宋海巖，孫淑霞，陳 棟，李 靖，涂美艷，徐子鴻，婁紅霞，龔榮高 *，江國良 *

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院，成都 611130；2.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所＆農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點實驗室，成都 610066）

枇杷（Eriobotrya japonicaLindl.）是原產(chǎn)于我國四川大渡河流域的特色水果，其果實甜酸適口、柔軟多汁，受到世界各國消費者的喜愛。枇杷品種豐富多樣，生產(chǎn)上常依據(jù)果肉顏色將枇杷品種劃分為黃肉枇杷和白肉枇杷兩種類型[1]。黃肉枇杷果肉較緊密，果皮較厚，較耐貯運，抗逆性強，平均單果重較大，而白肉枇杷肉質(zhì)細嫩、汁多味甜，因其風(fēng)味好、口感佳而更受消費者的青睞[2]。

果實顏色的形成主要依賴于果肉中色素的積累，其中類胡蘿卜素是成熟枇杷果實的主要呈色色素[3]。黃肉枇杷的果皮和果肉以及白肉枇杷的果皮可以正常地積累類胡蘿卜素，而白肉枇杷的果肉不積累或者僅積累少量的類胡蘿卜素從而導(dǎo)致其果肉呈現(xiàn)白色[4]。遺傳分析顯示枇杷果肉顏色中黃肉為顯性性狀，而白肉為隱性性狀[5-6]。Fu X.等[7]的研究結(jié)果顯示黃肉和白肉枇杷品種間類胡蘿卜素生物合成基因的表達差異并不能很好地解釋兩類枇杷品種間類胡蘿卜素含量的巨大差異。八氫番茄紅素合成酶（Phytoene synthase）是類胡蘿卜素生物合成途徑中的關(guān)鍵限速酶，極大地影響植物類胡蘿卜素的積累[8]。Fu X.等[8]進一步的研究結(jié)果顯示枇杷品種白沙（白肉）由于EjPSY2A基因在3’端發(fā)生大片段的缺失導(dǎo)致八氫番茄紅素合成酶失活從而致使類胡蘿卜素?zé)o法正常合成和積累；而洛陽青（黃肉）的EjPSY2A基因的序列正常，可以正常合成并積累類胡蘿卜素。

與傳統(tǒng)育種方法相比，分子標記輔助育種（MAS）提供了一種高效和精準的選育優(yōu)良品種的方法[9]。與目的性狀連鎖的分子標記的開發(fā)是開展分子標記輔助育種的前提。插入和缺失多態(tài)性標記是一類重要的分子標記，具有共顯性、廣泛分布、可重復(fù)性以及高效性等特點而深受歡迎[10]。InDel標記已經(jīng)成功地在水稻、玉米、小麥以及園藝作物中使用[11-14]。為加速不同果肉顏色類型枇杷優(yōu)良品種的選育，我們基于不同果肉顏色枇杷品種間的EjPSY2A基因序列差異開發(fā)一個InDel分子標記，并選擇具有代表性的29個選育品種、19個地方品種、14個引進品種、4份野生種質(zhì)資源和19份雜交后代對其鑒定效果進行驗證。

1 材料和方法

1.1 材料

供試材料包含中國9個省、市和自治區(qū)以及西班牙、意大利、美國和日本等國家共收集85份枇杷種質(zhì)資源以及項目組創(chuàng)制的雜交后代，其中42份材料為黃肉枇杷，43份材料為白肉枇杷，覆蓋世界上枇杷種質(zhì)資源分布的大部分區(qū)域（表1）。所有枇杷供試材料種植于四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新示范園（北緯30°46'47″，東經(jīng)104°12'28″，海拔489 m），園區(qū)內(nèi)枇杷品種資源樹齡6～8年，株行距3 m×5 m，疏散分層型，采取常規(guī)田間管理措施。果實完熟期觀察每個品種的果肉顏色并拍照記錄。收集各個品種枇杷的幼嫩葉片用于DNA提取以及后續(xù)的基因分型工作。

