劉依儂, 張 強(qiáng), 徐 立

（吉林大學(xué)第二醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春 130041）

心血管系統(tǒng)疾病是目前全球范圍內(nèi)人類(lèi)死亡的主 要 原 因 之 一［1］， 而動(dòng)脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）是心血管疾病發(fā)生的首要因素，其特征是內(nèi)皮功能紊亂、活性氧（reactive oxygen species，ROS）產(chǎn)生增加、內(nèi)膜脂質(zhì)沉積、平滑肌細(xì)胞增殖、細(xì)胞凋亡和壞死，以及局部和全身炎癥［2-3］。血管內(nèi)皮功能紊亂是AS 發(fā)生的首發(fā)事件，其破壞血管收縮和舒張之間的平衡，增加內(nèi)皮通透性，并引發(fā)局部炎癥反應(yīng)［4］?？沽字C合征（antiphospholipid syndrome，APS） 是一種自身免疫性疾病，其特點(diǎn)是血栓形成和妊娠失敗。但APS 背景下的AS 研究少見(jiàn)報(bào)道。AS 病變細(xì)胞內(nèi)累積的氧化低密度脂蛋白（oxidized low-density lipoprotein，Ox-LDL），是引發(fā)內(nèi)皮功能紊亂的關(guān)鍵因素，其累積程度是反映AS 病變程度的重要指標(biāo)［5-7］，但Ox-LDL/β2 糖蛋白Ⅰ（β2-glycoprotein Ⅰ，β2GPⅠ）/抗β2GPⅠ抗體（anti-β2GPⅠ）復(fù)合物在內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷以及AS 疾病進(jìn)展中的作用尚不清楚。核因子κB （nuclear factor kappa-B，NFκB）是調(diào)控AS 疾病的關(guān)鍵炎性因子［8］，TRAF3-相互作用蛋白2 （TRAF3 interacting protein 2，TRAF3IP2）作為細(xì)胞質(zhì)接頭分子，是Ikappa B 激酶 （I kappa B kinase， IKK）/NF- κB 的 激 活劑［9-10］。但TRAF3IP2 在AS 中 的 具 體 作 用 機(jī) 制 尚不明確。阿托伐他?。╝torvastatin，ATO）作為臨床常規(guī)降血脂藥物，其是否通過(guò)TRAF3IP2 發(fā)揮抗AS 的作用尚不清楚。本研究通過(guò)給予人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVECs） Ox-LDL 復(fù)合物建立內(nèi)皮細(xì)胞損傷模型，探討其是否激活TRAF3IP2/IKK/NF-κB 信號(hào)通路，進(jìn)而探討ATO是否特異靶向抑制TRAF3IP2，保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞功能，延緩AS 的發(fā)生發(fā)展，為APS背景下抑制AS 發(fā)生發(fā)展奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、主要試劑和儀器HUVECs 購(gòu)自中科院上海細(xì)胞庫(kù)，人Ox-LDL 購(gòu)于廣州奕源生物科技有限公司，β2GPⅠ、ATO、MTT 溶液和DMSO購(gòu)自美國(guó)Sigma 公司，anti-β2GPⅠ購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz 公 司， H-DMEM 培 養(yǎng) 基、 PBS 緩 沖 液、0.25% 胰蛋白酶和胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Hyclone 公司，1%青-鏈霉素雙抗購(gòu)自美國(guó)Invitrogen 公司，鼠 抗 人GAPDH、TRAF3IP2 和p-IKKγ 一 抗 購(gòu) 自美國(guó)Santa Cruz 公司，兔抗人p-NF-κB p65 一抗和羊抗鼠（兔）二抗購(gòu)自美國(guó)CST 公司，ROS 檢測(cè)試劑盒購(gòu)于上海碧云天生物技術(shù)有限公司，人內(nèi)皮素1（endothelin 1，ET-1）ELISA 試劑盒購(gòu)于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。高速低溫離心機(jī)（型號(hào)：Micro 17） 和CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱（型號(hào)：371） 購(gòu)于美國(guó)Thermo Fisher 公司，熒光顯微鏡（型號(hào)AF6000）購(gòu)于德國(guó)Leica 公司，全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光圖像分析系統(tǒng)（型號(hào)Tanon5200） 購(gòu)于上海天能公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)HUVECs 在含有10%胎牛血清和1% 青-鏈霉素的H-DMEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱孵育。待細(xì)胞長(zhǎng)至培養(yǎng)皿80%～90%時(shí)開(kāi)始傳代，用胰蛋白酶消化細(xì)胞，終止消化后得單細(xì)胞懸液后按照1∶2 或1∶3 進(jìn)行傳代，均采用3～8 代處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。將HUVECs 分成8 組：對(duì)照組、β2GP Ⅰ組（100 mg·L―1）、 Ox-LDL 組（50 mg·L―1）、β 2GPⅠ/anti-β2GPⅠ組（100 mg·L―1）、Ox-LDL/β2GP Ⅰ組、 Ox-LDL/β2GP Ⅰ/anti-β2GP Ⅰ組、ATO （10 μmol·L―1） +Ox-LDL/β2GP Ⅰ組 和ATO+ Ox-LDL/β2GPⅠ/anti-β2GPⅠ組。

