史于傳，何 宇，楊 陽(yáng)，范懿雋，楊 芳，詹 磊，衛(wèi) 兵

卵巢癌是威脅女性生命的惡性腫瘤之一[1]。其發(fā)病率位于婦科腫瘤第三[2]。臨床上，其標(biāo)準(zhǔn)的治療方法為手術(shù)治療聯(lián)合化療[3]。但是卵巢癌對(duì)化療固有的耐藥性導(dǎo)致其預(yù)后不良[4-5]。因此，有必要探索新的治療方法。在自然界中，存在一類具有生物活性的類黃酮物質(zhì)，白楊素(5，7-二羥基黃酮)就是其中一種[6]。研究[7]表明，白楊素具有抗腫瘤活性，能夠通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期停滯抑制腫瘤生長(zhǎng)。自噬是細(xì)胞一種代謝過程，通過分解、回收再利用，維持細(xì)胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)。先前的一些研究[8]中報(bào)道了白楊素可以促進(jìn)自噬，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行調(diào)控。該研究旨在探索白楊素是否通過調(diào)控自噬在卵巢癌細(xì)胞中發(fā)揮作用，以期獲得新的有效治療方法。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞系SKOV3卵巢癌細(xì)胞系購(gòu)自Sigma公司，保存于安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室的液氮罐中。用McCoy′s 5A (上海元培生物科技有限公司)培養(yǎng)基進(jìn)行復(fù)蘇和培養(yǎng)，培養(yǎng)基包含了10%胎牛血清和1%青霉素、鏈霉素。培養(yǎng)于含有5%CO2的37 ℃的溫箱環(huán)境，每天早晚各觀察1次細(xì)胞狀態(tài)，2～3 d進(jìn)行1次細(xì)胞換液，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%左右，進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。使用DMSO對(duì)白楊素(純度≥99.8%，貨號(hào):HY-14589，美國(guó)MCE公司)進(jìn)行稀釋，用終濃度為0、20、40、60、80、100 μmol/L的白楊素處理SKOV3細(xì)胞24 h。氯喹(chloroquine，CQ)購(gòu)自美國(guó)MCE公司，使用DMSO進(jìn)行配置，終濃度為60 μmol/L，聯(lián)合處理時(shí)，先用CQ對(duì)細(xì)胞進(jìn)行1 h的預(yù)處理，再用白楊素處理24 h。

1.2 標(biāo)本收集選取于安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科行卵巢癌手術(shù)切除的卵巢組織標(biāo)本，所有卵巢癌患者術(shù)前均未進(jìn)行化療等其他治療且病史詳細(xì)，病理類型為漿液性卵巢癌。手術(shù)病理分期為I期。同時(shí)選取行雙側(cè)附件切除患者(絕經(jīng)后子宮肌瘤行雙側(cè)附件切除)的卵巢組織，經(jīng)病理診斷為正常卵巢組織。卵巢癌組年齡為51～61(56.16±5.37)歲，正常卵巢組織年齡為50～59(54.52±4.62)歲，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。兩組各20例患者，均為絕經(jīng)后女性，且均無高血壓、糖尿病等慢性疾病。兩組均選取卵巢皮質(zhì)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。標(biāo)本均獲得患者知情同意，符合倫理標(biāo)準(zhǔn)(倫理編號(hào)：LLSC20180085)。

1.3 免疫組化將組織石蠟切片脫蠟，置于檸檬酸鈉緩沖液(含0.05%吐溫20，pH 6.0)中，在高壓鍋中煮沸15 min。使用配置的3%過氧化氫-甲醇混合物，對(duì)內(nèi)源性過氧化作用進(jìn)行阻斷。正常山羊血清完全覆蓋切片，在室溫下進(jìn)行1 h的封閉。在初級(jí)抗體(LC3 1 ∶100)中孵育8 h，孵育環(huán)境為4 ℃濕盒。在次級(jí)抗體中孵育30 min，此步驟在室溫下進(jìn)行。DAB顯色，蘇木精對(duì)細(xì)胞核復(fù)染。梯度乙醇進(jìn)行脫水，二甲苯透明。最后中性樹膠固定。

