韋琪瑤，吳永芳，張雨欣，王亞濤，曾立平，陳貴海，曹 磊

胚胎期炎癥暴露會加速小鼠年齡相關(guān)的記憶減退[1]，但其確切機(jī)制仍不清楚。研究[2]表明年齡相關(guān)的記憶減退可能與突觸可塑性相關(guān)蛋白含量的改變有關(guān)。突觸體相關(guān)蛋白25(synaptosomal-associated protein 25, SNAP-25)是可溶性N-乙基馬來酰亞胺敏感因子附著蛋白受體(SNARE)的囊泡蛋白，參與突觸可塑性和神經(jīng)遞質(zhì)的胞吐過程[3]。研究[4]表明，SNAP-25在成年大鼠海馬中過表達(dá)會導(dǎo)致記憶鞏固的解除以及突觸傳遞障礙，即SNAP-25可以通過改變突觸可塑性來影響認(rèn)知能力。細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的成分，會使機(jī)體發(fā)生神經(jīng)炎癥，可用于制作經(jīng)典的炎癥模型[5]。本課題組前期研究[6]顯示胚胎期暴露LPS會加速年齡相關(guān)的記憶減退的發(fā)生。然而，海馬SNAP-25蛋白水平改變是否參與胚胎期炎癥暴露導(dǎo)致的認(rèn)知功能損害仍未見相關(guān)報(bào)道。故該研究擬探討胚胎期炎癥暴露是否會引起中老年小鼠海馬SNAP-25蛋白水平改變，及其是否與學(xué)習(xí)記憶損害相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及模型建立清潔級2月齡CD-1小鼠購自湖南省斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物公司。雌鼠24～26 g，雄鼠27～29 g。小鼠飼養(yǎng)于溫度(23 ± 2) ℃，濕度(50 ± 5)%，明暗周期12 h交替進(jìn)行的環(huán)境中，自由獲取食物和水。小鼠按2∶1(雌∶雄)于21：00合籠，次日07：00查陰栓，首次查到陰栓者定為受孕第0天(G0)。孕鼠單籠飼養(yǎng)并隨機(jī)在孕第15～17天每天腹腔注射LPS(50 μg/kg)，或等容積生理鹽水，對應(yīng)子鼠分別為LPS組和CON組。每組選取3月齡(6只雄鼠)和15月齡(6只雄鼠)納入實(shí)驗(yàn)。本實(shí)驗(yàn)所有操作均符合安徽醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)倫理委員會的要求。

1.2 Morris水迷宮(MWM)采用MWM任務(wù)評估小鼠空間學(xué)習(xí)和記憶能力。實(shí)驗(yàn)裝置為黑色圓形水池(直徑150 cm，高30 cm)及黑色圓柱狀逃生平臺(直徑10 cm，高24 cm)，池內(nèi)水溫保持(22 ± 2) ℃。水迷宮上方安裝攝像頭采集小鼠運(yùn)動軌跡，運(yùn)用Any-maze軟件分析圖像。水迷宮周圍用白色簾布(距水池邊緣50 cm)包圍，并在距水池底1.5 m高處等距離懸掛3個黑色線索。整個實(shí)驗(yàn)過程中，平臺位于靶象限內(nèi)，并低于水面1 cm。實(shí)驗(yàn)過程分為：① 學(xué)習(xí)期(定位航行期)：首次測試前，將小鼠放到平臺 30 s，再將小鼠分別從不同象限面向池壁放入水中，每次給予60 s時(shí)間來尋找水下平臺。每次測試間隔15 min，每天完成4次測試，連續(xù)7 d。記錄平均游泳路程，作為小鼠學(xué)習(xí)能力的指標(biāo)。② 記憶期(空間探索期)：小鼠完成第7天學(xué)習(xí)期實(shí)驗(yàn)后，休息1 h，在移除平臺的情況下，從與靶象限相對的象限再次入水。小鼠被允許在水池中自由游泳60 s。記錄靶象限游泳路程占總路程的百分比，作為空間記憶能力的指標(biāo)。

1.3 試劑與儀器RIPA細(xì)胞裂解液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；ECL超敏發(fā)光試劑盒購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；鼠抗SNAP-25(sc-20038)購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；羊抗鼠二抗(ZB-2305)、鼠抗β-actin(TA-09)均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。徠卡切片機(jī)(德國Leica公司)；數(shù)字掃描儀(Motic公司)。