1.3 MTT 法檢測(cè)各組細(xì)胞存活率96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中每孔加入100 μL 細(xì)胞懸液，調(diào)整待測(cè)細(xì)胞密度至每孔1×105個(gè)，每組設(shè)6 個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)24 h，至細(xì)胞完全貼壁。分別加入不同刺激物，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)。每孔加入20 μL MTT 溶液（5 g·L―1），37 ℃孵育4 h。去除孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150 μL DMSO，置搖床上低速振蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。在酶標(biāo)儀490 nm處檢測(cè)各孔的吸光度（A）值，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（處理組A 值―調(diào)零孔A 值）/（對(duì)照組A 值―調(diào)零孔A 值）×100%。

1.4 Western blotting 法檢測(cè)各組蛋白表達(dá)水平采用Western blotting 法檢測(cè)各組蛋白表達(dá)水平，將細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，細(xì)胞培養(yǎng)終止后，棄去培養(yǎng)液，預(yù)冷生理鹽水洗滌細(xì)胞3 遍，加入RIPA 裂 解 液， 冰 上 裂 解5 min， 4 ℃、12000 r·min―1、離 心15 min，去 沉 淀 留 取 上 清，進(jìn)行BCA 蛋白定量。采用SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)膜， 5% 脫脂牛奶室溫封閉1 h， 加入一抗GAPDH、 TRAF3IP2、 p-IKKγ 和p-NF- κB p65（1∶1000），4 ℃孵育過(guò)夜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠（兔）二抗（1∶2000），搖床室溫孵育 2 h， 增 強(qiáng) 化 學(xué) 發(fā) 光 法 （enhanced chemiluminescence，ECL）顯色。以GADPH 為內(nèi)參蛋白，采用Image J 軟件分析蛋白灰度值，計(jì)算目的蛋白表達(dá)水平。目的蛋白表達(dá)水平=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參條帶灰度值。

1.5 化學(xué)熒光探針?lè)z測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)ROS 熒光強(qiáng)度按照說(shuō)明書(shū)用無(wú)血 清H-DMEM 培 養(yǎng) 基1∶1000 稀釋探針得到終濃度為10 μmol·L―1ROS 熒光探針（DCFH-DA）工作液。將細(xì)胞接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)終止后，棄去培養(yǎng)液，生理鹽水洗滌細(xì)胞3 遍。每孔中加入DCFH-DA 探針工作濃度，37 ℃孵育20 min。用無(wú)血清H-DMEM 培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞3 次，以完全去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的DCFH-DA 探針。使用激發(fā)波長(zhǎng)488 nm，發(fā)射波長(zhǎng)525 nm 進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，采用倒置熒光顯微鏡觀察并拍照保存。應(yīng)用Image J 軟件進(jìn)行熒光強(qiáng)度分析，計(jì)算ROS 熒光強(qiáng)度。ROS 熒光強(qiáng)度=呈現(xiàn)熒光的面積/總面積。

