朱延東，李 艷，周曉燕

糖尿病伴隨抑郁癥是身體/精神共病的典型病例，糖尿病患者伴抑郁癥的發(fā)病率是非糖尿病患者的兩倍[1]。目前臨床上多應用抗抑郁藥和降糖藥來治療糖尿病患者的抑郁樣癥狀，但是效果不明顯且副作用大[2]。因此，尋找有效的治療糖尿病抑郁的藥物尤為重要。海馬是調控情緒和認知的功能腦區(qū)，海馬區(qū)炎癥和神經(jīng)元損傷與糖尿病抑郁發(fā)生發(fā)展密切相關[3]。晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(receptor for advanced glycation end products, RAGE)是糖尿病多種并發(fā)癥的關鍵因子。海馬區(qū)RAGE表達顯著增加，激活其相關信號通路，損傷海馬神經(jīng)元突觸傳遞，是焦慮和抑郁等精神行為異常的關鍵因素[4-5]。該研究通過腹腔注射RAGE抑制劑FPS-ZM1，觀察其對2型糖尿病模型鼠db/db小鼠抑郁樣行為，海馬神經(jīng)元凋亡和NOD樣受體蛋白3(nod-like receptor protein 3, NLRP3)炎性小體的影響，明確FPS-ZM1對db/db小鼠抑郁行為的影響及分子機制，能夠為治療糖尿病抑郁癥狀提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1主要試劑 TUNEL試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司(貨號：KGA703)，BCA蛋白濃度測定試劑盒(增強型)(貨號：P0010S)和免疫印跡制膠試劑盒(貨號：P0012A)購自上海碧云天生物技術有限公司，RAGE抗體(貨號: SC-365154)購自美國Santa Cruz公司；NLRP3抗體(貨號: NBP2-12446)購自美國Novus公司；白介素-1β (Interleukin-1β, IL-1β)抗體(貨號: 16806-1-AP)和半胱氨酸蛋白酶-1 (cysteinyl aspartate specific proteinase-1, Caspase-1) 抗體(貨號: 22915-1-AP)均購自美國Proteintech公司。其他化學試劑均購自上海國藥試劑有限公司。

1.1.2實驗動物 5～7 周齡2型糖尿病模型小鼠db/db及對照雜合子db/m 小鼠均購于南京大學模式動物研究所，并于徐州醫(yī)科大學實驗動物中心的SPF屏障系統(tǒng)內進行無菌飼料和無菌水喂養(yǎng)。小鼠適應性喂養(yǎng)1周后開展實驗。

1.2 方法

1.2.1實驗分組 6～8周齡雄性db/db小鼠24只，隨機分為2型糖尿病組(db/db，不予任何處理)、糖尿病給藥組[db/db+FPS，db/db小鼠腹腔注射FPS-ZM1 1.0 mg/(kg·d)]、糖尿病溶劑對照組(db/db+Oil，db/db小鼠腹腔注射同等體積的玉米油)，每組8只。6～8周齡的雄性db/m小鼠8只作為正常對照。給藥12周后，進行行為學檢測，然后處死取腦。

1.2.2懸尾實驗(tail suspension test, TST)[6]將小鼠尾部懸掛于離地面40 cm的實驗桿上，2 min適應后，Any Maze軟件系統(tǒng)攝像頭追蹤小鼠頭部，記錄4 min內小鼠不動時間。

1.2.3強迫游泳實驗(forced swimming test, FST)[7]將直徑45 cm、19 cm的玻璃容器內盛水，水溫22～25°C，液面高度23 cm。將小鼠放入容器中適應2 min后，Any Maze軟件系統(tǒng)攝像頭追蹤小鼠頭部，記錄 4 min內不動時間。

1.2.4海馬蛋白的提取和濃度測定 1.5%的戊巴比妥(0.6 ml/g)腹腔注射麻醉小鼠，每組4只小鼠，然后迅速斷頭取腦，剝離出小鼠雙側海馬放于EP管中。按照胞質蛋白提取試劑盒加入600 μl的勻漿液，冰上勻漿后，12 000 r/min，離心10 min，吸取上清液，即為胞質蛋白。然后使用BSA蛋白檢測試劑盒進行濃度測定。根據(jù)所測各樣本濃度，取相同的樣本量，補充勻漿液至相同的體積。加入4 × Loading buffer，充分混勻后沸水煮10 min，使蛋白完全變性，放入-20 ℃冰箱內待用。

1.2.5海馬腦片準備和TUNEL染色 將每組4只小鼠麻醉后，用4%的多聚甲醛灌注 20 min后，取腦剝離后固定，脫水透明后修剪腦塊并進行石蠟包埋。腦片冠狀縫切片，厚度5 μm，脫蠟至水后按照TUNEL試劑盒說明書的步驟進行染色。首先滴加proteinase K工作液37 ℃反應30 min，PBS漂洗3次，每個腦片加入50 μl標記液(TdT和dUTP混合液)，室溫30 min后加50 μl TUNEL反應混合液，37 ℃避光反應1 h。PBS常規(guī)漂洗3次，滴加50 μl DAB工作液反應5 min，PBS漂洗3次后復染封片。Olympus DP73正置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，凋亡神經(jīng)元著色較深，體積變小，細胞核皺縮或溶解，細胞質染色質分割成塊狀或出現(xiàn)點狀的凋亡小體。計數(shù)小鼠海馬CA3區(qū)1 mm2面積中神經(jīng)元的凋亡率。

