王 靜, 徐 暢, 宋藝蘭, 王重陽, 姜京植, 李良昌, 延光海, 蘇立明

（1. 延邊大學 吉林省過敏性常見疾病免疫與靶向研究重點實驗室，吉林 延吉 133002；2. 延邊大學附屬醫(yī)院兒科，吉林 延吉 133002；3. 延邊大學醫(yī)學院解剖學教研室，吉林 延吉 133002）

哮喘是臨床上一種常見的慢性病，隨著哮喘逐年加重，患者的生命也隨時面臨嚴重威脅［1］。因此，為了緩解哮喘患者的痛苦，探究哮喘的發(fā)病機制迫在眉睫。哮喘患者發(fā)病時的主要癥狀包括呼吸困難、胸悶和反復(fù)咳嗽。哮喘主要累積小氣道和大氣道，由于嗜酸性粒細胞大量聚集在氣管周圍，如白細胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）和腫瘤壞死因子α（tumor necrosis facter-α，TNF-α）促炎因子表達增加，從而使氣道形成炎癥狀態(tài)，最終導(dǎo)致呼吸時氣流阻塞［2］。哮喘發(fā)生時輔助T 細胞2（T helper cell 2，Th2） 的功能亢進，炎癥因子白細胞介素4（interleukin-4，IL-4）和白細胞介素13（interleukin-13，IL-13）等分泌增加，而輔助T 細胞1（T helper cell 1，Th1）型細胞受到抑制，γ 干擾素（interfern-γ，IFN-γ）分泌不足。白細胞介素6（interleukin-6，IL-6）是重要的促炎細胞因子之一，其通過膜結(jié)合和可溶性受體這2 種生物學途徑發(fā)揮不同作用。研究［3］顯示：在炎癥發(fā)生時，IL-6 信號通路通過可溶性白細胞介素6 受體（interleukin-6 receptor，IL-6R）來發(fā)揮促炎作用，IL-6 信號通路激活后通過信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT）依賴和STAT 獨立這2 種不同的信號模塊對炎癥反應(yīng)進行調(diào)節(jié)。其中，信號傳導(dǎo)和STAT3 信號通路屬于STAT 獨立信號模塊［4］。研究［5-6］顯示：在細胞實驗中，抑制STAT3 蛋白的表達可以有效減少受刺激劑處理的氣道平滑肌細胞中炎性細胞因子IFN-γ、IL-2 和IL-12 水平。因 此，IL-6/STAT3信號通路可能是調(diào)控哮喘炎癥機制的重要靶標。商陸皂苷甲（esculentoside A，EsA） 是一種從植物商陸根中分離出的三萜類皂苷［6］。已有研究［7-8］證實：EsA 具有抗炎、增強免疫力和抗腫瘤等多種藥理作用。研究［7］顯示：EsA 可以治療多種呼吸系統(tǒng)炎癥，并增強患者免疫功能。李柳美等［9］研究顯示：EsA 可明顯提高細胞凋亡蛋白表達，以提升其抗腫瘤活性。目前尚無關(guān)于EsA 在哮喘小鼠模型中對IL-6/STAT3 信號通路影響的相關(guān)報道。本研究建立卵清蛋白（ovalbumin，OVA）誘導(dǎo)的小鼠哮喘模型，探討EsA 對哮喘小鼠氣道炎癥的作用及IL-6/STAT3 信號通路的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器選取清潔級雌性BALB/c 小鼠40 只（6～8 周齡），體質(zhì)量（20±2） g，購自延邊大學實驗動物管理中心，動物使用許可證號：SYXK （吉） 2020-0010。整個實驗過程中維持小鼠自由進食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境中濕度保持在40%～50%，溫度保持在18 ℃～22 ℃。本實驗已獲得延邊大學醫(yī)學院倫理委員會批準，并嚴格按照《實驗動物管理條例》法規(guī)中的要求。OVA、氫氧化鋁凝膠和EsA 購自美國Sigma 公司，HE 染色試劑盒購自中國Solarbio 公司， Diff-Quik 購自美國AbMole 公司，小鼠IL-4 和IFN-γ ELISA 試劑盒購自美國Abcam 公司，熒光標記PC5.5-CD3e、FITC-CD4+、APC-IL-4 和PC7-IFN-γ 的細胞因子抗體購自美國BD Pharmingen 公司，IL-6、STAT3、β-actin 和Anti-Rabbit IgG 抗體購自美國Abcam 公司。小鼠給藥霧化儀購自日本歐姆龍公司， 離心機購自中國湘儀離心機儀器公司，CytoFLEX 流式細胞儀購自美國BECKMAN 公司，Epoch 全波長酶標儀和AI 600 超靈敏化學發(fā)光成像儀購自美國Bio-Tek 公司。