1.6 ELISA 法檢測(cè)各組細(xì)胞上清液中ET-1 水平將HUVECs 接種于6 孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)終止后，收集培養(yǎng)基，1000 g 離心20 min，取上清。按照ELISA 試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用Graph Pad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。各組HUVECs 存活率，TRAF3IP2、IKK 和NF-κB 蛋 白 表 達(dá) 水 平，ROS熒光強(qiáng)度，細(xì)胞上清中ET-1 水平均符合正態(tài)分布，以-±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組HUVECs 存活率與對(duì)照組比較，Ox-LDL 組、 β2GPⅠ/anti-β2GPⅠ組、 Ox-LDL/β2GP Ⅰ 組 、 Ox-LDL/β2GP Ⅰ/anti-β2GP Ⅰ組HUEVCs 12 h 存活率明顯降低（P＜0.05）；與Ox-LDL/ β 2GP Ⅰ組 和 Ox-LDL/ β 2GP Ⅰ/antiβ 2GPⅠ組比較，ATO 預(yù)處理1 h 后，ATO+Ox-LDL/β2GPⅠ 組 和 ATO+Ox-LDL/ β 2GPⅠ/anti- β2GPⅠ組HUVECs 存活率升高（P＜0.05）。見(jiàn)圖1。

圖1 MTT 法檢測(cè)各組HUVECs 存活率Fig.1 Survival rates of HUVECs in various groups detected by MTT assay

2.2 各組HUVECs 中ROS 熒光強(qiáng)度和細(xì)胞上清中ET-1 水平與對(duì)照組比較，Ox-LDL 組、Ox-LDL/β2GP Ⅰ組 和Ox-LDL/β2GP Ⅰ/anti-β2GP Ⅰ組ROS 熒光強(qiáng)度及細(xì)胞上清中ET-1 水平明顯升高（P＜0.05）。與Ox-LDL/β 2GPⅠ組 和Ox-LDL/β 2GPⅠ/anti-β2GPⅠ組比較，ATO 處理后ATO+Ox-LDL/β2GP Ⅰ組 和ATO+Ox-LDL/β2GP Ⅰ/anti-β2GPⅠ組HUVECs 中ROS 熒光強(qiáng)度和細(xì)胞上清中ET-1表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖2和3。

圖2 各組HUVECs 中ROS 熒光強(qiáng)度Fig.2 Fluorescence intensities of ROS in HUVECs in various groups

圖3 各組HUVECs 中ROS 熒光強(qiáng)度（A）和細(xì)胞上清中ET-1 水平(B)Fig.3 Fluorescence intensities of ROS in HUVECs and ET-1 levels in cell supernatant in various groups

2.3 各組HUVECs 中TRAF3IP2、IKK 和NF-κB蛋白表達(dá)水平與對(duì)照組比較，Ox-LDL 組、Ox-LDL/β2GPⅠ組和Ox-LDL/β2GPⅠ/anti-β2GPⅠ組HUVECs 中 TRAF3IP2、 p-IKK γ 和 p-NF- κ B p65 蛋白的表達(dá)水平升高（P＜0.05）。與Ox-LDL/β2GP Ⅰ組 和Ox-LDL/β2GP Ⅰ/anti-β2GP Ⅰ組 比較，ATO 預(yù)處理后，ATO+Ox-LDL/β2GPⅠ組和 ATO+Ox-LDL/β2GP Ⅰ/anti-β2GP Ⅰ 組HUVECs 中TRAF3IP2、p-IKKγ 和p-NF-κB p65蛋白表達(dá)水平降低（P＜0.05）。見(jiàn)圖4。

圖4 Western blotting 法檢測(cè)各組HUVECs 中TRAF3IP2、p-IKK 和p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)電泳圖（A）和直條圖（B-D）Fig. 4 Electrophoretogram (A) and histogram (B-D) of TRAF3IP2,p-IKK,and p-NF-κB p65 proteins in HUVECs in various groups detected by Western blotting method

3 討論

氧化應(yīng)激、內(nèi)皮細(xì)胞活化和內(nèi)皮細(xì)胞功能障礙在很大程度上被認(rèn)為是大血管疾病發(fā)病機(jī)制的主要改變。在APS 背景下的AS 患者早期口服ATO 可早期改善血管內(nèi)皮功能紊亂，延緩AS 的發(fā)生和發(fā)展，旨在防止AS 的早期進(jìn)展，并減少患者后期的不良事件。

