李蔣偉，周 力，馬博研，高占紅，姚有莉，王志有，侯生珍，桂林生

（青海大學(xué)農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016）

藏羊是青藏高原特有的綿羊品種，是牧區(qū)牧民的經(jīng)濟(jì)支柱；由于青藏高原海拔較高，地勢險峻，氣候比較寒冷且干旱少雨，太陽輻射比較強(qiáng)烈，枯草期較長，特殊的氣候環(huán)境對牧草生長形成阻礙，因此傳統(tǒng)的放牧飼養(yǎng)模式不能滿足日益增長的市場需求，藏羊由放牧飼養(yǎng)逐漸向舍飼過渡[1]。瘤胃作為反芻動物的重要消化站，不同動物品種、年齡及日糧結(jié)構(gòu)均會影響瘤胃微生物區(qū)系的建立和微生物發(fā)酵[2-3]；大量研究表明，NFC/NDF水平可對反芻動物瘤胃微生物區(qū)系產(chǎn)生較大影響[4]：李嵐捷[5]研究不同NFC/NDF水平飼糧對3—6月齡斷奶公犢牛瘤胃微生物多樣性的影響發(fā)現(xiàn)，雖然不同NFC/NDF水平飼糧對犢牛瘤胃微生物組成無顯著影響，但顯著影響了瘤胃微生物的種類和物種豐富度，也影響了屬水平下微生物的分布，繼而改變瘤胃發(fā)酵模式。普宣宣[6]研究飼糧NFC/NDF對卡拉庫爾羊營養(yǎng)物質(zhì)消化率和瘤胃菌群結(jié)構(gòu)的影響發(fā)現(xiàn)，當(dāng)NFC/NDF為1.37時營養(yǎng)物質(zhì)消化率最高，半纖維降解菌在屬水平上的豐度也達(dá)到最高；NFC/NDF為0.96時,會引起瘤胃菌群結(jié)構(gòu)變化，此時纖維降解菌屬水平上的相對豐度最高；淀粉降解菌在屬水平上的相對豐度在NFC/NDF為1.90時達(dá)到最高。

16S rDNA高通量測序技術(shù)通過測定不同菌種中序列的多樣性從而鑒定不同菌種的類別[7]。本試驗旨在探究育肥藏羊日糧適宜的NFC/NDF水平，通過測定藏羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)和微生物區(qū)系分布規(guī)律，分析不同NFC/NDF水平日糧對育肥藏羊瘤胃發(fā)酵模式和菌群定植的影響，為藏羊飼養(yǎng)模式轉(zhuǎn)變和飼糧的合理配制提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗時間和地點(diǎn)

2020年5月10日—9月6日，在青海省海北州高原現(xiàn)代畜牧示范園區(qū)進(jìn)行動物飼養(yǎng)試驗；2020年9月16日瘤胃樣品交由廣州賽哲生物科技股份有限公司進(jìn)行瘤胃微生物16S rDNA基因的測序工作。

1.2 試驗設(shè)計及飼養(yǎng)管理

選擇健康且體況相近的早期斷奶藏羊母羔共15只[(21.27±0.38)kg]，隨機(jī)分成 3組，每組 5只。3組羔羊分別飼喂NFC/NDF水平為2.20（Ⅰ組，精粗比70∶30）、1.39（Ⅱ組，精粗比50∶50）和0.92（Ⅲ組，精粗比30∶70）的日糧；根據(jù)育肥藏羊生長和營養(yǎng)需要，參考NY/T 816-2004中國肉羊飼養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)[8]進(jìn)行日糧配制。飼養(yǎng)試驗預(yù)飼期為10 d，正試期為90 d。精飼糧組成及營養(yǎng)水平如表1。試驗羔羊全舍飼分欄飼養(yǎng)，分別于每天9：00和17：00飼喂兩次，讓自由采食和飲水，中午清掃羊舍，每周對羊舍和運(yùn)動場地進(jìn)行消毒殺菌。試驗期對羔羊進(jìn)行常規(guī)疫苗的免疫注射和寄生蟲防治。