1.4 標(biāo)本制備行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)束兩周后，小鼠頸椎脫臼處死，冰上取腦，并快速分離出海馬。將左腦于4 %的多聚甲醛溶液中固定，脫水、浸蠟、包埋。蠟塊經(jīng) -20 ℃冷凍后，3 μm厚連續(xù)冠狀切片進(jìn)行免疫組化分析。

1.5 免疫組織化學(xué)染色及攝片采用鏈霉親和素-生物素復(fù)合素法(SABC)進(jìn)行檢測。一抗為鼠源性抗SNAP-25蛋白抗體，二抗用生物素標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG，最后用DAB顯色。用數(shù)字掃描儀拍攝海馬整體，然后用4×20倍顯微鏡分別對海馬CA1、CA3、DG區(qū)進(jìn)行拍攝。應(yīng)用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件進(jìn)行圖像分析。采用平均光密度值(average optical density, AOD)作為SNAP-25蛋白相對含量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

1.6 Western blot分析收集組織樣本，加入蛋白質(zhì)中性裂解緩沖液(RIPA)后提取上清液，在提取的蛋白組織中按照1 ∶4加入5×SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液，沸水浴加熱10 min，充分變性蛋白。樣品冷卻至室溫后，把樣品上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)，電泳儀先用80 V、30 min，然后改為120 V、1 h。恒流轉(zhuǎn)膜30 min，漂洗5 min，加入5 % 脫脂奶粉后于室溫封閉2 h。然后加入一抗(anti-SNAP-25，鼠抗，1 ∶1 000稀釋)，4 ℃緩慢搖動孵育過夜，使用PBST洗滌。再加入辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的二抗(1 ∶20 000)，室溫孵育1 h，PBST洗滌后，用ECL發(fā)光試劑盒來檢測蛋白。使用Image軟件分析蛋白條帶，計(jì)算SNAP-25的相對表達(dá)量。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 23.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。Morris水迷宮學(xué)習(xí)期成績采用重復(fù)測量方差分析，記憶期成績和SNAP-25含量采用兩因素方差分析，觀察處理因素和年齡因素的影響。組間兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。采用Pearson相關(guān)分析法分析SNAP-25含量與行為學(xué)數(shù)據(jù)之間的相關(guān)性。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)

2.1.1學(xué)習(xí)期 小鼠的游泳路程隨天數(shù)增加而減少[F(6，120)=132.034，P<0.01],且四組間游泳路程差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[F(3，20)=45.707，P<0.01]。兩兩比較分析表明，15月齡CON組游泳路程長于3月齡CON組[F(1，10)=19.811，P=0.001]，見圖1A；15月齡LPS組游泳路程較同齡CON組延長[F(1，10)=34.690，P<0.01]，見圖1C；而3月齡LPS組與3月齡CON組間游泳路程差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 [F(1，10)=3.163，P=0.106]，見圖1B。

2.1.2記憶期 四組間小鼠靶象限游泳路程百分比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[F(3，20)=21.243，P<0.01]。組間比較顯示，與3月齡CON組比較，15月齡CON組的靶象限游泳路程百分比下降[F(1，10)=15.421，P=0.003]，見圖1D；與15月齡CON組比較，15月齡LPS組的靶象限游泳路程百分比下降[F(1，10)=5.909，P=0.035]；而3月齡LPS組與CON組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[F(1，10)=2.858，P=0.122]。

圖1 各組小鼠學(xué)習(xí)期游泳路程和記憶期靶象限游泳路程百分比比較A、B、C：各組學(xué)習(xí)期游泳路程；D：記憶期靶象限游泳路程百分比；與3月齡CON組比較：**P<0.01；與15月齡CON組比較：#P<0.05，##P<0.01

2.2 海馬SNAP-25蛋白水平免疫組織化學(xué)和Western blot結(jié)果顯示SNAP-25蛋白在海馬DG、CA1、CA3區(qū)均表達(dá)(圖2)，且四組間海馬SNAP-25總體水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[F(3，20)=170.100，P<0.01] ，見圖3。兩兩比較顯示，15月齡CON組比3月齡CON組的海馬SNAP-25總體水平升高[F(1，10)=12.861，P=0.005]，見圖3B，且在海馬CA1、DG、CA3區(qū)均增加[F(1,10)=82.916、53.368、14.110，P<0.01]，見圖3C；3月齡LPS組較同齡CON組海馬SNAP-25總含量增加[F(1，10)=120.532，P<0.01]，區(qū)域差異表現(xiàn)為DG區(qū)和CA1區(qū)升高[F(1,10)=62.846、389.145，P<0.01]，而CA3區(qū)降低[F(1,10)=146.263，P<0.01]；15月齡LPS組海馬SNAP-25蛋白水平也高于同齡CON組[F(1，10)=613.344，P<0.01]，具體也是海馬DG和CA1區(qū)增加[F(1,10)=174.102、411.898，P<0.01]，而在CA3區(qū)呈臨界意義下降[F(1,10)=4.959，P=0.050]。