1.2 引物設(shè)計和基因分型

基于Fu X.等[8]的研究結(jié)果，白肉枇杷品種的EjPSY2A基因序列在3’端有694 bp堿基的缺失，我們在EjPSY2A基因InDel位點兩側(cè)設(shè)計引物用于InDel位點的擴增和分型（表1）。改良CTAB法用于枇杷基因組DNA的提取，使用液氮和研缽將新鮮嫩葉磨成粉并轉(zhuǎn)入2.0 mL離心管中，加入600 μL 65℃預(yù)熱的CTAB提取液，混勻后65℃水浴30 min，中途混勻2次；加入350 μL 25∶24∶1的酚︰氯仿︰異戊醇抽提液，離心；上清液轉(zhuǎn)入新的1.5 mL離心管，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，離心；倒掉上清，加入1 mL 75%乙醇漂洗；自然風(fēng)干沉淀，加入TE溶液溶解DNA。使用NanoDrop one微量紫外可見分光光度計檢測DNA濃度和質(zhì)量，備用。PCR反應(yīng)體系：1.0 μL DNA 模 板 ，12.5 μL 2×PCR Mix（擎科），1.0 μL 10 μM正反向引物，加ddH2O至25 μL。PCR擴增程序：94℃預(yù)變性4 min，95℃變性1 min，55℃退火45 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35次，最后72℃延伸10 min。使用1%的瓊脂糖凝膠電泳和8%的聚丙烯酰胺凝膠電泳對PCR產(chǎn)物進行基因分型。

表1 基于枇杷EjPSY2A基因設(shè)計的果肉顏色分子標記引物Table 1 The primers of the molecular marker for flesh color based on EjPSY2A gene in loquat

1.3 InDel分子標記的驗證

首先選用10份黃肉和10份白肉枇杷種質(zhì)資源對基于EjPSY2A基因新設(shè)計的2對InDel分子標記引物進行初步驗證和篩選，然后使用選定的引物對85份枇杷種質(zhì)資源與雜交后代進行PCR擴增和基因分型，對分子標記的準確性進行最終的驗證。

1.4 TA克隆

為檢測PSY2A基因的InDel引物擴增片段的正確性，我們對PCR產(chǎn)物進行TA克隆并測序。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖電泳后對目標片段進行切膠回收，連接至TA克隆載體pClone007 vector，反應(yīng)體系為：1 μL PCR 回收產(chǎn)物，1 μL pClone007 vector，1 μL 10×Topo Mix（擎科）和7 μL ddH2O，室溫反應(yīng)5 min。連接產(chǎn)物繼續(xù)使用TreliefTM5α（擎科）進行大腸桿菌轉(zhuǎn)化，每一個目的片段挑取1個陽性克隆進行測序，測序結(jié)果與PSY2A基因的參考序列進行比對[8]。

2 結(jié)果與分析

2.1 果肉顏色鑒定

為鑒定85份供試枇杷材料的果肉顏色，我們于2020年5月枇杷果實完全成熟時觀察果肉的顏色，每個材料至少選取10個以上完全成熟的果實觀察并拍照記錄。觀察結(jié)果顯示，85份供試材料中42份材料的果實為黃肉，43份材料的果實為白肉（表2），部分枇杷品種的果肉顏色如圖1。

圖1 完熟期枇杷果皮及果肉顏色Figure 1 The color of fruit and flesh in loquat at full ripen stage