1.4 Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)向SKOV3細(xì)胞中加入蛋白酶抑制劑和RIPA裂解液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行裂解。通過離心收集的裂解物，經(jīng)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，電泳結(jié)束后，使用聚偏二氟乙烯(PVDF)膜(上海Biosharp公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)膜處理。PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉1 h。用TBST洗滌3次，將膜與特異性一級(jí)抗體在4 ℃孵育過夜。次日將膜與次級(jí)抗體在37 ℃孵育2 h。使用ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒觀察蛋白質(zhì)條帶。主要抗體GAPDH (AB8245)、LC3B (EPR18709)購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.5 CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖在96孔板上，對(duì)處理完成后的SKOV3細(xì)胞進(jìn)行接種。向每個(gè)孔中加入10 μl的CCK-8溶液，將細(xì)胞在37 ℃孵育2 h，然后測(cè)量混合物在450 nm處的吸光度，以測(cè)試細(xì)胞增殖情況。

1.6 透射電子顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)及自噬小體數(shù)目SKOV3細(xì)胞用不同濃度的白楊素處理并在37 ℃孵育24 h后，收集細(xì)胞并用PBS洗滌2次，離心、收集。用2.5%戊二醛固定至少2 h。將細(xì)胞團(tuán)在2%四氧化鋨中固定2 h，在不同濃度的乙醇中脫水(每15 min一次，20%、40%、60%、70%、80%、90%和100%)。然后將小球包埋在楤木中，用超微粉碎機(jī)以70 nm的厚度切片。超薄切片用2%醋酸鈾酰和0.2%檸檬酸鉛染色。電子顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)及自噬小體數(shù)目。

1.7 免疫熒光檢測(cè)將SKOV3細(xì)胞接種到載玻片上12 h。使用白楊素處理24 h后，用PBS洗滌細(xì)胞3次，并在4%多聚甲醛中固定15 min。載玻片中的非特異性結(jié)合位點(diǎn)用5%牛血清白蛋白(BSA)阻斷30 min。使用LC3(1 ∶200)孵育過夜。用熒光標(biāo)記的二抗孵育細(xì)胞，4，6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI)在黑暗中對(duì)細(xì)胞核進(jìn)行染色。用蔡司熒光顯微鏡對(duì)樣品進(jìn)行成像處理。

1.8 細(xì)胞凋亡檢測(cè)根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)對(duì)各組的凋亡細(xì)胞百分比進(jìn)行量化。將處理過的細(xì)胞用不含乙二胺四乙酸的胰蛋白酶消化后收集，100 μl的結(jié)合緩沖液進(jìn)行再懸浮處理，加入5 μl Annexin V-FITC和10 μl PI，黑暗環(huán)境中孵育15 min。采用Beckman Coulter公司(美國(guó))的Navios流式細(xì)胞儀進(jìn)行流式細(xì)胞檢測(cè)，凋亡細(xì)胞圖像使用FlowJo分析。點(diǎn)圖上的右下象限和右上象限分別代表早期凋亡細(xì)胞和晚期凋亡細(xì)胞。

2 結(jié)果

2.1 卵巢組織與卵巢癌組織中LC3的表達(dá)免疫組化結(jié)果顯示，與正常卵巢組織相比，LC3在卵巢癌中具有較高的表達(dá)量，見圖1。正常卵巢組織LC3表達(dá)(1.00±0.08)低于卵巢癌組(2.13±0.11)(P<0.01)。

圖1 免疫組化檢測(cè)組織LC3表達(dá) ×200

2.2 白楊素抑制SKOV3細(xì)胞的增殖分別用0、20、40、60、80、100 μmol/L白楊素對(duì)SKOV3細(xì)胞進(jìn)行處理，時(shí)間為24 h。檢測(cè)細(xì)胞增殖情況，CCK-8結(jié)果提示隨著濃度增加，細(xì)胞增殖降低，見圖2。40 μmol/L白楊素抑制SKOV3細(xì)胞的增殖，因此，本研究后續(xù)實(shí)驗(yàn)選取40 μmol/L白楊素進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

圖2 白楊素對(duì)細(xì)胞增殖影響

2.3 白楊素誘導(dǎo)SKOV3細(xì)胞自噬的形成白楊素處理細(xì)胞系(SKOV3)24 h后，Western blot 結(jié)果提示，與對(duì)照組相比，白楊素上調(diào)了LC3蛋白的表達(dá)(t=25.86，P<0.05)，見圖3。免疫熒光提示白楊素誘導(dǎo)LC3表達(dá)上升，見圖4。通過透射電鏡可以觀察到，與對(duì)照組比較，白楊素處理24 h的SKOV3細(xì)胞出現(xiàn)較多的自噬小體，在對(duì)照組則未觀察到自噬小體的存在，見圖5。另外，當(dāng)白楊素與CQ聯(lián)合使用24 h后，聯(lián)合處理組的LC3蛋白表達(dá)量高于白楊素和CQ單獨(dú)處理組(t=7.54、41.79，P<0.05、0.01)，見圖6。

