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1,6-二磷酸果糖口服液對急性心肌梗死大鼠心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和能量代謝的影響及可能機(jī)制研究

2022-05-11 06:45王青偉李悅劉強(qiáng)劉業(yè)發(fā)夏昆丁榮晶
實(shí)用心腦肺血管病雜志 2022年5期
關(guān)鍵詞:口服液心肌細(xì)胞纖維化

王青偉,李悅,劉強(qiáng),3,劉業(yè)發(fā),夏昆,4,丁榮晶

流行病學(xué)數(shù)據(jù)顯示,近年來我國急性心肌梗死(acute myocardial infarction,AMI)患病率呈上升趨勢[1],隨著急診再灌注治療技術(shù)的推廣,AMI急性期患者死亡率降低,但5年后心力衰竭發(fā)生風(fēng)險仍高達(dá)15%~30%[2]?,F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明,心肌梗死后心肌缺血缺氧導(dǎo)致心肌細(xì)胞代謝異常,發(fā)生細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和炎癥,引起心肌細(xì)胞壞死和纖維化,進(jìn)而導(dǎo)致左心室重構(gòu),而左心室重構(gòu)是心肌梗死后心力衰竭的主要原因[3-4]。目前,控制左心室重構(gòu)的藥物主要針對心肌纖維化,包括β-受體阻滯劑和腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)抑制劑。但也有研究發(fā)現(xiàn),調(diào)節(jié)心肌能量代謝類藥物可減輕心肌缺血缺氧[5-6]。1,6-二磷酸果糖(fructose-1,6-diphosphate,F(xiàn)DP)注射液在臨床應(yīng)用多年,大量研究證實(shí)其可以減輕缺血缺氧導(dǎo)致的心肌損傷[7-8],但FDP口服液是否具有上述作用尚未知。本研究旨在探究FDP口服液對AMI大鼠心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激和能量代謝的影響及可能機(jī)制,以期為FDP口服液用于AMI后心肌保護(hù)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗動物 本實(shí)驗時間為2020年12月—2021年6月。選取SPF級雄性SD大鼠20只,體質(zhì)量200~220 g,20日齡,購于北京維通利華公司實(shí)驗動物中心,動物許可證號:SCXK(京)2019-0010。

1.2 主要實(shí)驗儀器與試劑

1.2.1 主要實(shí)驗儀器 BL-420S型小動物生物功能實(shí)驗系統(tǒng)、HX-100E型小動物呼吸機(jī)購自成都泰盟科技有限公司,石蠟切片機(jī)購自德國Leica,鼓風(fēng)干燥箱(DHG-9055A)、電熱恒溫水浴槽購自上海一恒科學(xué)儀器有限公司,光學(xué)顯微鏡(Olympus,BX53)購自北京普瑞賽司儀器有限公司,超凈工作臺購自北京昌平長城空氣凈化設(shè)備工程公司,熒光酶標(biāo)儀購自美國Thermo Scientific,微量加樣器購自法國Gilson,脫色搖床購自海門市其林貝爾儀器制造公司,電泳儀購自北京百晶生物技術(shù)有限公司,低溫離心機(jī)購自德國Sigma,SDSPAGE電泳系統(tǒng)、ChemiDoc MP化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自美國Bio-rad,凝膠成像系統(tǒng)購自美國UVP。

1.2.2 主要實(shí)驗試劑 FDP口服液購自北京華靳制藥有限公司,HE染色試劑盒、Masson三色染色試劑盒、TUNEL凋亡檢測試劑盒和DAB顯色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司,蛋白提取液、蛋白酶抑制劑、BCA蛋白濃度測定試劑盒、SDS-PAGE預(yù)制膠套裝試劑盒及二抗購自北京MDL,中等蛋白分子量marker購自北京Thermo,磷脂酰肌醇-3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase,PI3K)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-AKT)、β-actin抗體購自北京Bioss,聚偏氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜(0.22 μm)購自美國Millipore,3MM 濾紙購自美國Whatman,ATP、丙二醛(malondialdehyde,MDA)及超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)含量試劑盒購自南京建成生物工程研究所。

