晏俊玲，樊 揚，秦 川，歐 雪，周 芮，謝 瑋，陳姝娟，敖曉琳

（四川農業(yè)大學食品學院，四川 雅安 625014）

苦筍，別稱涼筍，禾本科苦竹（Pleioblastus ama?rus）的嫩芽，在我國分布廣泛，資源豐富，是一種傳統綠色蔬菜食品[1]?？喙S中富含多種生物活性物質，主要包括黃酮類、生物堿和揮發(fā)油類等，具有抗炎抗氧化、抑菌抗腫瘤、增強免疫調節(jié)活性、抑制酪氨酸酶和α-淀粉酶活性等功能[2-4]。目前，人們對于苦筍的研究主要集中于初加工，而對于苦筍資源的精細加工及利用鮮有報道，而黃酮作為植物中重要的次級代謝產物，具有多種功能活性，如抗氧化、抗腫瘤、抗病毒及抗細菌感染以及提高機體免疫力等功能[5]，具有較高的研究價值。天然植物中黃酮類化合物的提取方法包括酶法輔助、微波輔助、超聲波輔助和回流提取法等。其中超聲波輔助提取法具有耗時短、提取率高等優(yōu)點，應用廣泛。杜麗霞等[6]采用超聲輔助提取調味香料排草中總黃酮，其得率可達到3.16%。但目前關于超聲波輔助提取苦筍總黃酮的工藝研究還未見報道。另外不同種類的總黃酮提取物，因黃酮含量和組分的差異，其活性也不同。要進一步對苦筍總黃酮進行開發(fā)利用，苦筍總黃酮提取物的活性研究顯得尤為重要。但目前有關苦筍總黃酮提取物活性的研究也還未見報道。因此本研究以苦筍作為試驗原料，采用超聲波輔助提取法，優(yōu)化提取工藝，并探討其抗炎抗氧化活性，為苦筍資源的綜合開發(fā)應用提供理論數據參考。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

苦筍采自四川省雅安市，新鮮苦筍干燥粉碎后過60目篩；蘆丁標準品(純度≥98%)購自北京世紀奧科生物科技有限公司；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）；ABTS溶液；氫氧化鈉；無水乙醇；亞硝酸鈉等均為國產分析純，購自成都市科隆化學品有限公司。

1.2 儀器與設備

Varioskan LUX酶標儀，賽默飛世爾科技有限公司；S28L超聲波清洗器，東莞市墨潔超聲波設備有限公司；FA2004B電子天平，上海精天電子儀器有限公司。

1.3 苦筍總黃酮提取方法的選擇

水提取法條件：苦筍粉20 g，料液比1∶30 g/mL，提取時間30 min，提取溫度40℃；

乙醇提取法條件：苦筍粉20g，料液比1∶30g/mL，提取時間30 min，提取溫度40℃，體積分數80%乙醇作為提取劑；

乙醇超聲提取條件：苦筍粉20 g，料液比1∶30 g/mL，超聲時間30 min，提取溫度40℃，超聲功率300 W，提取劑為體積分數80%乙醇。

分別按照上述方法提取兩次，過濾后合并兩次濾液定容至一定體積，即得到不同提取方法的苦筍總黃酮樣液，待測其提取率，重復3次。經試驗選取超聲輔助提取作為后續(xù)提取方法。

1.4 標準曲線的制作及總黃酮含量測定

參照吳昊等[7]的方法并稍作修改。精確稱取蘆丁標準品20.00 mg于20 mL的容量瓶中，并用體積分數60%的乙醇溶解，得到1 mg/mL的蘆丁溶液。準確移去蘆丁溶液0、1、2、3、4和5 mL于10 mL容量瓶中，定容揺勻靜置15 min后在510 nm處測定吸光度，以蘆丁濃度（mg/mL）為橫坐標，吸光度值（y）為縱坐標繪制標準曲線：y=4.845 2x-0.003 3，R2=0.999 8，根據標準曲線計算出總黃酮濃度。以乙醇作為空白，按公式（1）計算苦筍中總黃酮提取率。