1.2 實驗動物分組、模型制備和給藥40 只小鼠隨機分為空白對照組、OVA 組、低劑量EsA 組和高劑量EsA 組，每組10 只。小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周，除空白對照組外，其他各組小鼠采用腹腔注射（100 μg OVA 和1 mg 氫氧化鋁混合溶于0.2 mL 生理鹽水中）致敏，分別于第1、7 和14 天致敏。從第21 天開始采用1% OVA 激發(fā)，每1 d 為1 個激發(fā)周期，每個激發(fā)周期激發(fā)1 次，共進行3 次，第23 天為末次激發(fā)。空白對照組小鼠以生理鹽水致敏和激發(fā)?？瞻讓φ战M和OVA 組應(yīng)用0.2 mL 生理鹽水灌胃給藥。低劑量EsA 組和高劑量EsA 組小鼠 分 別 按 體 質(zhì) 量（10 和20 mg·kg－1） 灌 胃 給藥，從第17 天開始，連續(xù)給藥7 d，每天1 次。

1.3 小鼠支氣管肺泡灌洗液（broncho-alveolar lavage fluid，BALF）收集給藥結(jié)束后，麻醉小鼠至死，將小鼠固定于手術(shù)臺，切開頸部皮膚，暴露氣管，將氣管切開小口后置入細軟管，通過細軟管注入預(yù)冷的1 mL PBS 緩沖液，按摩后回收BALF，要求回收量達80% 以上。

1.4 HE 染色觀察各組小鼠肺組織病理形態(tài)表現(xiàn)切開小鼠胸腔取肺，左肺固定，石蠟包埋后切成5 μm 切片，進行后續(xù)染色?？酒? h 后，在二甲苯中進行約20 min 的脫蠟過程，之后將脫蠟后的切片置于梯度酒精中使其水化20 min，使用清水沖片，再將其置入蘇木素中約7 min，取出后使用流水將載玻片上的多余染液沖掉，再將切片放入0.5%伊紅染液中約30 s 后取出在清水中沖洗，觀察是否染色均勻。待切片染色后再次用梯度酒精和二甲苯進行脫水和透明，最后在二甲苯揮發(fā)后用中性樹脂膠進行封片，在顯微鏡下觀察并拍照。

1.5 流式細胞術(shù)檢測各組小鼠BLFA 中IL-4 和IFN-γ 水平BALF 離 心，加 破 膜 劑 暗 處 孵 育10 min。2 mL PBS 緩沖液洗滌后離心，棄上清。加固定劑，室溫暗處孵育15 min，離心5 min，棄上清。加入熒光標記的細胞因子抗體（PC5.5-CD3e、 FITC-CD4+、 APC-IL-4 和PC7-IFN-γ），混勻，室溫暗處孵育30 min，2 mL PBS 緩沖液洗滌后離心，棄上清，加入500 μL PBS 緩沖液上機。

1.6 ELISA 法檢測各組小鼠BALF 中細胞因子水平將BALF 取出，將其全部溶解后，按照ELISA 試劑盒說明書操作，配制工作液和洗滌液，使用不同濃度的樣本配制出具有濃度梯度的標準品，將樣本和標準品添加至相應(yīng)孔中，設(shè)空白對照孔，37 ℃下水浴放置2 h，用洗板機洗滌3 次，添加生物素化抗體。 37 ℃水浴再放置2 h，第2 次用洗板機洗3 次，加入酶結(jié)合物工作液，使二者發(fā)生反應(yīng)。 37 ℃下再放置1 h，洗板機洗滌3 次。最后，添加顯色底物，37 ℃下放置20 min ，加入終止液。其反應(yīng)所生成的顏色反應(yīng)可采用酶標儀在其特定吸收光區(qū)域檢測，再根據(jù)標準曲線所得方程式計算出BALF 中IL-4 和IFN-γ 水 平。