1.3 模型制備及分組 將大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,根據(jù)CURAJ等[9]方法構(gòu)建AMI模型:腹腔注射2%戊巴比妥鈉(3 ml/kg)麻醉大鼠,經(jīng)口氣管插管并連接動物呼吸機(jī)輔助呼吸,在大鼠左側(cè)胸壁第3~4肋間處備皮、開胸,暴露心臟,于左心耳根部下方2~3 mm處用6-0縫合線結(jié)扎左前降支。結(jié)扎后左心室前壁及心尖部變白,心電圖提示ST段抬高,即AMI造模成功。術(shù)畢,形成胸腔負(fù)壓,逐層關(guān)閉胸腔后肌肉注射2.5×104U青霉素以預(yù)防感染。將建模成功后存活24 h的12只大鼠隨機(jī)分成模型組、FDP組,每組6只,術(shù)后第3天開始給藥,其中FDP組予以FDP口服液1 ml灌胃,模型組予以等量0.9%氯化鈉溶液灌胃,連續(xù)給藥21 d。

1.4 觀察指標(biāo)及檢測方法

1.4.1 HE染色檢測心肌組織形態(tài)學(xué)特征 連續(xù)給藥21 d后處死大鼠,在心臟梗死區(qū)的相同截面處切取心肌組織,并置于4%多聚甲醛中固定,PBS沖洗,梯度乙醇脫水,二甲苯透明,石蠟包埋,制成5 μm大小的石蠟切片。烘烤、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后,按常規(guī)方法進(jìn)行HE染色,光鏡下觀察心肌組織形態(tài)學(xué)特征。

1.4.2 Masson染色檢測心肌組織纖維化程度及心肌膠原面積 取石蠟切片,烘烤、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后,按照Masson染色試劑盒操作說明書進(jìn)行處理,光鏡下心肌纖維呈紅色、膠原纖維呈藍(lán)色,采用Image-Pro Plus 6.0軟件進(jìn)行圖像分析。計算心肌膠原面積,心肌膠原面積(%)=膠原纖維面積/(膠原纖維面積+心肌纖維面積)×100%。

1.4.3 TUNEL染色檢測心肌細(xì)胞凋亡率 取石蠟切片,烘烤、二甲苯脫蠟、梯度乙醇脫水后,按照TUNEL染色試劑盒操作說明書進(jìn)行處理,其中綠色熒光細(xì)胞核為凋亡的心肌細(xì)胞,由4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI)染的藍(lán)色細(xì)胞核為總細(xì)胞,計算心肌細(xì)胞凋亡率,心肌細(xì)胞凋亡率=凋亡的心肌細(xì)胞數(shù)量/總心肌細(xì)胞數(shù)量×100%。

1.4.4 比色法檢測心肌組織中ATP、SOD、MDA含量取左心室心肌組織并稱重,按比例加入0.9%氯化鈉溶液制成10%勻漿液,3 000 r/min離心10 min(離心半徑16 cm),取上清液,按照試劑盒說明書,采用磷鉬酸比色法檢測ATP含量,采用黃嘌呤氧化酶比色法檢測SOD含量,采用硫代巴比妥酸比色法檢測MDA含量。

1.4.5 Western blotting法檢測心肌組織中PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平 提取心肌組織蛋白,采用BCA蛋白定量法測定蛋白濃度,蛋白定量為5 mg/ml,加蛋白上樣Buffer,進(jìn)行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后,將凝膠上分離到的蛋白條帶通過轉(zhuǎn)移電泳方式轉(zhuǎn)移至PVDF膜。隨后將轉(zhuǎn)移好的膜(參考目的條帶分子量大?。φ誱arker進(jìn)行裁剪,封閉后在4 ℃環(huán)境下孵育相應(yīng)的一抗(PI3K 1∶1 000;p-AKT 1∶2 000;β-actin 1∶1 000)過夜,隨后在室溫下孵育兔二抗2 h,最后進(jìn)行顯色和成像。以β-actin作為內(nèi)參,采用Image J軟件分析條帶灰度值,即目標(biāo)蛋白表達(dá)水平。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 24.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布且方差齊的計量資料以(±s)表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗;不符合正態(tài)分布或方差不齊的計量資料以M(QR)表示,組間比較采用非參數(shù)檢驗。以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌組織形態(tài)學(xué)特征 HE染色結(jié)果顯示,模型組大鼠心肌纖維排列紊亂,體積增大,間隙變寬;FDP組大鼠大部分心肌纖維排列較為整齊,間隙較為清晰,保持了心肌組織相對正常的結(jié)構(gòu)和形態(tài),見圖1。