1.3 樣品采集和處理

飼養(yǎng)試驗結(jié)束后，每組中5只羔羊于清晨空腹屠宰在不同位點(diǎn)取瘤胃液于50 mL心管中，混勻、經(jīng)4層紗布過濾后將濾液進(jìn)行3 500 r/min離心15 min，投入液氮，并于實驗室-80℃冷凍保存。

1.4 瘤胃發(fā)酵參數(shù)測定

氨態(tài)氮（NH3-N）濃度：使用721型分光光度計在700 nm波長下比色測定[9]；pH：采用便攜性pH酸度計（CY-PH-60,北京恒奧德儀器儀表有限公司）測定；瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸（VFA），包括乙酸、丙酸、異丁酸、丁酸、異戊酸、戊酸及總揮發(fā)酸（TVFA），由西北高原生物研究所采用島津（GC-2014）氣相色譜儀測定，測定方法參照王加啟[10]關(guān)于氣相色譜測定羊瘤胃液中揮發(fā)性脂肪酸方法。

1.5 瘤胃液細(xì)菌分析方法

本試驗16S rDNA高通量測序部分交由廣州賽哲生物科技股份有限公司測定，對采集到的15個瘤胃液樣品基于Illumina HiSeq測序平臺，采用雙末端測序（Paired-End）的方法，構(gòu)建小片段文庫進(jìn)行測序，OTU聚類分析，物種注釋及豐度分析，使用DNA提取試劑盒（Invitrogen?，USA）提取瘤胃微生物基因組DNA，根據(jù)保守區(qū)設(shè)計得到引物，其中通用引物正向：5’-CCTACGGGNGGCWGCAG-3’，反向：3’-GGACTACHVGGGTATCTAAT-5’。在引物末端加上測序接頭，進(jìn)行PCR擴(kuò)增并對其產(chǎn)物進(jìn)行純化、定量和均一化形成測序文庫，建好的文庫先進(jìn)行文庫質(zhì)檢，質(zhì)檢合格的文庫進(jìn)行高通量測序，進(jìn)而得到原始圖像數(shù)據(jù)文件。其中Ⅱ組一個瘤胃液樣品測序質(zhì)量評估不合格，對其剔除。

1.6 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel整理初始數(shù)據(jù)，用SPSS 20.0中的One-way ANOVA進(jìn)行單因素方差分析，檢測結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤（Mean±SE）的形式表示。差異顯著的評斷標(biāo)準(zhǔn)為P<0.05。

2 結(jié)果與分析

2.1 飼糧精粗比對育肥藏羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

由表2可見，不同NFC/NDF水平下瘤胃pH處于5.7～6.6之間，當(dāng)NFC/NDF比值提高，pH顯著降低，瘤胃液氨態(tài)氮濃度有升高趨勢（P<0.05）。NFC/NDF比值可對瘤胃液揮發(fā)性脂肪酸造成顯著影響，其中丙酸、異丁酸占總揮酸含量的百分比以及總揮發(fā)酸含量與NFC/NDF比值呈正相關(guān)，乙酸百分比及乙酸丙酸比隨NFC/NDF比值增高而顯著降低（P<0.05）。

表2 不同NFC/NDF水平日糧對育肥藏羊瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響Table 2 Effect of different NFC/NDF levels on rumen fermentation parameters of fattening Tibetan Sheep

2.2 不同NFC/NDF水平下育肥藏羊瘤胃細(xì)菌OTU基礎(chǔ)分析

2.2.1 瘤胃微生物多樣性由Alpha多樣性分析

如表3所示，反映了羔羊瘤胃細(xì)菌群落豐富度和多樣性，并表現(xiàn)出一定的規(guī)律性。其中Shannon指數(shù)Ⅱ組和Ⅲ組顯著高于Ⅰ組（P<0.05），Simpson指數(shù)各組之間無顯著性差異（P>0.05），表明各組間群落多樣性相似；ACE指數(shù)和Chao l指數(shù)Ⅰ組顯著低于Ⅱ組和Ⅲ組（P<0.05），表明Ⅰ組群落豐富度較小。

表3 不同NFC/NDF水平日糧對育肥藏羊瘤胃微生物多樣性指數(shù)的影響Table 3 Effects of different NFC/NDF levels on rumen microbial diversity index of fattening Tibetan Sheep

