王晨璽，鄧 霞，趙志聰，蔡珍生，張盼盼，李 蓮，李昊翔，趙 麗，王 東，楊 玲，袁國躍

PTG隸屬于蛋白質磷酸酶1(protein phosphatase 1,PP1)家族，編碼調節(jié)亞單位3C。PP1全酶由一個催化亞基和一個調節(jié)亞基組成[1]，通過催化已經磷酸化的蛋白質分子去磷酸化而發(fā)揮作用[2]。GenBank顯示，PTG在人類和小鼠中分別定位于10號及19號染色體，cDNA全長1 499 bp，編碼285個氨基酸殘基。PTG在小鼠多種組織器官中均有表達，參與宮頸癌、腎細胞癌和前列腺癌[3-5]等腫瘤的發(fā)生與發(fā)展，并能夠在肝細胞中顯著增加糖原的合成與儲存[6]，參與全身能量代謝調控[7]。Lu et al[8]研究發(fā)現，PTG沉默可降低空腹血糖和胰島素水平，改善胰島素敏感性，在糖原和脂質能量平衡中起橋梁作用。該研究旨在構建并鑒定小鼠 PTG基因重組過表達腺病毒載體，為深入研究PTG的功能及其在糖脂代謝中作用的具體機制提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細胞及菌株 本實驗所用的HEK293T細胞系由上海交通大學附屬瑞金醫(yī)院內分泌科實驗室同仁惠贈。

1.1.2工具酶及主要試劑 本課題組從上海吉凱基因化學技術有限公司購入質粒載體pDC315、GV314 載體體系、pCDNA3.1及BamHⅠ/AgeⅠ內切酶。本實驗中所用到的其他限制性內切酶從NEB公司購買；1 kp DNA標準參照物從Fermentas公司購買；250 bp DNA標準參照物從捷瑞公司購買；In-FusionTMPCR克隆試劑盒由Clontech公司提供；Taq聚合酶由Sino Bio公司提供；dNTP購自TaKaRa公司。本實驗中所用的質粒抽提試劑盒由Promega公司提供，上海捷瑞生物工程公司合成及提供本實驗所用全部引物。質粒的測序工作由美季生物技術公司完成，瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒由北京天根生化公司提供。TRIzol 購自美國Invitrogen公司，逆轉錄試劑盒以及熒光定量試劑盒購自諾唯贊公司。RIPA、蛋白酶抑制劑以及BCA蛋白定量試劑盒購自碧云天公司。DMEM及谷氨酰胺購自Gibco公司，胎牛血清及含有Flag標簽的一抗購自Sigma公司，二抗購自Santa Cruz公司。

1.2 方法

1.2.1含有小鼠PTG基因質粒的構建 首先，從293T細胞中提取總RNA，按照反轉錄試劑盒說明書對總RNA進行反轉錄反應，得到cDNA。根據基因庫中公布的小鼠PTG基因(NM_016854)全長的mRNA序列，運用Primer premier 5.0 軟件設計PTG克隆引物，交由生工生物工程有限公司合成，將該引物含有的目的基因5′ 端部分序列用于PCR釣取目的基因，上游序列：5′-AGGTCGACTCTAGAGGATCCCGCCACCATGAGCTGCACCAGAATG-3′；下游序列：5′-TCCTTGTAGTCCATACCTCGATAGGAGGTCA AGTTC-3′。進行PCR擴增后得到目的基因片段，BamH Ⅰ/Age Ⅰ 酶切后，將其連接至質粒載體p CDNA3.1(-)。反應條件：5 μl 10×緩沖液，0.5 μl 100×BSA，2 μl純化的DNA質粒(濃度為1 g/L)，1 μl BamH Ⅰ(濃度為20 U/μl)，1 μl AgeⅠ(濃度為20 U/μl)，最后加雙蒸水40.5 μl將總體系補足至50 μl。此后將按以上步驟混合得到的反應物放置于37 ℃環(huán)境中，時間為2 h。