1.7 直接計數(shù)法計算各組小鼠BALF 炎癥細胞數(shù)量BALF 離心，采用600 μL PBS 緩沖液將其進行細胞重懸，并反復(fù)吹打溶液混至均勻，每次取200 μ L 混懸液，離心機離心甩片5 min，轉(zhuǎn)速1500 r·min－1。根據(jù)Diff-Quik 溶液和試劑盒說明書進行染色，并在細胞儀上根據(jù)細胞形態(tài)和染色特征等將細胞分類和計數(shù)。由2 名獨立研究者采用單盲研究確定，并在顯微鏡下從3 個隨機位置分析至少200 個細胞。

1.8 流式細胞術(shù)檢測各組小鼠組織中嗜酸性粒細胞數(shù)量BALF 離心，加固定劑，室溫暗處孵育15 min，離心后棄上清。加入熒光標記的嗜酸性粒細胞抗體 （APC-CD45.2 和PE-siglec-F），混勻，室溫暗處孵育30 min，2 mL PBS 緩沖液洗滌后離心，棄上清，加入500 μL PBS 緩沖液上機。

1.9 免疫組織化學法檢測各組小鼠肺組織中IL-6和STAT3 蛋白的表達肺組織切片再經(jīng)過烤片、脫蠟和梯度酒精脫水等程序后，采用枸櫞酸溶液對樣本浸泡并加熱達一定溫度使抗原修復(fù)。放置溫度達室溫后，采用PBS 緩沖液進行洗滌，根據(jù)免疫組織化學試劑盒說明書完成后續(xù)步驟的操作，再放置一抗（IL-6 和STAT3）后，于4 ℃冰箱中過夜，最后經(jīng)DAB 顯色，蘇木素復(fù)染，并用清水沖洗，透明，二甲苯揮發(fā)后，封片。在Cytation5 微孔成像儀下觀察并拍照。

1.10 免疫熒光法檢測各組小鼠肺組織中IL-6 和STAT3 表達水平肺組織切片經(jīng)過烤片、脫蠟和梯度酒精脫水后進行抗原修復(fù)，待溫度降至室溫后，用預(yù)冷PBS 緩沖液沖洗3 次，每次3 min，5%山羊血清封閉30 min，預(yù)冷PBS 緩沖液沖洗3 次，每次3 min。用5% 山羊血清封閉，約30 min ，使用一抗（IL-6 和STAT3）染色，并在4 ℃冰箱中過夜。第2 天，用預(yù)冷PBS 緩沖液沖洗15 min，加相對應(yīng)二抗，37 ℃下放置2 h，在避光的環(huán)境下用預(yù)冷PBS 緩沖液再洗15 min，最后，加入DAPI，封片，在Cytation5 微孔成像儀下觀察、拍照。

1.11 Western blotting 法檢測各組小鼠肺組織中IL-6 和STAT3 蛋白表達水平小鼠肺組織在樣品緩沖液中溶解后變性。采用BCA 蛋白測定試劑盒檢測總蛋白和細胞核蛋白的濃度。采用SDSPAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì)樣品，并轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。再用5% 脫脂奶粉封閉1 h，與一抗IL-6、STAT3 和β-actin 在4 ℃環(huán)境下共同孵育一夜。用二抗在室溫（25 ℃）下孵育2 h，加顯影劑上機檢測。采用Image J 軟件分析條帶灰度，以β-actin 為內(nèi)參，計算目的蛋白表達水平。目的蛋白表達水平=目的蛋白條帶灰度值/β-actin 條帶灰度值。