1.5 提取工藝優(yōu)化

1.5.1 單因素實驗

按一定料液比稱取苦筍粉末，與乙醇溶液混合后置于超聲波清洗器中以一定功率提取一定時間后過濾備用，按照1.4測定其總黃酮提取率。設定料液比（質量體積比g/mL）為1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35和1∶40，超聲時間10、20、30、40、50和60 min，乙醇體積分數40%、50%、60%、70%、80%和90%，超聲溫度30、40、50、60、70和80℃，超聲波功率50、100、150、200、250和300 W，提取溶液pH值為2、4、6、8和10。每改變一個因素水平，其他因素固定不變。

1.5.2 響應面試驗設計

基于單因素實驗，固定溶液pH值為6.0、超聲功率200 W，以料液比(A)、乙醇體積分數(B)、提取時間(C)、提取溫度（D）為考察因素，總黃酮含量為試驗的響應值Y，進行響應面試驗，利用Design Expert 8.0.6軟件優(yōu)化提取工藝，確定苦筍中總黃酮最優(yōu)提取工藝條件，試驗設計因素見表1。

表1 響應面實驗設計Table 1 Response surface experimental design

1.6 苦筍總黃酮體外抗氧化

1.6.1 FRAP試驗測定苦筍總黃酮抗氧化能力

參照Du B.等[8]的方法，并稍作修改。將醋酸緩沖 液（pH=3.6，300 mmol/L）、FeCl3（20 mmol/L）、TPTZ（10 mmol/L）按體積比例 10∶1∶1混合配制FRAP工作液。取不同濃度（0.1～0.5 mg/mL）的總黃酮提取液80 μL，加入FRAP 120 μL后混勻，置于37℃水浴鍋中30 min，于593 nm下測定吸光值，抗壞血酸為陽性對照，蒸餾水為空白，0.5～5 mmol/L硫酸亞鐵為標準，建立了不同硫酸亞鐵濃度的標準曲線。標準曲線為y=0.080 2x-0.495 7，R2=0.999 3。樣品的抗氧化活性以亞鐵當量（FRAP，mmol/L）表示。

1.6.2 苦筍總黃酮對DPPH自由基清除能力的測定

參照高喜霞等[9-10]的方法。取不同濃度的苦筍總 黃 酮 提 取 液 90 μL（0.1～0.5 mg/mL），加 入0.4 mmoL/L DPPH溶液110 μL，混勻，于室溫下避光反應30 min，在517 nm處測定吸光度，記為A1。其他條件和操作不變，用乙醇溶液代替苦筍總黃酮提取液測得的吸光值記為A2。按照公式（3）計算清除率。以樣品濃度為自變量，自由基清除率為因變量作圖并進行線性擬合，計算IC50值，IC50（半抑制濃度）為自由基清除率為50%時，所需抗氧化物質的質量濃度，其值越小，表明清除自由基的能力越強，抗氧化能力越強[11]。

1.6.3 苦筍總黃酮對羥基自由基清除能力的測定

采用張靜祎等[12]方法并稍作修改。分別吸取0.5 mL 8 mmol/L水楊酸-乙醇溶液、0.5 mL 8 mmol/L硫酸亞鐵、不同濃度（0.1～0.5 mg/mL）的苦筍總黃酮提物液1 mL充分混勻均勻，加入0.5mL 30% H2O2溶液充分反應，混勻后靜置10 min后，在510 nm處測定吸光度為A1；1 mL蒸餾水取代樣品，測定其吸光度A0；0.5 mL蒸餾水取代FeSO4溶液，測定其吸光度A2。不同質量濃度的VC（0.1～0.5 mg/mL）作陽性對照。按公式(4)計算清除率，并計算IC50值。