圖2 各組小鼠SNAP-25蛋白在海馬各亞區(qū)中的表達(dá) A:3月齡CON組；B：3月齡LPS組；C：15月齡CON組；D：15月齡LPS組；1：海馬區(qū) ×4；2：DG區(qū) ×20；3：CA1區(qū) ×20；4：CA3區(qū) ×20

圖3 各組小鼠海馬SNAP-25蛋白水平比較A：各組免疫印跡條帶圖； B：各組SNAP-25蛋白總體水平的比較；C：各組海馬亞區(qū)的SNAP-25蛋白水平的比較；a：3月齡CON組；b：3月齡LPS組；c：15月齡CON組；d：15月齡LPS組；與3月齡CON組比較：**P<0.01；與15月齡CON組比較：##P<0.01

2.3 海馬SNAP-25水平與空間學(xué)習(xí)記憶能力的相關(guān)性Pearson相關(guān)分析結(jié)果顯示，15月齡LPS組和CON組小鼠海馬SNAP-25總體水平與學(xué)習(xí)期游泳路程呈正相關(guān)(r=0.949，P=0.004；r=0.917，P=0.010)，與記憶期靶象限游泳路程百分比呈負(fù)相關(guān)(r=- 0.901，P=0.014;r=- 0. 929，P=0.007)；具體到海馬亞區(qū)則是CON組和LPS組的海馬CA1(r=0.867，P=0.025；r=0.877，P=0.022)和DG(r=0.817，P=0.047；r=0. 947，P=0.004)區(qū)SNAP-25水平與學(xué)習(xí)期游泳路程呈正相關(guān)，與記憶期靶象限游泳路程百分比呈負(fù)相關(guān)(CA1：r=- 0.817，P=0.047；r=- 0.894，P=0.016；DG:r=- 0. 939，P=0.005；r=- 0. 843，P=0.035)。3月齡各組海馬總體和各亞區(qū)及15月齡各組CA3區(qū)SNAP-25水平與學(xué)習(xí)期游泳路程和記憶期靶象限游泳路程百分比均無相關(guān)性(P>0.05)，見表1。

表1 海馬各亞區(qū)SNAP-25相對含量與Morris水迷宮成績的相關(guān)性[r 值(P值)]

3 討論

目前年齡相關(guān)的記憶減退對老齡人口的健康威脅日益加劇，為了提高老年人的生活質(zhì)量，需要對衰老相關(guān)認(rèn)知障礙機(jī)制進(jìn)行深入研究。海馬結(jié)構(gòu)和功能的完整性在維持正常的學(xué)習(xí)和記憶鞏固中發(fā)揮了重要作用[7]。眾所周知，母親孕期感染炎癥是子代生命早期最常見的不良因素。以往研究[6]表明，母鼠孕晚期暴露于LPS會加劇子代海馬依賴的年齡相關(guān)的記憶減退。本研究進(jìn)一步支持了小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力呈年齡相關(guān)性損害的結(jié)論，即中老年小鼠的空間性學(xué)習(xí)記憶能力減退(表現(xiàn)為中老年小鼠在MWM中的表現(xiàn)較青年組差)，而母體孕晚期炎癥可惡化子代的這種效應(yīng)(表現(xiàn)為中老年LPS組行為學(xué)表現(xiàn)較同齡對照組差)。