（續(xù) 表2）

2.2 InDel分子標記的開發(fā)

為通過分子標記鑒定不同果肉顏色的枇杷，我們基于已公布的枇杷PSY2A基因（GenBank accession numbers KF922364）的序列設(shè)計了2對InDel分子標記的引物（表2）。首先，我們選取了20份枇杷材料（10份黃肉材料和10份白肉材料）對兩對InDel引物的擴增效率以及條帶清晰度進行檢驗，結(jié)果顯示兩對InDel引物均能擴增出目的條帶，且兩對引物對同一品種擴增出來的帶型一致（圖2）。所有白肉枇杷材料擴增小片段純合帶型，表明基因型為純合EjPSY2Ad。黃肉枇杷材料中Y1艷紅、Y3大五星擴增出來大片段純合帶型，表明這3個樣品的基因型為純合EjPSY2A，無法擴增出EjPSY2Ad的片段，未發(fā)生基因的大片段缺失，其余黃肉材料均為雜合帶型，為EjPSY2A和EjPSY2Ad的雜合基因型。在試驗過程中，我們發(fā)現(xiàn)第二對InDel引物PSY2A-2擴增出來的條帶更清晰（圖2），但PSY2A-2引物擴增的大片段依然不夠明顯，因此在后續(xù)的試驗中我們計劃改用聚丙烯酰胺凝膠電泳對PSY2A-2開展進一步驗證。

圖2 使用兩對新設(shè)計的InDel引物對10份黃肉和10份白肉枇杷材料PCR擴增結(jié)果Figure 2 The PCR amplifications of 10 yellow-fleshed and 10 white-fleshed loquats with two new InDel primers.

2.3 InDel分子標記的驗證

為進一步驗證InDel分子標記對枇杷果肉顏色鑒定的準確性，我們繼續(xù)使用第二對InDel引物PSY2A-2對85份枇杷供試材料進行PCR擴增和基因分析。分型結(jié)果顯示所有43份白肉枇杷材料均為小片段純合帶型，表明所有白肉枇杷的基因型為純合EjPSY2Ad（圖3）。42份黃肉枇杷材料中，有3個黃肉枇杷選育品種（Y1艷紅、Y3大五星、Y39洛陽青）、2個雜交后代（Y19 CB5-2、Y20 CB10-14）、1個引進品種（Y30田中）、1個地方品種（Y36臺灣恒春）以及2份野生枇杷種質(zhì)資源（Y37橢圓枇杷和Y41大花枇杷）為大片段純合帶型，基因型為純合EjPSY2A；其余33份黃肉枇杷材料和雜交后代均為大片段和小片段的雜合帶型，同時具有EjPSY2Ad和EjPSY2A等位基因。驗證結(jié)果顯示小片段純合帶型材料的果實為白肉，而大片段純合帶型以及大片段與小片段雜合帶型材料的果實為黃肉，表明該InDel分子標記可以有效地把黃肉和白肉枇杷種質(zhì)資源和雜交后代區(qū)分開來，可用于枇杷果肉顏色的分子標記輔助育種。

圖3 InDel分子標記對43份白肉枇杷材料的分型結(jié)果Figure 3 The genotyping result of 43 white-fleshed loquats with InDel molecular marker

2.4 TA克隆驗證

為了驗證InDel引物擴增位點的正確性，我們使用TA克隆的方法對目的片段進行測序。白肉枇杷材料W3 TBW、W5新白8號和W11貴妃的單一擴增片段測序結(jié)果與EjPSY2A參考基因組序列相比，在EjPSY2A基因的2 296～2 989 bp處有694 bp的大片段缺失，為EjPSY2Ad等位基因（圖5）。黃肉枇杷品種Y1艷紅的單一擴增片段的測序結(jié)果與EjPSY2A參考基因組序列完全一致，為EjPSY2A等位基因。黃肉枇杷品種Y3大五星的單一擴增片段的測序結(jié)果顯示在2 296～2 989 bp處未發(fā)生694 bp的大片段缺失，但是在2 942～2 947 bp處有6個堿基的缺失（圖5）。黃肉枇杷材料Y8 TBY的目的片段有兩條，其中小片段的測序結(jié)果與白肉材料W3 TBW、W5新白8號和W11貴妃完全一致，有694 bp的大片段缺失，為EjPSY2Ad等位基因；而大片段的測序結(jié)果與參考基因組序列基本一致，無694 bp的大片段缺失，但是在2 800 bp處有一個T→C的SNP（圖5）。