圖1 HE染色檢測模型組和FDP組心肌組織形態(tài)學(xué)特征(×100)Figure 1 Morphological characteristics of myocardium detected by HE staining in model group and FDP group

2.2 心肌組織纖維化程度、心肌膠原面積 光鏡下,模型組大鼠心肌組織纖維化明顯,可見島狀存活的心肌細(xì)胞;FDP組大鼠心肌梗死程度明顯減輕,存活的心肌細(xì)胞增多,且與模型組大鼠相比,其心肌組織纖維化面積明顯縮小,見圖2。FDP組大鼠心肌膠原面積為(8.35±3.11)%,低于模型組的(24.97±11.30)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=3.473,P<0.01)。

圖2 Masson染色檢測模型組和FDP組心肌組織纖維化程度(×100)Figure 2 Degree of myocardial fibrosis detected by Masson staining in model group and FDP group

2.3 心肌細(xì)胞凋亡率 FDP組心肌細(xì)胞凋亡率為(16.39±5.31)%,低于模型組的(35.68±8.34)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(t=4.778,P<0.01),見圖3。

圖3 TUNEL染色檢測模型組和FDP組心肌細(xì)胞凋亡率(×100)Figure 3 Apoptosis rate of cardiomyocyte detected by TUNEL staining in model group and FDP group

2.4 心肌組織中ATP、SOD、MDA含量 FDP組大鼠心肌組織中ATP、SOD含量高于模型組,心肌組織中MDA含量低于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05),見表1。

表1 模型組和FDP組心肌組織中ATP、SOD、MDA含量比較(n=6)Table 1 Comparison of ATP,SOD and MDA contents in myocardial tissue between model group and FDP group

2.5 心肌組織中PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平 FDP組大鼠心肌組織中PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平高于模型組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.001),見圖4、表2。

表2 模型組和FDP組心肌組織中PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平比較(±s,n=6)Table 2 Comparison of expression levels of PI3K and p-AKT protein in myocardial tissue between model group and FDP group

表2 模型組和FDP組心肌組織中PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平比較(±s,n=6)Table 2 Comparison of expression levels of PI3K and p-AKT protein in myocardial tissue between model group and FDP group

注:PI3K=磷脂酰肌醇-3-激酶,p-AKT=磷酸化蛋白激酶B

組別 PI3K p-AKT模型組 0.26±0.03 0.26±0.03 FDP組 0.51±0.03 0.45±0.02 t值 13.305 11.545 P值 <0.001 <0.001

圖4 Western blotting法檢測模型組和FDP組心肌組織中PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平Figure 4 Expression levels of PI3K and p-AKT protein in myocardial tissue detected by Western blotting method in model group and FDP group

3 討論

AMI是急性心肌缺血缺氧導(dǎo)致的心肌壞死,具有高致死率、高致殘率和醫(yī)療花費(fèi)昂貴的特點(diǎn)[10]。自1990年以來,我國居民心肌梗死發(fā)病率逐年上升,并呈現(xiàn)年輕化趨勢,已成為公共衛(wèi)生問題和突出的社會問題[1]。雖然目前臨床上有規(guī)范的藥物治療、急診再灌注治療方法,但心肌梗死后心力衰竭仍較常見,且與急性心肌缺血壞死的范圍和缺血缺氧時間密切相關(guān)。因此,臨床上迫切需要尋找新的方法來改善急性心肌缺血缺氧導(dǎo)致的心肌損傷,從而預(yù)防AMI后心力衰竭的發(fā)生。

