汪 靜，劉 芳，謝 華，蔡春泉，姜 宏，陳曉麗

神經(jīng)管畸形(neural tube defect，NTDs)是一類由于胚胎發(fā)育早期神經(jīng)管閉合失敗或閉合不完全所致的嚴重出生缺陷。據(jù)統(tǒng)計，NTDs的全球發(fā)病率為0.5‰～2%，中國的發(fā)病率接近2.74‰[1]。NTDs是一類由環(huán)境和遺傳因素共同作用導(dǎo)致的復(fù)雜性疾病。目前通過人群及小鼠敲除模型研究已發(fā)現(xiàn)400多種可能導(dǎo)致神經(jīng)管畸形的基因[2]，其中熱點基因包括CELSR1、FZD6、PRICKLE1、DVL2、VANGL1、VANGL2等極性基因[3]。近年研究[4]認為新生突變是導(dǎo)致出生缺陷及神經(jīng)發(fā)育疾病的常見原因。2015年，Lemay et al[5]對43個散發(fā)NTDs家系研究也證實新生突變是導(dǎo)致人腰骶部NTDs發(fā)生的原因之一。

纖毛是突出于細胞表面的微小細胞器并廣泛存在，與人類發(fā)育健康和疾病如麥克爾綜合征(Meckel syndrome，MKS)、Joubert綜合征(Joubert syndrome，JS)等密切相關(guān)。上述綜合征包括胎兒脊柱裂、腦脊膜膨出、腦組織缺如等與NTDs表型類似的臨床表現(xiàn)。但關(guān)于纖毛基因變異與人NTDs的相關(guān)性研究較少，本課題組前期研究[6]證實：同時參與纖毛發(fā)育的極性基因PARD3突變與人NTDs相關(guān)，且均為顱部NTDs。鮮有關(guān)于纖毛基因與人類腰骶部NTDs的相關(guān)性研究。該研究利用AmpliSeq技術(shù)設(shè)計了包括極性基因(如PARD3)及明確纖毛病候選基因在內(nèi)的49個纖毛相關(guān)基因的編碼區(qū)靶向捕獲Panel，對56個散發(fā)腰骶部NTDs家系進行測序，以期明確纖毛罕見危害性變異對人腰骶部NTDs發(fā)生的致病性。

1 材料與方法

1.1 研究對象選擇在首都兒科研究所和天津市兒童醫(yī)院明確診斷的腰骶部神經(jīng)管畸形患者56例，均無家族史，其中男性36例，女性20例。所有腰骶部神經(jīng)管畸形患者由臨床醫(yī)師評估并影像學(xué)輔助診斷，最終手術(shù)明確診斷。全部患者父母亦由臨床醫(yī)師評估結(jié)合影像學(xué)輔助診斷無神經(jīng)管畸形。本研究通過首都兒科研究所倫理委員會審查，所有患兒均由其父母或監(jiān)護人簽署知情同意書。

1.2 主要儀器及試劑Qubit 2.0 熒光光度計、Ion OneTouch 油包水PCR儀、Ion OneTouch ES 儀、Ion Torrent PGM測序儀(美國Life Technologies 公司)。全血DNA提取試劑盒(美國Qiagen公司)；Agencourt AMPure XP磁珠化試劑(美國Beckman Coulter公司)；Qubit dsDNA HS Assay 試劑盒、Ion PGMTM200 Sequencing 測序試劑盒、Ion 316TM芯片、 Ion Xpress Barcode Adapters1-16試劑盒、Ion AmpliSeq Library 試劑盒(美國Life Technologies 公司)。

1.3 實驗方法

1.3.1DNA制備 采集56例神經(jīng)管畸形患兒及其表型正常父母外周血提取基因組DNA，采用DNeasy Blood & Tissue kit試劑盒(美國Qiagen公司)提取DNA。取2 μl已提取的基因組DNA，應(yīng)用紫外分光光度儀測量DNA濃度，A260/A280=1.8～2.0，A260/A230>2.0，計算基因組DNA含量。

1.3.2纖毛基因Panel的靶向深度測序 利用既往NTD小鼠模型中發(fā)現(xiàn)的纖毛基因[2]、OMIM系統(tǒng)內(nèi)明確纖毛發(fā)育相關(guān)遺傳病(https://www.omim.org/)及課題組最近發(fā)表的文章[6]構(gòu)建纖毛候選基因列表。采用Ion AmpliSeq Library在線設(shè)計系統(tǒng)形成纖毛基因的AmpliSeq靶向捕獲和多重PCR擴增試劑盒，之后和Ion Xpress Barcode Adapters試劑進行文庫構(gòu)建，制備的文庫片段大小為200～300 bp；接著用Ion OneTouchTM200 Templete 試劑盒在Ion OneTouch上對文庫進行乳化，在Ion OneTouch ES上對磁珠進行富集；最后采用Ion PGM 200 試劑盒和Ion 316TM芯片在Ion Torrent PGM平臺進行測序。