本課題組前期證實(shí)母鼠孕期經(jīng)腹腔注射低劑量LPS(50 μg/kg)不會造成不良妊娠結(jié)局，且子鼠可經(jīng)歷正常的生長發(fā)育，但在衰老過程中會提前出現(xiàn)空間學(xué)習(xí)記憶能力減退[8]。其機(jī)制可能是母體中的促炎因子通過胎盤屏障，直接影響胎兒大腦或損害胎盤功能，進(jìn)而導(dǎo)致后代行為和中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)(包括突觸可塑性)及功能產(chǎn)生持久的或程序化變化[9]。突觸可塑性是學(xué)習(xí)和記憶形成的基本機(jī)制，而突觸相關(guān)蛋白水平的變化會導(dǎo)致突觸結(jié)構(gòu)發(fā)生微觀改變和神經(jīng)遞質(zhì)傳遞障礙。SNAP-25作為突觸相關(guān)蛋白，對神經(jīng)遞質(zhì)釋放及突觸可塑性的調(diào)節(jié)起重要作用[10]。然而，胚胎期炎癥暴露是否會導(dǎo)致中老年海馬SNAP-25蛋白水平的改變尚未可知。研究顯示SNAP-25在衰老的嚙齒類海馬的表達(dá)水平并不一致，比如在Fischer雌性老年(30月齡)大鼠中發(fā)現(xiàn)海馬SNAP-25蛋白質(zhì)水平升高[11]，而在老年(18～24月齡)Wistar雄性大鼠中海馬SNAP-25蛋白水平降低[12]。本課題組前期研究顯示，老年(22月齡)昆明小鼠海馬和額葉的SNAP-25蛋白含量是增加的[13]。本研究結(jié)果與之一致，即中老年CD-1小鼠海馬總體及各區(qū)的SNAP-25蛋白水平較青年期升高。

本研究首次觀察了胚胎期炎癥暴露對中老年海馬SNAP-25蛋白的影響，發(fā)現(xiàn)與中老年對照組相比，同齡LPS組的海馬總SNAP-25蛋白含量升高，貢獻(xiàn)主要來自DG和CA1區(qū)。這表明胚胎期炎癥暴露會上調(diào)中老年海馬DG和CA1區(qū)SNAP-25蛋白的表達(dá)。青年LPS組小鼠的海馬DG和CA1區(qū)SNAP-25蛋白水平也高于青年對照組。提示胚胎期炎癥暴露的小鼠可能在青年期就已經(jīng)出現(xiàn)學(xué)習(xí)記憶功能損害的神經(jīng)生物學(xué)基礎(chǔ)，盡管行為學(xué)表型尚未發(fā)生改變。值得注意的是，兩個年齡的LPS組海馬CA3區(qū)SNAP-25蛋白表達(dá)有下降。這也許表明胚胎期炎癥暴露的小鼠SNAP-25基因的表達(dá)可能存在海馬區(qū)域特異性。

研究[1,14]表明，海馬的一些突觸可塑性相關(guān)蛋白(如Syt1、PSD-95和GluA1)的改變均與年齡相關(guān)的認(rèn)知損害有關(guān)。突觸相關(guān)蛋白SNAP-25參與調(diào)控突觸前和突觸后機(jī)制[15]，可能是研究年齡相關(guān)的記憶減退的良好指標(biāo)。McKee et al[4]的研究發(fā)現(xiàn)過表達(dá)海馬SNAP-25會導(dǎo)致成年大鼠認(rèn)知功能的損害。本課題組前期研究[13]也提示昆明小鼠和ICR小鼠年齡相關(guān)性記憶損害與海馬SNAP-25含量升高有關(guān)。然而，海馬SNAP-25蛋白的改變是否參與胚胎期炎癥暴露導(dǎo)致的認(rèn)知損害仍不清楚。本研究表明，中老年對照組和LPS組小鼠海馬CA1區(qū)及DG區(qū)SNAP-25蛋白水平均與空間學(xué)習(xí)損害呈正相關(guān)，而與記憶損害呈負(fù)相關(guān)。這些發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步提示了海馬CA1和DG區(qū)SNAP-25蛋白可能參與衰老或胚胎期炎癥暴露導(dǎo)致的年齡相關(guān)記憶損害的機(jī)制。然而，所有年齡組的小鼠海馬CA3區(qū)SNAP-25蛋白水平與空間學(xué)習(xí)記憶損害無相關(guān)性，說明CA3區(qū)SNAP-25的降低未參與胚胎期炎癥暴露加速年齡相關(guān)性記憶損害效應(yīng)。

綜上所述，中老年海馬DG和CA1區(qū)的SNAP-25蛋白上調(diào)可能參與了胚胎期炎癥暴露加速的年齡相關(guān)性認(rèn)知功能損害。但是，未檢測胚胎期炎癥暴露導(dǎo)致的認(rèn)知損害與SNAP-25蛋白之間關(guān)聯(lián)的具體機(jī)制為本研究的主要缺陷。