1.2.2重組穿梭質粒pGV314-PTG的構建 將酶切后的產物交換入線性化表達載體GV314中得到重組穿梭質粒pGV314-PTG。BamH Ⅰ/Age Ⅰ 酶切載體GV314進行線性化，之后將酶切得到的產物與目的基因產物片段進行交換，反應體系如下：2 μl線性化載體DNA(濃度為100 mg/L)，2 μl目的基因產物(濃度為100 mg/L)，0.5 μl In-Fusion交換酶，2 μl 10×交換酶緩沖液，13.5 μl雙蒸水。于25 ℃條件下反應30 min，42 ℃條件下反應15 min。轉化細菌感受態(tài)細胞DH5α，隨后將其轉移到含有相應抗生素的LB瓊脂平板上倒置培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為 37 ℃，計時16 h。對長出的菌落用PCR法進行鑒定，將空載設置為陰性對照組，將純化的GAPDH基因的PCR產物設置為陽性對照組。GV314載體PCR引物序列如下，上游序列為5′-AGCTTTGAGAAGAAGGTTCAGG-3′，下游序列為5′- CCTTATAGTCCTTATCATCGTC-3′。反應體系：1 μl模板，上游和下游引物(濃度為10 μmol/L)各0.4 μl，4 μl 5×Taq緩沖液，1.6 μl d NTPs(濃度為2.5 mmol/L)，0.2 μl Taq聚合酶，12.4 μl雙蒸水。反應條件：在94 ℃條件下預變性3 min，94 ℃條件下變性30 s，60 ℃條件下退火30 s，72 ℃條件下延長40 s，再次穩(wěn)定延伸5 min，將此過程循環(huán)30次。隨后將PCR后得到的產物進行瓊脂糖凝膠電泳， PCR產物約為481 bp，之后進行陽性菌接種，放置于37 ℃的環(huán)境中培養(yǎng)16 h。隨后利用甘油菌對其進行保存，并分裝200 μl以待進行后續(xù)的測序和比對分析。

1.2.3腺病毒質粒同源重組及鑒定 用含有EDTA的0.25%胰酶消化處于對數生長期的HEK293T細胞，以得到細胞懸液，接種于24孔培養(yǎng)板中，細胞數為4×105個/孔。置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。待細胞的融合度達到50%～60%時，利用LipofectamineTM2000轉染試劑將pGV314-PTG與輔助包裝質粒pDC315共轉染至HEK293T細胞中。在轉染之前的2 h換液，將原先的舊培養(yǎng)基更換為不含血清的培養(yǎng)基，細胞換液2 h后開始轉染。將DNA 溶液與不含血清的培養(yǎng)基混合均勻，二者混合液總體積為50 μl，其中DNA溶液包含5 μg穿梭質粒及5 μg輔助質粒，混合后置于室溫條件下溫育5 min。將上述混合后的50 μl培養(yǎng)基與10 μl LipofectamineTM2000混合，再次置于室溫條件下溫育5 min。將前述稀釋后得到的DNA溶液與LipofectamineTM2000混合均勻，注意動作輕柔，避免振蕩，隨后放置于室溫條件下溫育20 min，以便形成DNA/Lipofectamine 2000TM轉染復合物。在HEK293T細胞培養(yǎng)液中緩慢滴加前述轉染復合物并將其混合均勻，隨后放置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2。于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)6 h后將含有轉染混和物的原有舊培養(yǎng)基棄去，向其中加入PBS溶液2 ml，輕柔晃動，洗去殘余的轉染混合物后將溶液倒棄，再向其中緩慢加入5 ml含有10%血清的細胞培養(yǎng)基，放置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2，注意每天定期觀察轉染后細胞的生長狀況，如果發(fā)現有培養(yǎng)基明顯發(fā)黃的情況，需酌情向其中補加適量的新鮮培養(yǎng)液。最后，利用Cre/Lox P重組酶系統(tǒng)的作用以產生重組過表達腺病毒，并將該重組過表達腺病毒命名為Ad-PTG。成功轉染之后24 h可通過熒光顯微鏡觀察到細胞內增強型綠色熒光蛋白(EGFP)的表達情況，轉染之后36 h收集細胞并用相應試劑提取總蛋白，以待后續(xù)進行Western blot檢測。

1.2.4重組過表達腺病毒的包裝、擴增與純化 用PacⅠ 酶切線性化Ad-PTG質粒，并進行抽提以及乙醇沉淀回收等步驟后測定其含量與純度，將其轉染至HEK293T細胞中，放置于細胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2，此后每日觀察轉染后細胞的狀態(tài)及生長情況。持續(xù)觀察約10～15 d，待大部分細胞出現腫脹、變圓、壞死等典型的細胞病變效應(cytopathic effect，CPE)，且有約50%的細胞脫壁現象出現時，提示腺病毒包裝成功。用低速離心方法收集細胞，吸取2 ml的 DMEM并將收集的細胞重懸于其中，在液氮和37 ℃水浴的條件下將此前制成的細胞懸液反復凍融4次后，于4 ℃以7 900 r/min低溫離心5 min，離心后產物有明顯的分層，收集離心后的病毒上清液，將其放置于-80 ℃冰箱中保存。用上述方法反復感染和收集之后，取病毒上清液再一次感染HEK293T細胞，從而可以實現數輪擴增的目的。

用Adeno-XTM病毒純化試劑盒按照步驟將最終收集到的PBS重懸病毒上清液純化重組過表達腺病毒，分裝已純化的重組過表達腺病毒，放置于 -70 ℃ 冰箱中保存以備后續(xù)使用。