1.3.3數(shù)據(jù)分析 實驗數(shù)據(jù)自動傳到Ion Torrent服務(wù)器，點擊已完成的測序，根據(jù)要求完成Coverage Analysis和Variant Caller分析，并對測序數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)量、平均測序深度、產(chǎn)生的BAM、BAI、VCF.GZ、XLS文件進一步分析。將VCF.GZ文件導(dǎo)入wANNOVAR(http://wannovar.usc.edu/ )軟件，分析所獲各變異位點在人群的分布頻率、氨基酸改變、變異分類(Indel、SNV)，優(yōu)先選擇Loss of Function變異，根據(jù)錯義變異的生物信息學(xué)軟件(Mutation Taster，PROVEAN，Polyphen-2，REVEL)預(yù)測結(jié)果確定其危害性。將BAM、BAI文件導(dǎo)入軟件IGV，明確各位點測序數(shù)據(jù)是否為真性突變，排除測序得到的假陽性數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 測序數(shù)據(jù)基本情況本研究收集的家系均為1個神經(jīng)管畸形患兒配伍表型正常的父母，因此首選篩查雙位點罕見基因變異、新生基因變異。測序數(shù)據(jù)與公共數(shù)據(jù)庫[Genome1000、dbSNP、NHLBI、Exome Sequencing Project (ESP)、ExAC Browser]比對，結(jié)合神經(jīng)管畸形的人群患病率，鎖定頻率小于1%的外顯子區(qū)非同義單核苷酸突變。對測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，測序覆蓋率97%～98%，平均測序深度400X～600X。

2.2 NTDs患者存在CRB2復(fù)雜雜合變異測序結(jié)果顯示，1例患兒存在CRB2基因兩個突變位點的復(fù)雜雜合變異(c.G1392C, p.R464S; c.T3448C, p.C1150R)，且均為危害性突變。其中c.G1392C, p.R464S突變位點遺傳自患兒母親，公共數(shù)據(jù)庫中未見報道，另一個突變位點c.T3448C, p.C1150R遺傳自患兒父親，公共數(shù)據(jù)庫中為罕見變異(MAF<1%)，見圖1、表1，兩突變位點在物種間高度保守，見圖2。

圖1 CRB2復(fù)雜雜合突變位點信息A：CRB2基因結(jié)構(gòu)，紅色標注分別為患者攜帶CRB2；b：患者c.1392G>C變異來源于母親； c：患者c.3448T>C變異來源于父親；S、M、F分別代表患者、母親、父親

表1 突變位點基本信息

2.3 NTDs患者存在GLI3新生突變測序結(jié)果顯示，1例患兒存在GLI3基因的一個新生突變(c.C580T, p.H194Y)，該突變經(jīng)軟件預(yù)測為危害性突變，且公共數(shù)據(jù)庫均未見報道，見表1、圖3，該突變位點在物種間高度保守，見圖2。鑒于該家系發(fā)現(xiàn)的GLI3基因變異為新生錯義突變，筆者首先通過其他位點的連鎖分析證實了患者與父母的親子關(guān)系，用IGV查看家系測序數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)GLI3基因片段測序覆蓋率及測序深度較低，故采用Primer 3.0針對基因設(shè)計引物，對所有家系進行Sanger測序驗證，證實了GLI3新生突變位點的真實性，并且在其他55個家系均未見該基因的罕見變異，見圖4。其余54個神經(jīng)管畸形家系尚未發(fā)現(xiàn)雙位點罕見基因變異及新生基因變異。