1.6.4 苦筍總黃酮對ABTS+自由基清除能力的測定

2.45mmol/L過硫酸鉀溶液與7 mmol/L ABTS溶液，按1∶1比例混合，室溫避光靜置反應16 h，無水乙醇稀釋ABTS儲備液使其在734 nm處的吸光值為0.7±0.05，作為ABTS工作液。取1 mL樣品和6 mL ABTS工作溶液，室溫條件下充分混合反應6 min，于734 nm波長下測吸光度，記為A1。1 mL蒸餾水代替樣品溶液測得的吸光值為A0，6 mL蒸餾水代替ABTS工作液，其吸光值記為A2。VC作陽性對照。按公式（5）計算清除率，并計算IC50值。

1.7 苦竹筍總黃酮體外抗炎

10%胎牛血清和1%青霉素鏈霉素的培養(yǎng)基，在適宜濕度，溫度為37℃，體積分數5% CO2的條件下培養(yǎng)RAW264.7細胞。采用Griess法[13]檢測苦筍總黃酮提取物對RAW264.7細胞產生NO的抑制作用，將1×104個/孔RAW264.7細胞接種于細胞96孔板中，每孔體積為100 μL，接種孔周圍加入新鮮培養(yǎng)基用來排除邊緣效應，待細胞貼壁后棄去多余培養(yǎng)基，并進行藥物處理。試驗分為：空白對照組（不含有LPS和樣品）；模型組（LPS組，含有0.5 μg/mL LPS）；試驗組（總黃酮濃度分別為0.20、0.40、0.60、0.80、1.00和1.20 mg/mL）。分別預處理2 h后，模型組和試驗組中加入0.5 μg/mL LPS 0.5 μL處理18 h，再吸取50 μL細胞培養(yǎng)上清液，依次加入恢復室溫后的 Griess ResgentⅠ50 μL 和 Griess ResgentⅡ50 μL，充分反應后于550 nm處檢測吸光度。按照公式（6）計算NO產生抑制率。

1.8 數據分析

采用SPSS 18.0軟件對試驗數據進行處理，Origin 8.5制圖，所以實驗均平行進行3次，結果以均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 苦筍總黃酮提取方法的選擇

按照1.3的試驗方法，分別測得3種提取方式的總黃酮提取率，其結果見表2。

表2 不同提取方法的苦筍總黃酮提取率Table2 The extraction rate of total flavonoids from the shoots of pleioblastus amarus by different extraction methods

從表2可以看出，以總黃酮提取率為考察指標，乙醇超聲提取法較水提取法和乙醇提取法提取效果更佳，故本試驗采用乙醇超聲輔助提取法，并對提取時間、乙醇體積分數、提取時間以及提取溫度等因素進一步考察。

2.2 單因素實驗結果

2.2.1 料液比對苦筍總黃酮提取率的影響

從圖1-A可以看出，料液比在1∶25 g/mL時黃酮提取率達到最大，在1∶15到1∶25 g/mL時呈現上升趨勢，苦筍總黃酮提取率隨溶劑體積的增加而增大，可能是因溶劑用量太少，提取不完全；超過1∶25 g/mL時，總黃酮提取率反而降低，可能是由于溶劑用量過大，超聲波加熱的負荷增大，達到提取完全的時間隨之增加，結果在限定時間內苦筍總黃酮提取率反而下降[14]。因此選擇最佳料液比為1∶25 g/mL。

2.2.2 超聲時間對苦筍總黃酮提取率的影響

由圖1-B可知，最佳超聲時間為30 min，此時總黃酮提取率最高，可達到9.50%左右，當超聲時間進一步延長時，總黃酮提取率反而呈現下降趨勢，這可能是因為超聲處理可以顯著增強苦筍粉內部的分子震動碰撞，加速與提取劑之間的物質交換，當物質交換作用達到平衡時，總黃酮含量趨于穩(wěn)定，隨著提取時間的進一步延長其他醇溶性物質增多，黃酮的穩(wěn)定性也可能受到破壞，所以導致總黃酮提取率降低[15]。因此綜合考慮提取成本和提取量，選擇30 min為最優(yōu)提取時間。