1.2.5終點稀釋法測定腺病毒滴度 對已獲得的純化重組過表達腺病毒進行滴度測定，具體采用的方法為終點稀釋法，在實驗開始前24 h于96孔板中接種HEK293T細胞(細胞數每孔約1×103個)。倍比稀釋重組過表達腺病毒液至10-6～10-13，并用其感染HEK293T細胞，隨后將細胞放入培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。培養(yǎng)期間持續(xù)觀察細胞CPE病變的情況，并對細胞CPE病變孔進行計數，計算出每一行的陽性率。用Spearman-Karber Method計算所測樣本的病毒顆粒滴度，公式如下：病毒樣品的滴度=10(x+0.8) (PFU/ml)，其中x為10-1～10-13中所有稀釋度下細胞CPE病變陽性率的總和。

1.2.6熒光定量PCR 將成功構建的Ad-PTG轉染HEK293T細胞48 h后，收集細胞，并使用TRIzol試劑提取細胞總RNA, 后使用逆轉錄試劑盒對RNA進行逆轉錄反應得到相應cDNA并進行熒光定量PCR實驗。用GraphPad 8.0.1分析結果。

1.2.7Western blot實驗 將成功構建的Ad-PTG轉染HEK293T細胞48 h后收集細胞，提取蛋白并測定其濃度。配制10%分離膠和5%濃縮膠，將之前所提取的蛋白樣品及蛋白標準參照物按照實驗設計的順序依次在相應泳道上樣。首先設定電壓為90 V，20～25 min待樣品跑至下層膠后，調整電壓至120 V，繼續(xù)恒定電壓電泳1 h左右待樣品跑至底部。將PVDF膜置于甲醇中激活約1 min，隨后把PVDF膜、濾紙和電泳后的凝膠按照裝配要求組裝成三明治結構，固定放置于轉膜裝置內，并于4 ℃恒定電流120 mA轉膜4 h。轉膜后的PVDF膜完全浸沒于5%脫脂奶粉封閉液中，在搖床上于室溫條件下低速封閉1 h。封閉結束后裁剪至合適大小，浸沒于一抗(1 ∶1 000)稀釋液中，于4 ℃環(huán)境中搖床低速孵育過夜。一抗孵育結束后用1×TBST緩沖液洗滌，將PVDF膜浸沒于二抗(1 ∶5 000)稀釋液中搖床室溫下孵育1 h。1×TBST緩沖液中洗滌后用ECL發(fā)光液曝光以待后續(xù)分析。

1.3 統(tǒng)計學處理采用SPSS 25.0及GraphPad 8.0.1統(tǒng)計分析軟件對實驗數據進行單因素方差分析，兩組間比較采用t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 PCR擴增PTG目的片段酶切連接目的基因的p CDNA3.1質粒，PCR擴增并進行瓊脂糖凝膠電泳(圖1)，結果顯示：在995 bp附近處有亮帶，與目的基因片段長度一致，表明帶有PTG基因的p CDNA3.1 質粒構建成功。

圖1 PTG目的片段電泳圖1：DNA標準參照物；2：PCR產物

2.2 重組穿梭質粒p GV314-PTG的PCR鑒定運用In-Fusion克隆技術得到p GV314-PTG的重組穿梭質粒，采用隨機的方法從中挑選出8個陽性單克隆菌，并用菌斑PCR技術對其進行鑒定及驗證(圖2)。

圖2 PCR鑒定p GV 314-PTG重組穿梭質粒8個陽性克隆1：陰性對照(雙蒸水)；2：陰性對照(空載自連對照組)；3：GAPDH；4：DNA標準參照物；5～12：1～8號轉化子

2.3 重組質粒Ad-PTG的測序鑒定將鑒定出的陽性克隆轉化子接種于LB液體培養(yǎng)基中，放于37 ℃培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)12～16 h，取適量菌液送至上海生工生物工程有限公司，由其進行測序鑒定，經比對后證實與GenBank上的目標序列完全一致(圖3)。

圖3 部分重組穿梭質粒序列對比結果

2.4 重組質粒Ad-PTG的蛋白表達將p GV314-PTG與質粒p DC315轉染HEK293T細胞，轉染24 h后出現EGFP表達(圖4)，轉染36 h后用Western blot法檢測到在37 ku處有特征性條帶(圖5)。其大小與目的蛋白大小一致，說明重組蛋白融合表達正確。

圖5 蛋白質印跡鑒定重組質粒Ad-PTG轉染HEK293T細胞PTG的表達1：陽性對照組；2：SURVIVIN-3FLAG-GFP蛋白表達組；3：Ad-PTG轉染組