2.2.2 測序數(shù)據(jù)質(zhì)量評估

在97%的物種相似度水平下，3組檢測樣本共得到347種OTU，其中有269種為3組共有OTU，占OTU總數(shù)的77.52%，獨(dú)有的OTU占OTU總數(shù)的比例較小，表明各組OTU組成差異很小，相似度較高。

2.3 不同NFC/NDF水平下育肥藏羊瘤胃細(xì)菌分類學(xué)分析

2.3.1 門水平下瘤胃細(xì)菌分布分析

經(jīng)序列對比發(fā)現(xiàn)本試驗中藏羊瘤胃存在4種主要菌門，對其相對豐度進(jìn)行顯著性分析如表4所示。瘤胃細(xì)菌的優(yōu)勢菌群是擬桿菌門（Bacteroidetes）和厚壁菌門（Firmicutes），相對豐度分別超過45%和29%；變形菌門（Proteobacteria）和軟壁菌門（Tenericutes）相對豐度較小，分別低于4%和2%。擬桿菌門（Bacteroidetes）Ⅱ組顯著高于其余兩組（P<0.05），厚壁菌門隨NFC/NDF降低而降低（P<0.05），變形菌門（Proteobacteria）和酸桿菌門（Acidobacteria）相對豐度差異不顯著（P>0.05）。

表4 門水平下細(xì)菌相對含量Table 4 Relative bacterial content at phylum level %

2.3.2 科水平下瘤胃細(xì)菌分布分析

經(jīng)序列對比發(fā)現(xiàn)本試驗中藏羊瘤胃主要存在12種主要菌科，對其相對豐度進(jìn)行顯著性分析如表5所示。毛螺菌科（Lachnospiraceae）Ⅰ組顯著高于Ⅱ組（P<0.05），相對豐度1.98%～11.19%；瘤胃菌科（Ruminococcaceae）相對豐度1.21%～12.61%，且Ⅰ組和Ⅱ組顯著高于Ⅲ組（P<0.05）；韋榮氏菌科（Veillonellaceae）相對豐度6.20%～22.92%，且Ⅱ組顯著高于Ⅰ組和Ⅲ組（P<0.05）。帕拉普氏菌科（Paraprevotellaceae）、克 里 斯 滕 森 菌 科（Christensenellaceae）、丹毒絲菌科（Erysipelotrichaceae）、普雷沃氏菌科（Prevotellaceae）和琥珀酸弧菌科（Succinivibrionaceae）等的相對豐度不受NFC/NDF水平影響（P>0.05）。

表5 科水平下細(xì)菌相對含量Table 5 Relative bacterial content at family level %

2.3.3 屬水平下瘤胃細(xì)菌分布分析

經(jīng)序列對比發(fā)現(xiàn)本試驗中藏羊瘤胃主要存在7種主要菌屬，對其相對豐度進(jìn)行顯著性分析如表6所示。普雷沃氏菌屬（Prevotella）的相對豐度較高（8%～11%），其余菌屬相對豐度均較?。?3%）。其中丁酸弧菌屬（Butyrivibrio）Ⅱ組顯著高于Ⅰ組和Ⅲ組（P<0.05）；瘤胃球菌屬（Ruminococcus）相對豐度有降低趨勢，且Ⅰ組和Ⅱ組顯著高于Ⅲ組（P<0.05）；普雷沃氏菌屬（Prevotella）、RFN20、月形單胞菌屬（Selenomonas）和解琥珀酸菌屬（Succiniclasti?cum）均不受NFC/NDF水平影響（P>0.05）。

表6 屬水平下細(xì)菌相對含量Table 6 Relative bacterial content at genus level %

2.4 不同NFC/NDF水平下育肥藏羊瘤胃細(xì)菌主成分分析

利用UniFrac PCA對不同NFC/NDF水平下育肥藏羊瘤胃細(xì)菌群落差異進(jìn)行研究，通過系統(tǒng)進(jìn)化距離來衡量樣品間的距離并顯示于二維或三維空間的PCA圖上（圖1）。基于UniFrac加權(quán)主坐標(biāo)分析其第一主成分和第二主成分貢獻(xiàn)率分別為63.93%和57.63%，各組間瘤胃液細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異明顯，Ⅰ組與Ⅱ組明顯分隔，Ⅲ組介于兩組之間。