2.2.3 提取溫度對苦筍總黃酮提取率的影響

圖1-C顯示的是提取溫度對總黃酮提取率的影響。結果表明，提取溫度為60℃時提取率最高，在30～60℃時溫度升高，提取率隨之增大，可能是因為隨著溫度升高，分子運動加劇，增加溶解度[16]。超過60℃，隨著溫度的升高，苦筍中總黃酮提取率反而降低，且乙醇在高溫下容易揮發(fā)，不易于乙醇的回收，另外，在高溫條件下，黃酮類化合物的結構可能發(fā)生變化[17]。

2.2.4 乙醇體積分數對苦筍總黃酮提取率的影響

由圖1-D可知，在乙醇體積分數為40%～80%時，乙醇體積分數不斷增大，苦筍總黃酮的提取率也逐漸增大，但當乙醇體積分數大于80%時，苦筍中總黃酮的提取率降低，這與周偉等學者的研究結果相似[15]?？赡苁且驗槿軇┑臉O性隨乙醇體積分數的增大而降低，不利于有極性的黃酮類化合物的溶出，從而造成總黃酮提取率下降。因此，體積分數80%乙醇為最佳提取劑。

2.2.5 提取溶液pH值對苦筍總黃酮提取率的影響

由圖1-E可知，當提取溶液pH在2～4時，苦筍總黃酮提取率隨pH升高而增大。但當pH大于6時，苦筍中總黃酮的提取率降低，在pH 6時，苦筍總黃酮的提取率最大。這可能是由于黃酮類化合物苯環(huán)結構中含有酚羥基，顯弱酸性，因此在弱酸環(huán)境中比較穩(wěn)定。因此選擇pH=6為最佳提取液pH值。

圖1 液料比（A）、提取時間（B）、提取溫度（C）、乙醇體積分數（D）、提取溶液pH值（E）和超聲功率（F）對總黃酮提取率的影響Figure 1 Effects of liquid/solid ratio(A)，extraction time(B)，extraction temperature(C)，ethanol concentration(D)，pH value(E)and ultrasonic power(F)on total flavonoids yield

2.2.6 超聲功率對苦筍總黃酮提取率的影響

苦筍總黃酮提取率隨超聲功率的增加而逐漸增加，200 W時黃酮含量達到最大，但超過200 W其總黃酮含量反而下降。這可能是由于超聲對植物細胞有很好的破碎功能，并促進分子之間的熱運動，隨著功率的增加，加大苦筍細胞的破碎程度，加速苦筍粉與提取劑之間的運動，但是當超聲功率過大時，又會造成總黃酮的分解或氧化，黃酮類物質穩(wěn)定性降低，從而造成提取率下降[18]。因此最適的超聲功率為200 W。

2.3 響應面模型擬合與方差分析

2.3.1 響應面試驗

響應面試驗方案與結果見表3。

對表3的數據作回歸分析，得到回歸擬合方程：Y=10.01+1.07A+0.41B+0.09C+0.30D+0.18AB-0.43AC-0.02AD-0.02BC-0.32BD+0.13CD-0.67A2-0.72B2-0.10C2-0.50D2，其試驗響應面模型方差分析結果見表4。從表4看出，P<0.01，模型F值=7.55，表明該模型極顯著；模型的相關系數R2=0.883 1，校正決定系R2Adj=0.766 2，二者較為接近，說明模型實際值與預測值擬合良好；本試驗中建立的回歸模型準確失擬項F=3.09（P>0.05），說明失擬項誤差不顯著，表明該回歸模型的擬合情況較好，回歸方程代表性較好，能準確預測實際情況，使用該方程代替真實的試驗點進行分析是可行的[19]。方差分析表明，各因素對苦筍總黃酮提取率的影響為：A料液比>B乙醇體積分數>D提取溫度>C提取時間。兩兩因素交互作用的主次順序為：AC>BD>AB>CD>AD>BC。