2.5 重組獲得過表達腺病毒Ad-PTG及滴度測定重組過表達腺病毒質粒轉染HEK293T細胞10～15 d時，細胞部分出現CPE細胞病態(tài)反應，細胞病變范圍漸漸增大，部分細胞逐漸從培養(yǎng)皿上脫落，提示已經成功包裝重組過表達腺病毒。反復感染，收集細胞并凍融數次后，收集到大量的病毒上清液，純化重組過表達腺病毒，經終點稀釋法計算得到病毒滴度值為4×1010PFU / ml。

2.6 重組過表達腺病毒上調肝細胞中PTG的表達將成功構建的Ad-PTG轉染HEK293T細胞48 h后，收集細胞，熒光定量PCR和Western blot結果顯示，與正常對照組相比，Ad-PTG組PTG的mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.05)(圖6)。

圖6 PTG重組過表達腺病毒的驗證與Ad-GFP組比較：****P<0.000 1

3 討論

糖尿病是一種由多種原因引起的慢性高血糖為特征的代謝性疾病，其中90%為2型糖尿病。迄今為止，2型糖尿病已經發(fā)展成為以高血糖為主要特征的全球性公共衛(wèi)生問題。肝臟胰島素抵抗是2型糖尿病發(fā)病機制的主要環(huán)節(jié)[9]，胰島素抵抗是指細胞不能有效利用胰島素，即施以正常劑量的胰島素之后僅能產生低于正常生物學效應的一種異常生理狀態(tài)，包括胰島素的靶器官對胰島素的敏感性和(或)反應性下降。胰島素抵抗最明顯的病理生理特點包括糖原分解功能、糖異生以及脂代謝環(huán)節(jié)發(fā)生紊亂，進而導致肝糖輸出增多和肝臟脂肪的積聚。因此，有效地抑制肝臟葡萄糖的產生與輸出以及減少肝臟脂肪的積聚，是治療胰島素抵抗與2型糖尿病的重要靶標之一，深入探求肝臟糖代謝與脂代謝調控的分子機制已成為當前的研究熱點。

在本課題組前期進行的芯片篩選中，PTG引起了本課題組的注意。眾所周知，蛋白質磷酸化在調節(jié)肝臟糖異生中起著關鍵作用。PP1是在真核細胞中豐富表達的一種磷酸酶，其可通過催化已經磷酸化的蛋白質分子發(fā)生去磷酸化而發(fā)揮作用[2]。在調節(jié)糖原代謝中，催化亞基PP1C通過一組糖原靶向調節(jié)亞基(G亞基)錨定于糖原顆粒，通過PP1介導的去磷酸化調節(jié)糖原代謝酶的活性[1, 10-11]。根據GenBank數據庫數據顯示，有7個編碼G亞基的基因，PTG基因是其中的一種，編碼蛋白磷酸酶1調節(jié)亞單位3C，其在糖代謝與脂代謝中發(fā)揮重要的調控作用[4]。PTG不僅可將PP1定位于糖原顆粒，還可直接與糖原合酶和磷酸化酶結合，從而實現糖原代謝的有效調控[12]。進一步研究還發(fā)現，PTG基因雜合缺失的小鼠，這些小鼠的脂肪組織、肝臟、心臟和骨骼肌中的糖原儲存減少，相應的糖原合酶活性以及糖原合成率降低[7]。此外，PTG沉默小鼠可以防止高脂誘導的肝糖原積聚，降低空腹血糖和胰島素水平，從而改善胰島素敏感性；而哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1(mTORC1)及膽固醇調節(jié)元件結合蛋白1(SREBP1)可作用于PTG啟動子，調節(jié)PTG的轉錄影響糖原的代謝，而糖原的積聚可通過反饋調節(jié)SREBP1，從而影響脂肪代謝，建立了肝臟糖代謝與脂代謝之間的相互對話，調節(jié)了能量的平衡。以上研究結果表明，PTG在糖代謝與脂代謝中起著關鍵作用，并且對于維持糖原和脂質之間燃料底物分配的代謝平衡是必要的[8]。

為了深入地探索PTG的功能及其參與糖代謝與脂代謝中具體的作用機制，本課題組成功構建出PTG的重組過表達腺病毒載體。采用能夠表達較大的外源基因片段的腺病毒穿梭載體GV314，該載體具有廣泛的宿主范圍，分裂以及非分裂細胞均可被其感染。且該載體還具有病毒滴度高和方便濃縮儲存等優(yōu)點，同時還具有較高的安全性，是將外源性基因導入宿主細胞時所采用的重要載體之一。本研究將攜帶腺病毒基因組與外源基因的腺病毒穿梭質粒的包裝質粒共轉染至HEK293T細胞，通過Cre/lox P重組酶系統(tǒng)得到重組過表達腺病毒，并進一步通過Western blot、熒光定量PCR以及測序等方法驗證，表明PTG重組過表達腺病毒構建成功。