圖1 瘤胃細(xì)菌主成分分析Figure 1 The PCA of rumen bacteria

3 討論及小結(jié)

3.1 不同NFC/NDF水平對瘤胃發(fā)酵參數(shù)的影響

瘤胃pH是瘤胃發(fā)酵水平及健康程度的最基本反映指標(biāo)。在本試驗研究中，隨著NFC/NDF水平的逐漸降低，瘤胃pH逐漸提高。K.A.Beauchemin等[11]將瘤胃pH是否低于5.8作為反芻動物亞急性酸中毒的發(fā)生閾值，當(dāng)NFC/NDF水平為2.20時，瘤胃pH低于5.8，Ⅰ組試驗羊可能處于亞急性酸中毒的狀態(tài)，這與魏德泳等[12]和胡紅蓮等[13]在山羊瘤胃發(fā)酵的研究結(jié)果相一致。瘤胃NH3-N濃度是飼糧氮源分解狀況的集中反映，也是微生物合成微生物蛋白的重要氮源。本試驗中，NH3-N濃度與NFC/NDF水平呈正相關(guān)，原因在于飼糧NFC的改變使微生物發(fā)酵所利用的有機(jī)物含量改變，從而改變氮的利用效率[14]。在本研究中，瘤胃揮發(fā)性脂肪酸濃度的變化趨勢與pH相對應(yīng)，當(dāng)NFC/NDF比值降低，瘤胃中乙酸、丙酸和TVFA的濃度明顯降低，瘤胃發(fā)酵模式有轉(zhuǎn)變趨勢，由乙酸發(fā)酵逐漸向丙酸發(fā)酵過渡，但乙酸所占總揮酸百分比仍然最大。大量研究表明瘤胃液中TVFA濃度過高易導(dǎo)致瘤胃亞急性酸中毒發(fā)生，從而導(dǎo)致pH的下降[15]；本研究結(jié)果印證了揮發(fā)酸濃度及發(fā)酵模式與瘤胃亞急性酸中毒的發(fā)生存在密切聯(lián)系。

3.2 不同NFC/NDF水平對瘤胃細(xì)菌多樣性的影響

瘤胃中匯集了數(shù)量龐大且功能各異的微生物群落，這些微生物的組成受環(huán)境、個體遺傳因素等的影響[16]，除此之外日糧結(jié)構(gòu)是影響微生物組成和群落分布的最重要人為可控因素，適宜的NFC/NDF水平可促進(jìn)瘤胃有益菌的定植，從而影響瘤胃養(yǎng)分消化和發(fā)酵[17]。已有研究結(jié)果表明，較高NFC水平的日糧使產(chǎn)酸菌增殖明顯，從而使反芻動物處于酸中毒狀態(tài)[18-19]，除此之外，李嵐捷等[5]研究發(fā)現(xiàn)，高NFC/NDF水平（1.35）較低NFC/NDF水平（0.80）瘤胃微生物多樣指數(shù)均顯著降低。本研究表明，飼喂NFC/NDF水平為2.20的育肥藏羊瘤胃細(xì)菌Shannon指數(shù)、ACE指數(shù)、Chao1指數(shù)和OTU數(shù)量均顯著低于NFC/NDF水平為1.39和0.92的試驗羊，說明高NFC/NDF水平（2.20）顯著降低了瘤胃微生物的多樣性分布。