圖2 突變位點在8個物種間保守性分析

圖3 GLI3新生突變位點信息A：GLI3編碼蛋白結(jié)構(gòu)，紅色標注為本文患者攜帶GLI3新生突變，藍色標注為文獻[7]中食管閉鎖伴有半椎體患者攜帶GLI3突變；b：panel測序結(jié)果顯示新生突變；S、M、F分別代表患者、母親、父親GLI3是GLI家族鋅指結(jié)構(gòu)3。GLI家族鋅指蛋白是經(jīng)典hedgehog(HH)信號通路的轉(zhuǎn)錄效應(yīng)因子，參與胚胎形態(tài)發(fā)生的各個階段，并且是組織正常發(fā)育的必須調(diào)節(jié)因子。GLI3基因突變與格雷格頭、多指(趾)、并指(趾)綜合征(Greig cephalon polysyndactyly syndrome，GCPS)等相關(guān)。GLI3突變小鼠因大腦、脊柱、四肢、肺等多器官缺陷無法存活。2014年Yang et al[7]報道1例食管閉鎖伴半椎體患者攜帶一個GLI3的新生突變(M111T)，進一步行蛋白功能實驗發(fā)現(xiàn)：該突變可導(dǎo)致內(nèi)源性SKIL表達下降，并且GLI3與SKI家族蛋白-SKIL間的相互關(guān)系減弱，提示該突變可通過影響GLI3與SKIL的相互作用導(dǎo)致患者出現(xiàn)食管閉鎖及半椎體表型。2019年，Renard et al[14]首次發(fā)現(xiàn)一個GLI3基因SNP(c.4609C>T,rs35364414)在人類腰骶部NTDs中富集。研究顯示，人類腰骶部NTDs患者中存在GLI3的新生突變(H194Y)，該突變同處于GLI3基因的Repressor域，該區(qū)域主要參與同SKI家族蛋白的相互作用，且GLI3基因M111T突變患者表型中存在半椎體，因此考慮GLI3基因的新生突變(H194Y)可能為該家系中患者的發(fā)病原因。后續(xù)仍需對H194Y突變進行功能試驗進一步驗證。

圖4 Q100家系成員GLI3基因變異Sanger測序驗證結(jié)果S：患者；M：母親；F：父親

3 討論

NTDs作為多基因疾病，存在高度遺傳異質(zhì)性。絕大多數(shù)NTDs病因不明。纖毛在生物的胚胎發(fā)生和維持器官完整性中發(fā)揮重要作用。纖毛的功能異常會造成一系列表型復(fù)雜且嚴重的人類疾病稱為“纖毛病”。NTDs是一系列纖毛病的重要表型之一，如MKS患兒有腦膨出、多囊腎及并趾(指)等表型[8]。同時NTD小鼠也存在纖毛異常表型[3]。有研究[9]報道纖毛相關(guān)基因DNAAF1基因變異與人類NTDs發(fā)生相關(guān)。本課題組前期研究[10]顯示，纖毛基因的拷貝數(shù)變異與人類NTDs相關(guān)。

本研究利用AmpliSeq技術(shù)設(shè)計了包括纖毛極性基因(如PARD3)及明確纖毛病候選基因在內(nèi)的49個相關(guān)基因的編碼區(qū)靶向捕獲Panel，對56個散發(fā)腰骶部NTDs家系進行測序，發(fā)現(xiàn)兩個可能與神經(jīng)管畸形表型發(fā)生相關(guān)的基因：CRB2及GLI3。

CRB2與CRB1及CRB3為同源基因，均為Crumbs蛋白家族成員，在視網(wǎng)膜、大腦和腎臟中均有表達。Crumbs蛋白復(fù)合物(CRB-PALS1-PATJ或CRB-PALS1-MUPP1)與PAR蛋白復(fù)合物(PAR3-PAR6-aPKC)對發(fā)育的神經(jīng)上皮細胞建立細胞極性有重要作用[11]。Boroviak et al[12]對CRB2基因的功能研究表明CRB2對維持其他極性細胞的穩(wěn)定性也是必要的，無CRB2基因表達的胚胎干細胞在神經(jīng)細胞開始分化時無法存活。人類CRB2基因突變可導(dǎo)致局灶性腎小球硬化(FGSG-9，MIM：616220)及一些纖毛相關(guān)疾病。本研究首次在NTDs家系發(fā)現(xiàn)CRB2基因突變，雖然其對神經(jīng)管畸形的致病性尚不明確，但課題組前期通過病例對照研究[6]發(fā)現(xiàn)與CRB2基因密切作用的復(fù)合物——PARD3基因突變是人類NTDs的危險因素；通過突變子的體外細胞功能實驗和基因敲除的雞胚形態(tài)學(xué)實驗證實，PARD3基因aPKC結(jié)構(gòu)域突變后可導(dǎo)致神經(jīng)上皮細胞極性消失，該基因敲除后神經(jīng)管腔化異常。小鼠模型研究[13]發(fā)現(xiàn)，CRB2基因敲除后，PALS1和PARD3基因表達明顯下調(diào)，而PALS1基因敲除后MDCK細胞的管腔化異常。本研究中1例單純腰骶部神經(jīng)管畸形家系患者攜帶CRB2的復(fù)雜雜合變異，軟件預(yù)測均為危害性變異，考慮可能為該家系中患者的發(fā)病原因。尚需通過更多的病例-對照研究進一步證實CRB2基因罕見變異和人NTDs發(fā)生的關(guān)系。