FDP是醣酵解的中間產(chǎn)物,缺氧情況下其可提供外源性醣酵解的反應(yīng)底物,可在一定程度上增加ATP產(chǎn)量[11-12]。有動物實(shí)驗表明,心肌缺血時輸入外源性FDP可避開兩步耗能的磷酸化過程,即己糖激酶和磷酸果糖激酶催化反應(yīng)直接刺激丙酮酸激酶,恢復(fù)被阻斷的旁路代謝,產(chǎn)生比葡萄糖酵解多一倍的ATP,進(jìn)而改善心肌缺氧狀態(tài)下的能量代謝[13-14]。心肌組織中ATP含量的提高可以逆轉(zhuǎn)缺血心肌細(xì)胞的異常代謝,降低心肌氧耗[15]。采用FDP注射液治療缺血性心臟病已有20余年,研究表明,F(xiàn)DP注射液可防止AMI范圍擴(kuò)大,減輕缺血性心肌損傷及缺血再灌注引起的心肌損傷[7]。

由于FDP注射液需要靜脈輸注,使用不方便,故FDP口服液應(yīng)運(yùn)而生。FDP注射液和FDP口服液雖然是同一種藥物,但受生物利用度影響,口服液的臨床效果是否和注射液相同有待進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果顯示,模型組大鼠心肌纖維排列紊亂,體積增大,間隙變寬;FDP組大鼠大部分心肌纖維排列較為整齊,間隙較為清晰,保持了心肌組織相對正常的結(jié)構(gòu)和形態(tài)。光鏡下,模型組大鼠心肌組織纖維化明顯,可見島狀存活的心肌細(xì)胞;FDP組大鼠心肌梗死程度明顯減輕,存活的心肌細(xì)胞增多,且與模型組大鼠相比,其心肌纖維化面積明顯縮小。FDP組大鼠心肌膠原面積、心肌細(xì)胞凋亡率低于模型組,心肌組織中ATP含量高于模型組,表明FDP口服液可抑制AMI大鼠心肌纖維化及心肌細(xì)胞凋亡,改善心肌細(xì)胞能量代謝。

研究表明,心肌梗死時心肌缺血缺氧可產(chǎn)生過量的ROS,并使機(jī)體抗氧化能力降低[16]。本研究結(jié)果顯示,F(xiàn)DP組大鼠心肌組織中SOD含量高于模型組,心肌組織中MDA含量低于模型組,表明服用FDP口服液后AMI大鼠抗氧化能力增強(qiáng)、心肌氧化損傷減輕。而降低AMI期間心肌組織氧化應(yīng)激水平是延緩心肌細(xì)胞損傷、促進(jìn)心肌細(xì)胞再生的關(guān)鍵。此外,ROS還可激活磷脂酶,降解膜磷脂,破壞線粒體結(jié)構(gòu),降低線粒體膜電位,導(dǎo)致線粒體腫脹和破裂,并將凋亡物質(zhì)釋放到細(xì)胞質(zhì)中[16]。

研究表明,PI3K/AKT信號通路能通過抑制心肌細(xì)胞凋亡、促進(jìn)心肌細(xì)胞生長、抑制炎癥反應(yīng)、促進(jìn)血管新生、調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度、改善細(xì)胞能量代謝等抵抗心肌損傷,同時減緩心室重構(gòu)和心力衰竭的發(fā)生[17-21];此外,PI3K/AKT/Nrf2信號通路的激活還可減輕腦缺血再灌注誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥、凋亡和氧化應(yīng)激,而抑制此通路明顯減弱了其抗氧化、抗炎和抗凋亡活性[22]。本研究結(jié)果顯示,F(xiàn)DP組大鼠心肌組織中PI3K、p-AKT蛋白表達(dá)水平高于模型組,提示FDP口服液對AMI大鼠心肌細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制可能有PI3K/AKT信號通路的參與,但還有待進(jìn)一步驗證。

綜上所述,F(xiàn)DP口服液可抑制AMI大鼠心肌纖維化、心肌細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激,改善能量代謝,其機(jī)制可能與PI3K/AKT信號通路激活相關(guān),這為減輕急性心肌缺血缺氧損傷和心肌保護(hù)提供了新的思路,但具體通路仍需要進(jìn)一步實(shí)驗證實(shí)。

作者貢獻(xiàn):丁榮晶進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計,負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校,對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理;王青偉、夏昆進(jìn)行研究的實(shí)施與可行性分析;王青偉、李悅、劉強(qiáng)、劉業(yè)發(fā)進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析,結(jié)果分析與解釋;王青偉、李悅負(fù)責(zé)撰寫、修訂論文。

本文無利益沖突。

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