3.3 瘤胃細(xì)菌分類學(xué)分析結(jié)果

厚壁菌門和擬桿菌門是反芻動物瘤胃細(xì)菌的重要組成部分，分別作用于飼糧中的纖維和淀粉類物質(zhì)，其優(yōu)勢地位因日糧中纖維和淀粉含量而改變[20-21]。本實驗結(jié)果與其相似，在門水平下，厚壁菌門和擬桿菌門的比例隨NFC/NDF水平變化而變化，當(dāng)NFC/NDF水平為1.39時瘤胃內(nèi)擬桿菌門相對豐度達(dá)到最高，說明在此種日糧飼喂下瘤胃內(nèi)擬桿菌門增殖達(dá)最佳水平；而擬桿菌門與非纖維類物質(zhì)分解密切相關(guān)，碳水化合物一般在反芻動物日糧中高達(dá)60%～70%，是微生物主要能量來源[22-24]，高碳水化合物比例可促進(jìn)擬桿菌門增殖，并將其發(fā)酵并降解成揮發(fā)性脂肪酸[25]。在NFC/NDF水平為2.20時擬桿菌門并未出現(xiàn)理論上的持續(xù)增加，結(jié)合其他菌門分布本試驗認(rèn)為在高NFC/NDF水平時，瘤胃酸桿菌門有增加趨勢，可能在瘤胃中發(fā)生亞急性酸中毒，變形菌門的增加也說明了瘤胃微生物的菌群失調(diào)和群落不穩(wěn)定[26]。本研究中厚壁菌門相對豐度隨NFC/NDF水平降低而降低，厚壁菌門是革蘭氏陰性菌，可將纖維類物質(zhì)降解為短鏈脂肪酸為反芻動物供能[27]，其在本試驗中的分布規(guī)律結(jié)合前人研究本實驗推測藏羊瘤胃發(fā)酵模式發(fā)生了改變。

丁酸弧菌屬一種可發(fā)酵淀粉、非纖維多糖以及單糖的多功能菌屬，并兼具淀粉酶和蛋白酶活性，影響部分揮發(fā)性脂肪酸的含量[28]；在本試驗中不同NFC/NDF水平下丁酸弧菌屬相對豐度較小，但相互差異顯著，說明其活性受NFC/NDF水平影響較大，并對瘤胃發(fā)酵模式的改變產(chǎn)生推動作用。普雷沃氏菌屬是擬桿菌門下重要的淀粉降解菌，可以利用非纖維性碳水化合物并降解蛋白；目前發(fā)現(xiàn)普雷沃氏菌屬不同菌株遺傳差異較大，而棲瘤胃普雷沃氏菌株發(fā)酵產(chǎn)物以乙酸、琥珀酸和丙酸為主，可產(chǎn)生木聚糖酶和羧甲基纖維素酶[29]。本研究發(fā)現(xiàn)不同NFC/NDF水平下瘤胃普雷沃氏菌屬相對豐度差異不顯著，但隨NFC/NDF水平降低而隨之降低，與前人多數(shù)研究結(jié)果保持一致。瘤胃球菌屬是厚壁菌門下降解纖維的常見優(yōu)勢菌屬，能產(chǎn)生大量的纖維素酶和半纖維素酶[30]。其中黃色瘤胃球菌能產(chǎn)生結(jié)構(gòu)復(fù)雜的木聚糖酶、多種內(nèi)切酶和一種外切酶，可將結(jié)構(gòu)復(fù)雜的纖維物質(zhì)降解成纖維二糖、戊糖和揮發(fā)性脂肪酸；白色瘤胃球菌可利用纖維二糖和葡萄糖，其發(fā)酵產(chǎn)物為琥珀酸、乙酸和甲酸，還有少量氫氣、乙醇和乳酸[31]；在本試驗中瘤胃球菌屬豐度與NFC/NDF水平呈正相關(guān)，受日糧纖維水平影響顯著，與理論結(jié)果相一致。本研究還發(fā)現(xiàn)CF231菌屬豐度也受NFC/NDF水平影響，并差異顯著，但其功能及在瘤胃發(fā)酵中扮演角色尚未可知，待進(jìn)一步研究挖掘。

綜上，在本試驗條件下，隨著NFC/NDF水平降低，瘤胃發(fā)酵模式由乙酸發(fā)酵逐漸向丙酸發(fā)酵過渡，高NFC/NDF水平飼糧（2.20）飼養(yǎng)下的藏羊瘤胃細(xì)菌的種類和豐富度明顯降低，不同NFC/NDF水平對門水平下優(yōu)勢菌群相對豐度有顯著影響；在屬水平下優(yōu)勢菌群為普雷沃氏菌屬，丁酸弧菌屬和瘤胃球菌屬受NFC/NDF水平影響差異顯著。