圖3 白楊素處理后LC3蛋白的表達(dá)與對(duì)照組比較：*P<0.05

圖4 免疫熒光檢測(cè)LC3的表達(dá) ×400

圖5 SKOV3細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)箭頭：自噬小體

圖6 LC3蛋白的表達(dá)與白楊素組比較：#P<0.05；與CQ組比較：**P<0.01

2.4 白楊素抑制SKOV3細(xì)胞的增殖和促進(jìn)細(xì)胞凋亡白楊素與CQ聯(lián)合使用24 h后，聯(lián)合處理組的細(xì)胞增殖低于白楊素和CQ單獨(dú)處理組(F=47.48，P<0.05)，見圖7。對(duì)流式細(xì)胞儀的結(jié)果進(jìn)行分析，白楊素處理SKOV3細(xì)胞后，凋亡的細(xì)胞增加，CQ組細(xì)胞凋亡比例也高于對(duì)照組。白楊素+CQ組細(xì)胞凋亡比例最高(F=128，P<0.01)，見圖8。

圖7 SKOV3細(xì)胞增殖與白楊素組比較:*P<0.05

圖8 白楊素對(duì)SKOV3細(xì)胞凋亡影響

3 討論

卵巢癌是一個(gè)“沉默的婦女殺手”，由于其發(fā)現(xiàn)時(shí)間晚，同時(shí)缺乏有效的治療方法，死亡率一直居高不下[2]。因此，迫切需要尋求新的治療方案。白楊素是一種具有生物活性的類黃酮物質(zhì)，對(duì)多種腫瘤存在抑制作用，在本實(shí)驗(yàn)中，白楊素能夠降低卵巢癌細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的凋亡，這說明白楊素具有卵巢癌細(xì)胞殺傷作用。然而具體的機(jī)制尚不明確。

自噬作為一種細(xì)胞調(diào)控機(jī)制，通過降解和回收受損細(xì)胞器、畸形蛋白或局部細(xì)胞質(zhì)來維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，這是一個(gè)高度動(dòng)態(tài)的多步驟生物學(xué)過程。先前的研究[9-10]表明，自噬水平的變化能夠影響卵巢癌細(xì)胞的增殖、遷移等特征。

本實(shí)驗(yàn)顯示經(jīng)由白楊素處理后，SKOV3細(xì)胞的自噬水平有所升高。主要表現(xiàn)在LC3蛋白水平的升高和電鏡下可以觀察到的自噬小體數(shù)目的增加。LC3作為自噬小體上一個(gè)重要的標(biāo)志蛋白，其表達(dá)量的增加從側(cè)面也可反映自噬小體數(shù)目的增加。同時(shí)，細(xì)胞中自噬小體數(shù)目的增加又可以歸結(jié)于兩種原因：一種是自噬流的增加，表現(xiàn)為自噬小體合成的增加；另一種是自噬小體分解被抑制，細(xì)胞內(nèi)的自噬小體通過累積而增多。作為自噬的抑制劑，CQ的主要作用是抑制自噬小體和溶酶體的融合，從而抑制自噬小體的降解。本實(shí)驗(yàn)表明白楊素聯(lián)合CQ使用后LC3的表達(dá)水平較單獨(dú)白楊素處理組升高。這表明白楊素可使自噬流增加，而不是抑制自噬小體的分解。

自噬是一把雙刃劍，自噬的增加一方面可以促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。另一方面，具有保護(hù)作用的自噬也能協(xié)助腫瘤細(xì)胞對(duì)不良外界環(huán)境產(chǎn)生一定的抵抗[11]。為了明確白楊素誘導(dǎo)自噬所發(fā)揮的作用，課題組使用CQ來抑制自噬，結(jié)果顯示當(dāng)自噬被抑制后，卵巢癌細(xì)胞的凋亡增多，這說明白楊素誘導(dǎo)的自噬是具有保護(hù)作用的。當(dāng)這種具有保護(hù)作用的自噬被抑制后，細(xì)胞的凋亡能夠進(jìn)一步的上升，其可能的原因?yàn)榘讞钏貧[瘤細(xì)胞時(shí)，癌細(xì)胞通過增加自噬來為自身生長(zhǎng)提供所需的營(yíng)養(yǎng)，一定程度上抵消藥物的殺傷作用，當(dāng)CQ抑制了這種自噬，細(xì)胞失去了這種保護(hù)作用，導(dǎo)致白楊素的藥效增強(qiáng)。