生理?xiàng)l件下ROS 作為信號(hào)分子，在維持血管穩(wěn)態(tài)、預(yù)防心血管炎癥和損傷中發(fā)揮重要作用［11-12］。然而在病理應(yīng)激過(guò)程中，血管壁產(chǎn)生異常水平的ROS，擾亂了氧化還原穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而影響血管細(xì)胞的功能。氧化應(yīng)激驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄因子，從而誘導(dǎo)炎癥因子、可溶性介質(zhì)和趨化因子的表達(dá)。而且炎癥細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和趨化因子導(dǎo)致ROS 水平升高，從而形成不良循環(huán)加劇炎癥的發(fā)生［13］。本課 題 組 前 期 研 究［6］表 明：Ox-LDL 是 反 映AS 病 變程度的重要指標(biāo)，可引發(fā)內(nèi)皮功能紊亂。氧化應(yīng)激是AS 發(fā)病機(jī)制中的重要組成部分，與促炎信號(hào)通路的激活和細(xì)胞因子/趨化因子的表達(dá)并行發(fā)生［2］。血脂異常等動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾?。╟ardiovascular disease，CVD）危險(xiǎn)因素均伴隨機(jī)體ROS 水 平 的 升 高［3］。APS 患 者 體 內(nèi) 主 要 的 靶 抗原β2GPⅠ通過(guò)V 結(jié)構(gòu)域與Ox-LDL 結(jié)合構(gòu)成循環(huán)免疫復(fù)合物加速AS 的進(jìn)程［14-15］。Ox-LDL/β2GPⅠ在體內(nèi)可與anti-β2GPⅠ抗體進(jìn)一步結(jié)合形成復(fù)合物，本 研 究 首 次 證 實(shí)Ox-LDL/ β 2GPⅠ/antiβ2GP Ⅰ復(fù)合物對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞功能損傷最顯著，為APS 的AS 進(jìn)展提供理論依據(jù)。

研究［16］表明：ATO 對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞動(dòng)員有積極作用，但在血管內(nèi)皮功能紊亂方面的機(jī)制尚不清楚。內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等是參與AS 斑塊形成的主要細(xì)胞類(lèi)型， 均可表達(dá)TRAF3IP2［17-18］。Ox-LDL 可 誘 導(dǎo)TRAF3IP2 的 表達(dá)和內(nèi)皮功能障礙［17］。研究［17，19］表明：血管緊張素Ⅱ（angiotesin Ⅱ，Ang Ⅱ）、醛固酮、白細(xì)胞介素18 （interleukin-18，IL-18） 和高級(jí)氧化蛋白產(chǎn)物（advanced oxidative protein products，AOPPs）在體外可上調(diào)TRAF3IP2 的表達(dá)。TRAF3IP2 是NF-κB 的上游激活因子，TRAF3IP2 通過(guò)泛素化結(jié)合TRAF6 并激活I(lǐng)KK，從而使NF-κB 磷酸化、降解以及核轉(zhuǎn)位［20-21］。本研究結(jié)果表明：在Ox-LDL/β2GPⅠ及Ox-LDL/β2GPⅠ/anti-β2GPⅠ復(fù)合物刺激下，HUVECs 中TRAF3IP2、p-IKKγ 和p-NF-κB p65 蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)，TRAF3IP2/IKK/NF-κB 信號(hào)通路在Ox-LDL 復(fù)合物所致AS 中起重要作用。ATO 預(yù)處理后，可逆轉(zhuǎn)由Ox-LDL/β2GPⅠ/anti-β2GPⅠ復(fù) 合 物 誘 導(dǎo) 的TRAF3IP2、p-IKKγ 和p-NF-κB p65 蛋 白 表 達(dá) 水 平 升 高。本 研究表明Ox-LDL/β2GPⅠ/anti-β2GPⅠ復(fù)合物可通過(guò)調(diào)節(jié)TRAF3IP2/IKK/NF-κB 信號(hào)通路引起血管內(nèi)皮功能紊亂，臨床常規(guī)降血脂藥物ATO 可通過(guò)抑制此通路改善血管內(nèi)皮功能。

綜上所述，Ox-LDL復(fù)合物中Ox-LDL/β2GPⅠ/anti-β2GPⅠ復(fù)合物對(duì)于血管內(nèi)皮功能紊亂作用最強(qiáng)。降血脂藥物ATO 可下調(diào)TRAF3IP2/IKK/NFκB 信號(hào)通路改善內(nèi)皮功能的紊亂，為探討APS 下抑制AS 的發(fā)生發(fā)展奠定了理論基礎(chǔ)。