1.12 統(tǒng)計學分析采用SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學分析。各組小鼠BALF 中炎癥細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數(shù)，IL-4、IFN-γ、IL-1β 和TNF-α 水平，肺組織中IL-6 和STAT3 蛋白表達水平均符合正態(tài)分布，以±s表示，多組間樣本均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠肺組織病理形態(tài)表現(xiàn)空白對照組小鼠肺組織的支氣管結(jié)構(gòu)輪廓清楚，氣道管壁薄厚均勻，肺泡壁結(jié)構(gòu)相對完整；OVA 組小鼠肺組織出現(xiàn)廣泛的支氣管周圍和血管周圍炎性細胞浸潤，支氣管部分損傷；與OVA 組比較，低劑量EsA 組和高劑量EsA 組小鼠肺組織中炎性細胞浸潤明顯減少，氣道損傷減輕。見圖1。

圖1 各組小鼠肺組織病理形態(tài)表現(xiàn)（HE,×100）Fig.1 Morphology of lung tissue of mice in various groups（HE,×100）

2.2 各組小鼠BLFA 中細胞因子水平流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示：與空白對照組比較，OVA 組小鼠BALF 中IL-4 水平升高（P＜0.05），IFN-γ 水平降低（P＜0.05）；與OVA 組比較，低和高劑量EsA 組 小 鼠BALF 中IL-4 水 平 降 低（P＜0.05），IFN-γ 水平升高（P＜0.05）。見圖2。ELISA 法檢測結(jié)果顯示：與空白對照組比較，OVA 組小鼠BALF 中IL-1β 和TNF-α 水 平 明 顯 升 高（P＜0.01）；與OVA 組比較，低和高劑量EsA 組小鼠BALF 中IL-1β 和TNF-α 水 平 明 顯 降 低（P＜0.01）。見圖3。

圖2 流式細胞術(shù)檢測各組小鼠BALF 中IL-4 和IFN-γ 水平Fig.2 Levels of IL-4 and IFN-γ in BALF of mice in various groups detected by flow cytomtry.

圖3 ELISA 法檢測各組小鼠BALF 中細胞因子TNF-α(A)和IL-1β(B)水平Fig.3 Levels of TNF-α(A)and IL-1β(B)in BALF of mice in various groups detected by ELISA method

2.3 各組小鼠BLFA 中炎癥細胞數(shù)量通過Diff-Quik 染色計數(shù)BALF 中炎癥細胞數(shù)量。與空白對照組比較，OVA 組小鼠BALF 中總炎癥細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數(shù)量升高（P＜0.05）；與OVA 組比較，低和高劑量EsA 組小鼠BLFA 中總炎癥細胞、嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞數(shù)量明顯降低（P＜0.05）。見圖4。流式細胞術(shù)檢測BLFA 中嗜酸性粒細胞表達結(jié)果與Diff-Quik 染色結(jié)果一致。見圖5。

圖4 Diff-Quik 染色檢測各組小鼠BALF 中炎癥細胞數(shù)量Fig.4 Number of inflmmatory cells in BALF of mice in various groups detected by Diff-Quik staining

圖5 流式細胞術(shù)檢測各組小鼠BALF 中嗜酸性粒細胞數(shù)量Fig.5 Levels of eosinophlls in BLFA of mice in various groups detected by flow cytomotry

2.4 各組小鼠肺組織中IL-6 和STAT3 蛋白表達水平分別采用免疫組織化學法、免疫熒光法和Western blotting 法檢測各組小鼠肺組織中IL-6 和STAT3 表達情況。與空白對照組（7.15±1.42，6.04±0.45）比較，OVA 組小鼠肺組織中IL-6 和STAT3蛋白表達水平（36.20±3.84，41.38±1.02） 升高（P＜0.05 或P＜0.01），低（32.04±1.33，19.35±0.56） 和高劑量EsA 組（9.13±1.05， 10.05±1.49） 小鼠肺組織中IL-6和STAT3 蛋白表達水平降低（P＜0.05 或P＜0.01）。見圖6～8。