表3 Box-Behnken試驗設計及結果Table 3 Response surface design arrangement and experimental result

表4 擬合二次多項式模型的方差分析Table 4 ANOVA for the fitted quadratic polynomialmodel

Design-Expert軟件進行數據處理，料液比、提取時間、提取溫度和乙醇體積分數兩兩因素之間對于苦筍總黃酮提取率的3D圖見圖2A-F。在兩因素交互作用3D圖中，圖形的坡度越陡，表明響應指標對響應因素的變化越敏感[19]。比較6組三維曲面響應圖可知，料液比(A)與乙醇體積分數(B)、乙醇體積分數(B)與提取溫度(D)、提取料液比(A)與提取時間(C)、提取料液比(A)與提取溫度(D)的響應曲面圖呈現開口向下的陡峭凸曲面，表明各交互因素的響應面存在最高點，極值存在于所選的范圍之間，各因素考察范圍較為適當；響應面為一個卷曲的曲面，說明因素與響應值之間不能以簡單的一元線性方程加以闡述，故上述回歸方程能夠全面地闡明料液比、提取時間、提取溫度和乙醇體積分數與總黃酮提取率之間的關系[20]。Design-Expert軟件系統給出最佳參考工藝為：料液比1∶29.85 g/mL，提取溫度51.14℃，提取時間23.11 min，乙醇體積分數86.96%。在此條件下預測的苦筍總黃酮提取率為10.72%。

圖2 兩兩交互對總黃酮提取率的響應面圖Figure 2 Response surface diagram of pairwise interaction on total flavonoids yield

2.3.2 驗證試驗

為檢驗模型預測的準確性，采用上述最佳條件進行3次平行試驗，考慮到實際操作便捷，將提取工藝條件調整為料液比1∶30 g/mL、提取溫度51℃、提取時間23 min、提取液pH值為6、超聲功率200 W、乙醇體積分數87%，在此條件下進行驗證試驗，得到苦筍總黃酮提取率為10.61%，ASD為0.45%，與預測結果較為接近，該模型擬合效果較好，此法是有效可行的。

2.4 苦筍總黃酮體外抗氧化活性研究

抗氧化活性的測定取決于反應機理，需結合多種測試方法才能準確評估樣品的抗氧化能力[22]。在本研究中，采用FRAP還原鐵能力，清除DPPH自由基、羥基自由基和ABTS自由基的方法進行抗氧化活性測定。

2.4.1 FRAP還原鐵能力測定

還原能力是衡量抗氧化能力的重要指標，兩者之間成正相關[21-22]。因此，可通過測定苦筍總黃酮的還原能力來評價其抗氧化活性。不同濃度苦筍總黃酮提取物的還原力如圖3-A所示。由圖可知，樣品濃度增加，其FRAP值均有提高。在同等濃度下，苦筍總黃酮提取液的還原能力與VC相比，相差不大。從整體來看，苦筍總黃酮具有較強的還原能力，當其濃度為0.5 mg/mL時，FRAP值達3.04 mmol/L。

2.4.2 清除DPPH自由基能力的測定

DPPH清除率與抗氧化能力呈正相關。由圖3-B可知，總黃酮濃度越大，其清除能力越強，與VC的差距也逐漸縮小，總黃酮濃度為0.5 mg/mL時，DPPH清除率達到88.73%。與蔓三七葉黃酮相比[23]，苦筍總黃酮對DPPH的清除率較強?？喙S總黃酮和VC的IC50分別為0.07、0.04 mg/mL，而IC50值越小，其抗氧化能力越強[24]。由此可知，苦筍總黃酮提取物具有較好清除DPPH自由基的能力。

