陽性表達(dá)增強(qiáng)，均提示在APP/PS1 移植瘤組織中ERS 未折疊蛋白反應(yīng)被激活。

盡管有研究［12］表明：在ERS 早期，細(xì)胞通過促進(jìn)PERK-eIF2α 途徑表達(dá)和提高PDI 蛋白表達(dá)，從而降低蛋白質(zhì)的翻譯和促進(jìn)蛋白折疊水平，減少內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔中未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)的積累，以維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，但是細(xì)胞針對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白折疊障礙時(shí)誘導(dǎo)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)，根據(jù)應(yīng)激時(shí)間長短，所發(fā)生的作用不同。本研究結(jié)果顯示：與C57 移植瘤組比較，APP/PS1 移植瘤組小鼠腫瘤組織中ATF4 蛋白表達(dá)水平升高。這與長期ERS時(shí)PERK 介導(dǎo)eIF2α 磷酸化、誘導(dǎo)ATF4 產(chǎn)生，激活了促凋亡蛋白產(chǎn)生［13］的結(jié)果相一致。細(xì)胞漿PDI 也可以靶向促凋亡蛋白Bak 形成二聚體，誘導(dǎo)凋亡［14］。同時(shí)有研究［15-16］表明：氧化蛋白折疊和鈣離子運(yùn)輸進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是消耗能量的過程，因此內(nèi)質(zhì)網(wǎng)被認(rèn)為是細(xì)胞中ATP 消耗的主要部位。本研究結(jié)果顯示：與C57 移植瘤組比較，APP/PS1 移植瘤組腫瘤組織中ATP 水平降低，以上結(jié)果均提示PERK-eIF2α-ATF4 途徑可能誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生凋亡，與移植瘤組織生長緩慢有關(guān)。

PERK 途徑不僅與凋亡有關(guān)，與自噬和代謝也均關(guān)系密切［17］。研究［18-20］顯示：在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中ERS 可以誘發(fā)自噬，在ERS 條件下可以選擇性地針對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)本身觸發(fā)自噬，多余的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)片段被遞送到溶酶體，這個(gè)過程被稱為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬“ERphagy”。這個(gè)過程首先有持續(xù)的PERK 寡聚化，隨后PERK 下游產(chǎn)物ATF4 增加了自噬相關(guān)基因ATG5 的產(chǎn)生，然后與自噬相關(guān)基因ATG12 和ATG16L 組裝， 介導(dǎo)微管相關(guān)蛋白輕鏈3（microtubule associated protein light chain 3，LC3）形成［21］。FAM 134B 是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬相關(guān)受體之一，其可以促進(jìn)特異的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜降解。當(dāng)缺乏FAM 134B 時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴(kuò)張，過量表達(dá)FAM 134B 活性時(shí)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)與LC3 相互作用被破壞，隨后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白被靶向溶酶體降解［22］。

綜上所述，APP/PS1 移植瘤組織中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表達(dá)水平升高［2］，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬標(biāo)記蛋白FAM 134B 蛋白表達(dá)水平和cathepsin L mRNA 表達(dá)水平均升高，提示內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)未折疊蛋白反應(yīng)存在密切聯(lián)系，PERK-eIF2α-ATF4 途徑可能參與了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)自噬調(diào)控，在移植瘤組織生長緩慢中發(fā)揮作用。