圖6 免疫組織化學法檢測各組小鼠肺組織中IL-6 和STAT3 蛋白表達情況（Bar=50 μm）Fig.6 Expressions of IL-6 and STAT3 proteins in lung tissue of mice in various groups detected by immunohistochemistry（Bar=50 μm）

3 討論

哮喘的發(fā)生主要是由氣道慢性炎癥所導(dǎo)致，其癥狀發(fā)展主要經(jīng)歷了嗜酸性粒細胞浸潤和氣道黏膜表面上皮細胞脫落［10-12］。當外源性的刺激原通過各種途徑進入到體內(nèi)，被抗原遞呈細胞內(nèi)吞并激活免疫細胞，活化的免疫細胞合成多種活性介質(zhì)，導(dǎo)致平滑肌收縮、黏液分泌增加和炎性細胞浸潤。本研究結(jié)果顯示：EsA 可明顯降低OVA 引起的哮喘小鼠的嗜酸性粒細胞、中性粒細胞和淋巴細胞炎癥細胞浸潤。EsA 能夠避免氣管周圍大量的嗜酸性粒細胞浸潤。

哮喘的特點是Th1/Th2 細胞無法達到平衡，Th2 類細胞工作異常，使細胞因子激活的數(shù)量多于正常水平，從而導(dǎo)致生成IgE，引起過敏性氣道炎癥發(fā)生。研究［13］顯示：哮喘發(fā)生Th2 亢進時，炎癥因子IL-4 表達增加。研究［14］表明：Th1 細胞產(chǎn)生的IFN-γ 拮抗Th2 介導(dǎo)的免疫應(yīng)答，從而對治療哮喘具有積極的作用。本研究結(jié)果表明：EsA 可以通過調(diào)節(jié)IL-4 和IFN-γ 來改善Th1/Th2 的免疫失調(diào)。支氣管上皮細胞炎癥時產(chǎn)生的促炎細胞因子在哮喘發(fā)生發(fā)展中扮演著重要的角色，如IL-1β 對于Th1、Th2 和Th17 的炎癥具有促進其產(chǎn)生的作用。研究［15］表明：在OVA 誘導(dǎo)哮喘小鼠模型組BALF 中IL-1β 表達水平明顯升高。研究［16］顯示：TNF-α 在哮喘發(fā)病時，能夠使血管發(fā)生炎癥損傷，炎性細胞浸潤，且其是造成該狀況的主要原因。本研究結(jié)果表明：EsA 對IL-1β 和TNF-α 的表達具有抑制作用。

喻強強等［17］已證明IL-6/STAT3 通路參與哮喘大鼠氣道炎癥的發(fā)生和發(fā)展階段。張建文［18］發(fā)現(xiàn)IL-6/STAT3 信號通路在兒童喘息性支氣管炎中發(fā)揮重要作用。研究［19］顯示：在患有臨床活動性和內(nèi)源性哮喘患者BALF 中IL-6 水平升高。STAT3 是一種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子，介導(dǎo)細胞對白細胞介素和其他生長因子的反應(yīng)。研究［20］發(fā)現(xiàn)：哮喘氣道炎癥的形成有STAT3 和Akt/GSK-3β 通路的參與。本研究結(jié)果表明：EsA 可以降低OVA 誘導(dǎo)哮喘小鼠肺組織中IL-6 和STAT3 表達。

綜上所述，EsA 預(yù)處理可以減輕OVA 組小鼠氣道病變，減少促炎因子的產(chǎn)生，并降低肺組織中IL-6 和STAT3 的表達水平。EsA 可能是治療哮喘的一種潛在的抗炎藥物。

圖7 免疫熒光法檢測各組小鼠肺組織中IL-6 蛋白表達情況（Bar=50 μm）Fig.7 Expressions of IL-6 protein in lung tissue of mice in various groups detected by immunofluorescence method（Bar=50 μm）

圖8 Western blotting 法檢測各組小鼠肺組織中IL-6和STAT3 蛋白表達電泳圖Fig. 8 Electrophoregram of expressions of IL-6 and STAT3 proteins in lung tissue of mice in various groups detected by Western blotting method