1.2.6免疫印跡法檢測RAGE、NLRP3、IL-1β、Caspase-1以及Actin的表達 根據(jù)蛋白的分子量配置10%(RAGE、IL-1β及Caspase-1)和8%(NLRP3)的電泳凝膠。每孔上樣10～20 μl(含蛋白量40～80 μg)，常規(guī)電泳和電轉。NC膜在3% BSA中封閉3 h后，浸泡在合適比例的一抗(RAGE：1 ∶3 000；NLRP3：1 ∶3 000；IL-1β：1 ∶2 000；Caspase-1：1 ∶2 000)中，4 ℃孵育過夜。次日Washing Buffer震蕩洗滌5次后，熒光二抗(1 ∶3 000)室溫搖床孵育1 h后，Odyssey化學發(fā)光掃描系統(tǒng)掃描條帶。使用Image J軟件進行蛋白條帶的灰度值分析，計算各組目的蛋白與Actin灰度值的比值，再將各組獲得的比值與對照組(db/m)相比作為各組的相對表達量。

2 結果

2.1 RAGE抑制劑FPS-ZM1改善db/db小鼠抑郁樣行為FPS-ZM1注射12周后，應用TST和FST檢測小鼠抑郁癥狀。結果顯示：db/db小鼠在TST和FST中的不動時間(95.25 ± 8.4，103.40 ± 7.9)顯著高于db/m小鼠(57.10 ± 5.8，67.13 ± 6.6)(F=22.52、15.16 ，P<0.01)；FPS-ZM1能減少db/db小鼠在TST和FST中的不動時間 (76.27 ± 7.2，82.26 ± 7.7)(F=22.52、15.16，P<0.01)。表明FPS-ZM1能改善糖尿病小鼠的抑郁樣行為。見圖1。

圖1 FPS-ZM1改善db/db小鼠的抑郁樣癥狀(n=8)與db/m組比較：** P<0.01；與db/db組比較：## P<0.01；與db/db+FPS組比較：△△P<0.01

2.2 RAGE抑制劑FPS-ZM1減少db/db小鼠海馬神經(jīng)元凋亡應用TUNEL法檢測海馬神經(jīng)元的凋亡率，結果顯示：db/db小鼠海馬CA3區(qū)神經(jīng)元凋亡率高于db/m組(F=80.93，P<0.01)；應用FPS-ZM1后降低db/db小鼠海馬區(qū)神經(jīng)元的凋亡(F=80.93，P<0.01)。表明FPS-ZM1能減少高血糖引起的海馬神經(jīng)元凋亡。見圖2。

圖2 FPS-ZM1減少db/db小鼠海馬神經(jīng)元凋亡(n=8)A：海馬切片TUNEL染色的典型圖片；e-h：a-d中的黑框區(qū)域放大圖；a-d：×40；e-h：×400；紅色箭頭：凋亡細胞；B：海馬CA3細胞凋亡率的統(tǒng)計圖；與db/m組比較：*P<0.05, **P<0.01；與db/db組比較：## P<0.01；與db/db+FPS組比較：△△P<0.01

2.3 RAGE抑制劑FPS-ZM1減少db/db小鼠海馬區(qū)RAGE和NLRP3的表達免疫印跡結果顯示：db/db小鼠海馬區(qū)RAGE的表達增加(F=24.02，P<0.01)，而FPS-ZM1能夠降低db/db小鼠海馬區(qū)RAGE的高表達(F=24.02，P<0.01)。db/db小鼠海馬區(qū)NLRP3的表達增加(F=28.14，P<0.01)，而FPS-ZM1能夠降低db/db小鼠海馬區(qū)NLRP3的表達(F=28.14，P<0.01)。表明FPS-ZM1能下調高血糖引起的RAGE高表達以及其下游炎性小體的活化。見圖3。

圖3 FPS-ZM1抑制db/db小鼠海馬中RAGE和NLRP3的水平(n=4)A、B：免疫印跡實驗檢測RAGE、NLRP3的表達；C：各組RAGE和NLRP3相對表達量的統(tǒng)計圖；與db/m組比較：*P<0.05, ** P<0.01；與db/db組比較：## P<0.01；與db/db+FPS組比較：△△P<0.01