3 討論和結(jié)論

果肉顏色是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中受到重點關(guān)注的一個農(nóng)藝性狀，也是園藝作物吸引消費者的重要基礎(chǔ)[15]。根據(jù)果肉顏色，枇杷可以分為黃肉和白肉品種兩種類型[1]。不同果肉顏色的枇杷品種在果皮厚度、耐儲運度、果肉口感以及產(chǎn)量等農(nóng)藝性狀上有一定的差異[2]。枇杷實生苗童期長達5年左右，傳統(tǒng)雜交育種方法篩選枇杷優(yōu)株的時間非常漫長，基于分子標記的輔助育種法可以極大地縮減枇杷的育種周期，加速品種改良進程，提高育種效率[16]。因此，開發(fā)與果肉顏色連鎖的分子標記有助于加速不同果肉顏色類型枇杷的育種速度。本研究基于枇杷類胡蘿卜素生物合成關(guān)鍵基因八氫番茄紅素合成酶基因（EjPSY2A）在黃肉和白肉品種間的序列差異，開發(fā)插入缺失（InDel）分子標記，并選擇全世界范圍內(nèi)具有代表性的枇杷種質(zhì)資源與雜交后代進行驗證。

八氫番茄紅素合成酶是類胡蘿卜素生物合成途徑中的關(guān)鍵限速酶，對植物類胡蘿卜素的合成和積累具有重要作用[8]。白肉品種‘白沙’和黃肉品種‘洛陽青’在EjPSY2A基因3’端有一段大片段的插入缺失（InDel）[8]。本試驗基于白肉品種‘白沙’和黃肉品種‘洛陽青’的序列差異開發(fā)2對InDel分子標記，經(jīng)初步篩選后選取分型結(jié)果清晰的引物PSY2A-2對該InDel分子標記的準確性進行驗證，并擴大驗證材料數(shù)量至85份國內(nèi)外枇杷種質(zhì)資源及雜交后代。結(jié)果顯示，所有43份白肉枇杷材料帶型為純合的小片段，而所有黃肉枇杷至少有一條大片段，其中33份黃肉枇杷帶型雜合帶型，另有9份黃肉枇杷材料的帶型為純合大片段。因此根據(jù)帶型可以將黃肉和白肉枇杷準確地區(qū)分開來。

Fu X.等[8]的研究結(jié)果顯示黃肉枇杷品種‘大五星’的EjPSY2A位點為雜合狀態(tài)，同時具有大片段的EjPSY2A等位基因和小片段的EjPSY2Ad等位基因。然而，本試驗中基因分型結(jié)果顯示‘大五星’枇杷在EjPSY2A基因位點處為純合狀態(tài)，僅有大片段的EjPSY2A等位基因（圖4）。為進一步驗證不同果肉顏色枇杷EjPSY2A位點擴增片段的正確性，我們通過TA克隆的方法證實了PSY2A-2引物擴增的位點確實是枇杷EjPSY2A基因，白肉枇杷材料為純合小片段，在3’端有一段694 bp的堿基缺失，為EjPSY2Ad等位基因；黃肉枇杷為純合大片段或者雜合帶型，至少有一個正常的EjPSY2A等位基因（圖5）。本試驗研究結(jié)果同時證實了枇杷果肉顏色性狀中黃肉相對白肉是顯性性狀，這與許家輝、鄒士成等[5-6]的結(jié)論一致。

圖4 InDel分子標記對42份黃肉枇杷材料的分型結(jié)果Figure 4 The genotyping result of 42 yellow-fleshed loquats with InDel molecular marker

綜上所述，本研究基于枇杷類胡蘿卜素生物合成關(guān)鍵基因EjPSY2A在黃肉和白肉枇杷品種間的序列差異，開發(fā)了一個InDel分子標記，可以準確地將黃肉和白肉枇杷種質(zhì)資源以及雜交后代區(qū)分開來，準確率達100%。該標記可以用于不同果肉顏色枇杷新品種選育，對指導(dǎo)枇杷雜交后代早齡選擇育種具有重要意義。