2.4.3 清除羥基自由基能力的測定

Fe2+與H2O2反應可生成羥基自由基，羥基自由基進攻較高電子云密度的乙烯基基團使結晶紫發(fā)生褪色，而抗氧化劑的加入能夠清除羥基自由基，從而達到提高清除率的效果[12]。由圖3-C可知，清除羥基自由基的能力隨樣品濃度的增大而增強，VC清除羥基自由基的能力稍強于苦筍總黃酮提取液，苦筍總黃酮濃度達到0.5 mg/mL時，其清除率可達到60.22%。VC和苦筍總黃酮對羥基自由基清除率的IC50分別為0.23、0.39 mg/mL，兩者相差不大?？梢娍喙S總黃酮有一定清除羥基自由基的能力。

2.4.4 清除ABTS自由基能力的測定

VC和苦筍總黃酮對ABTS自由基清除能力結果見圖3-D。由圖可知，在一定范圍內，隨著濃度的增加苦筍總黃酮樣品和VC樣品對ABTS自由基清除率均逐漸增強，說明濃度對ABTS自由基的清除能力存在著一定的量效關系，苦筍總黃酮濃度達到0.5 mg/mL時，其清除率可達到72.38%，其IC50值為0.27 mg/mL，可見苦筍總黃酮有一定的ABTS自由基抑制能力。

圖3 苦筍總黃酮提取物的抗氧化活性Figure 3 Antioxidant of flavonoid from the shoots of Pleioblastus amarus

2.5 苦筍總黃酮體外抗炎活性研究

NO參與多種炎癥信號轉導，與多種炎癥因子相互作用，在炎癥反應進程每一階段都有產生，NO的過量產生與炎癥密切相關，而抑制NO生成則是抗炎活性的直接指標[25]。苦筍總黃酮樣品的NO產生抑制率結果如圖4所示。由圖可知，NO抑制率隨著苦筍總黃酮濃度的升高而增大，當苦筍總黃酮濃度為1.20 mg/mL時，NO產生抑制率可達到93.94%，說明在此濃度下苦筍總黃酮提取液可較好地抑制LPS誘導小鼠腹腔巨噬細胞中NO的產生，同時可推測苦筍總黃酮提取物的抗炎活性，與其黃酮類化合物密切相關，苦筍中黃酮類物質也可能為良好的抗炎活性提高一定的輔助作用。

圖4 苦筍總黃酮對LPS誘導的小鼠巨噬細胞NO生成量的影響Figure 4 Effect of total flavone on NO production in LPS-induced mouse macrophages

3 結論

本試驗采用超聲波輔助提取苦筍總黃酮的方法，在單因素實驗的基礎上運用Box-Behenken試驗設計，得到苦筍總黃酮的最佳提取工藝條件為：料液比1∶30（g/mL），提取溫度51 ℃，提取時間23 min，乙醇體積分數87%，在此條件下進行驗證試驗，得到苦筍總黃酮提取率為10.61%，ASD為0.45%。另外苦筍總黃酮顯示出良好的抗氧化活性及抗炎活性，當苦筍總黃酮濃度為0.5 mg/mL時，FRAP值達到3.04 mmol/L，對DPPH自由基、羥基自由基、ABTS自由基的清除率分別為88.73%、60.22%和72.38%，其IC50值分別為0.07、0.39和0.23 mg/mL；苦筍總黃酮濃度為1.20 mg/mL時，NO產生抑制率可達到93.94%。該試驗結果表明，苦筍總黃酮的提取工藝有效可靠，并且苦筍總黃酮提取物具有較強的體外抗氧化活性和抗炎活性，具有較好的現實意義和開發(fā)利用價值。本試驗結果將為苦筍資源的深度開發(fā)利用提供理論參考。

表5 ABTS、·OH、DPPH自由基抗氧化試驗的IC50值Table 5 IC50value of the ABTS，·OH and DPPH assay mg·mL-1