2.4 RAGE抑制劑FPS-ZM1減少db/db小鼠海馬區(qū)Caspase-1和IL-1β的活化免疫印跡結果顯示：db/db小鼠海馬區(qū)IL-1β的表達高于db/m小鼠(F=27.06，P<0.01)，而FPS-ZM1能降低高血糖引起的IL-1β高表達(F=27.06，P<0.01)，而db/m組、db/db組、db/db+FPS組以及db/db+Oil組中IL-1β的前體蛋白pro-IL-1β的表達沒有差異；db/db小鼠海馬區(qū)Caspase-1的表達高于db/m小鼠(F=193.90，P<0.01)，同樣，F(xiàn)PS-ZM1能降低Caspase-1的高表達(F=193.90，P<0.01)，而Caspase-1的前體蛋白pro-Caspase-1的表達各組間無明顯差異。表明FPS-ZM1能抑制高血糖引起的NLRP3炎性小體的活化。見圖4。

圖4 FPS-ZM1降低db/db小鼠海馬區(qū)Caspase-1和IL-1β的表達(n=4)A、B：免疫印跡法檢測Caspase-1、IL-1β的表達水平；C：Caspase-1和IL-1β的相對表達量的統(tǒng)計圖；與db/m組比較：*P<0.05, ** P<0.01；與db/db組比較：##P<0.01；與db/db+FPS組比較：△△P<0.01

3 討論

糖尿病和抑郁共病會導致患者生活質量顯著降低，同時也給糖尿病患者的家庭以及全社會造成嚴重的經(jīng)濟負擔。目前關于糖尿病引起抑郁癥狀發(fā)生發(fā)展的分子機制尚未完全闡明，臨床尚缺乏有效的治療措施。因此，深入探討糖尿病引起抑郁行為的分子機制，能夠為研發(fā)治療糖尿病抑郁的藥物提供可靠治療靶標。研究[8]顯示海馬CA3區(qū)是調控情緒的關鍵功能腦區(qū)，CA3區(qū)神經(jīng)元的損傷和神經(jīng)突觸連接障礙是抑郁發(fā)生發(fā)展的重要原因。此外，高血糖引起的腦內炎癥因子表達增加，也在糖尿病神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥以及精神行為異常中扮演著重要角色。炎癥反應引起海馬區(qū)小膠質細胞和星型膠質細胞的激活，介導凋亡啟動子Caspase-3的活化，進而導致海馬神經(jīng)元損傷，引起糖尿病小鼠認知障礙、焦慮、抑郁等精神行為異常[9-10]。

NLRP3炎性小體是由NLRP3蛋白、凋亡相關的斑點樣蛋白(apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD, ASC)以及Caspase-1前體蛋白(Pro-caspase-1)共同組成的一個炎性復合體。該炎性小體活化后可引起Pro-caspase-1剪切活化成Caspase-1，進而使IL-1β前體也發(fā)生剪切，形成有活性的IL-1β。Caspase-1和IL-1β活化后從胞質釋放到胞外，引起局部的炎癥反應[11-12]。既往的研究[13]顯示，高血糖可活化小鼠海馬區(qū)NLRP3，導致Caspase-1和IL-1β等下游炎癥介質釋放增加，進而通過多種機制促進糖尿病小鼠認知障礙、行為異常和抑郁樣癥狀。敲除NLRP3或抑制NLRP3炎性小體的活化，都能夠減輕神經(jīng)炎癥，改善高血糖引起的行為異常和抑郁樣癥狀。

研究[14]證實，高糖刺激引起海馬區(qū)RAGE表達顯著增加。RAGE作為上游信號分子，可通過激活NLRP3炎性小體和其他凋亡信號通路，引起海馬神經(jīng)元損傷，導致神經(jīng)突觸連接障礙。因此RAGE是糖尿病神經(jīng)抑郁及其他神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的關鍵因素。敲除RAGE，能夠抑制糖尿病小鼠海馬區(qū)絲裂原激活的蛋白激酶/MAP激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)信號通路，改善海馬神經(jīng)元的長時程增強(long-term potentiation, LTP)，提高糖尿病小鼠的認知功能[15]。此外應用RAGE特異性抑制劑FPS-ZM1能顯著抑制高糖環(huán)境中RAGE的表達，抑制神經(jīng)炎癥反應，降低糖尿病小鼠海馬神經(jīng)元損傷，提高神經(jīng)纖維的密度，改善海馬依賴性的空間學習記憶能力[5]。因此RAGE與糖尿病神經(jīng)系統(tǒng)并發(fā)癥密切相關，其抑制劑FPS-ZM1能夠減輕高糖刺激引起的海馬神經(jīng)元損傷。但是FPS-ZM1是否能夠改善糖尿病抑郁，以及其減輕抑郁的分子機制仍需進一步探明。

本研究以2型糖尿病模型鼠db/db小鼠為糖尿病-抑郁共病模型，應用行為學、組化和免疫印跡實驗，闡明了RAGE抑制劑FPS-ZM1改善糖尿病抑郁的分子機制：FPS-ZM1通過下調海馬區(qū)RAGE的表達，減少其下游NLRP3炎性小體的活化，進而抑制高血糖引起的海馬神經(jīng)元凋亡，減輕糖尿病小鼠抑郁。該分子機制的闡明對研發(fā)治療糖尿病抑郁的藥物提供了可靠的理論依據(jù)。